Name: synthesis of decellularized cartilage extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2023-07-21T14:10:00
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यह काम झेजियांग प्रांत की चिकित्सा और स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी योजना (2019KY050), झेजियांग प्रांत की पारंपरिक चीनी चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (2019ZA026), झेजियांग प्रांत में प्रमुख अनुसंधान और विकास योजना (अनुदान संख्या 2020C03043), झेजियांग प्रांत की पारंपरिक चीनी चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (2021ZQ021), और झेजियांग प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (LQ22H060007) द्वारा प्रायोजित किया गया था।

इस अध्ययन को झेजियांग प्रांत के टोंगडे अस्पताल की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की तैयारी
नोट: इस अध्ययन में, हड्डी के ऊतकों के संग्रह से बच?...

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	<li>Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+hydrogels+for+cartilage+tissue+engineering.">Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering.</a> European Cells &amp; Materials. 33, 59-75 (2017).</li><li>Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+hydrogels+for+osteochondral+and+cartilage+tissue+engineering.">Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).</li><li>Bejleri, D., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix+materials+for+cardiac+repair+and+regeneration.">Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217 (2019).</li><li>Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix:+New+promising+and+challenging+biomaterials+for+regenerative+medicine.">Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine.</a> Biomaterials. 289, 121786 (2022).</li><li>Barbulescu, G. 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T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. 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L., Holle, A. W., Spatz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.Nanoscale+and+mechanical+properties+of+the+physiological+cell-ECM+microenvironment.">P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).</li><li>Abdolghafoorian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heart+valve+decellularization+on+xenograft+rejection.">Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल विकोशिकीय उपास्थि बाह्य मैट्रिक्स हाइड्रोगेल की तैयारी के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करता है जो उपास्थि ऊतक के मूल ईसीएम की बारीकी से नकल करता है। प्रोटोकॉल में ईसीएम की संरचना औ...

उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग एक तेजी से विकासशील क्षेत्र है जो क्षतिग्रस्त या रोगग्रस्त उपास्थि ऊतक1 को पुनर्जीवित करना चाहता है। इस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण चुनौती बायोमिमेटिक स्काफोल्ड्स का विकास है जो चोंड्रोसाइट्स के विकास और भेदभाव का समर्थन कर सकता है, उपास्थि2 के उत्पादन के लिए जिम्मेदार कोशिकाएं। उपास्थि ऊतक का ईसीएम चोंड्रोसाइट्स के व्यवहार को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। डीसी-ईसीएम ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक प्रभावी मचानहै।
उपास्थि ऊतक से डीसी-ईसीएम का उत्पादन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है, जिसमें रासायनिक, एंजाइमेटिक और भौतिक तरीके शामिल हैं। हालांकि, इन विधियों के परिणामस्वरूप अक्सर ईसीएम हाइड्रोगेल की पीढ़ी होती है जो अपर्याप्त रूप से बायोमिमेटिक होते हैं, जो ऊतकइंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 4,5 में उपयोग के लिए उनकी क्षमता को सीमित करता है। इस प्रकार, डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल के उत्पादन के लिए अधिक प्रभावी विधि की आवश्यकता है।
इस तकनीक का विकास महत्वपूर्ण है क्योंकि यह बायोमिमेटिक स्काफोल्ड्स बनाने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करके ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र को आगे बढ़ा सकता है जो ऊतक पुनर्जनन और मरम्मत का समर्थन कर सकता है। इसके अलावा, इस तकनीक को आसानी से अन्य ऊतकों से ईसीएम हाइड्रोगेल का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे इसके संभावित अनुप्रयोगों का विस्तार होता है।
साहित्य के व्यापक निकाय में, ऊतकइंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक मचान के रूप में डीसी-ईसीएम का उपयोग करने में रुचि बढ़ रही है। कई अध्ययनों ने उपास्थि 7,8 सहित विभिन्न ऊतकों में सेल विकास और भेदभाव को बढ़ावा देने में डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है। इसलिए, डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का विकास जो उपास्थि ऊतक के प्राकृतिक ईसीएम की बारीकी से नकल करता है, क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण योगदान है।
इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल के उत्पादन के लिए एक नई विधि प्रदान करके इस आवश्यकता को संबोधित करता है जो उपास्थि ऊतक के प्राकृतिक ईसीएम की बारीकी से नकल करता है। प्रोटोकॉल में उपास्थि ऊतक को विघटित करना, परिणामस्वरूप ईसीएम को अलग करना और ईसीएम को जैव-संगत बहुलक के साथ क्रॉस-लिंक करके एक हाइड्रोगेल बनाना शामिल है। परिणामी हाइड्रोगेल ने चोंड्रोसाइट्स के विकास और भेदभाव का समर्थन करने में आशाजनक परिणाम दिखाए हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH7.6</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST776-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH8.0</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST780-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F440340034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>D128600-80KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNEasy Blood &#38;Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>No. 69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAG colorimetric quantitative detection kit</td>
			<td>Shanghai Haling</td>
			<td>HL19236.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCP-2 dryer&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop8000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>R341325-100 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma500</td>
			<td>ZIESS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra S</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sieve</td>
			<td>SHXB-Z-1</td>
			<td>Shanghai Xinbu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0096-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15050065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet lamp</td>
			<td>Omnicure 2000</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R4500-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Shanghai Qiasen</td>
			<td>78HW-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of decellularized cartilage extracellular matrix hydrogels

डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (डीसी-ईसीएम) हाइड्रोगेल उनकी जैव-रासायनिकता और प्राकृतिक ऊतक गुणों की नकल करने की क्षमता के कारण ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए आशाजनक बायोमैटेरियल्स हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल का उत्पादन करना है जो उपास्थि ऊतक के मूल ईसीएम की बारीकी से नकल करता है। प्रोटोकॉल में ईसीएम की संरचना और संरचना को संरक्षित करते हुए सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए भौतिक और रासायनिक व्यवधान और एंजाइमेटिक पाचन का संयोजन शामिल है। डीसी-ईसीएम एक स्थिर और जैविक रूप से सक्रिय हाइड्रोगेल बनाने के लिए एक रासायनिक एजेंट का उपयोग करके क्रॉस-लिंक किया जाता है। डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल में उत्कृष्ट जैविक गतिविधि, स्थानिक संरचना और जैविक प्रेरण समारोह है, साथ ही साथ कम इम्युनोजेनेसिटी भी है। ये विशेषताएं सेल आसंजन, प्रसार, भेदभाव और प्रवासन को बढ़ावा देने और सेल विकास के लिए एक बेहतर माइक्रोएन्वायरमेंट बनाने के लिए फायदेमंद हैं। यह प्रोटोकॉल ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में शोधकर्ताओं और चिकित्सकों के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करता है। बायोमिमेटिक हाइड्रोगेल संभावित रूप से उपास्थि की मरम्मत और पुनर्जनन के लिए प्रभावी ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों के विकास को बढ़ा सकते हैं।

एक बेहतर डीसी-ईसीएम कार्टिलेज हाइड्रोगेल तैयार करने के लिए, हमने पिछले साहित्य का अध्ययन और समीक्षा की और डीसेल्युलराइजेशन अनुपात, इम्युनोजेनेसिटी और यांत्रिक कार्यक्षमता9 के संदर्भ में वि...

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Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

यह पेपर डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (डीसी-ईसीएम) हाइड्रोगेल के संश्लेषण के लिए एक नई विधि का परिचय देता है। डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल में उत्कृष्ट जैव-रासायनिकता है और सेल विकास के लिए एक बेहतर माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करता है। इसलिए, वे आदर्श सेल स्काफोल्ड्स और जैविक वितरण प्रणाली हो सकते हैं।

डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल का संश्लेषण

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

हमारा प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह हाइड्रोगेल में बीमारी के निर्माण को सक्षम बनाता है जो उपास्थि ऊतक की प्रकृति से निकटता से मिलता जुलता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ स्थानिक संरचना, कम इम्युनोजेनेसिटी और जैविक औद्योगिक कार्य में स्पष्ट जैविक गतिविधि के साथ हाइड्रोगेल में रोग का उत्पादन करने की क्षमता है। शुरू करने के लिए, स्केलपेल का उपयोग करके एकत्रित उपास्थि को आकार में एक से दो घन मिलीमीटर के टुकड़ों में काट लें।50 मिलीमीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 20 मिलीग्राम हाइपोटोनिक ट्रिस-हाइड्रोक्लोराइड बफर के 20 मिलीलीटर में कीमा कार्टिलेज को डुबोएं। ट्यूब को तीन घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और फिर ओवन में तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 1000 आरपीएम पर 30 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को भंवर करें।फिर 50-मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर रखी प्लास्टिक की छलनी का उपयोग करके डीसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज को फ़िल्टर करें। इसे इकट्ठा करने से पहले बाँझ पीबीएस के साथ उपास्थि को तीन बार धोएं। एकत्रित उपास्थि में 10 मिलीलीटर ट्रिप्सिन घोल जोड़ें और इसे 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर इनक्यूबेट करें, हर चार घंटे में ट्रिप्सिन को प्रतिस्थापित करें।निलंबन को छानने के बाद, ट्रिप्सिनाइज्ड कार्टिलेज को हाइपरटोनिक बफर से धो लें। एक बार उपास्थि संरक्षित हो जाने के बाद, 10 मिलीलीटर न्यूक्लियस घोल जोड़ें और इसे चार घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर रखें। बाँझ पीबीएस के साथ धोने के बाद, उपास्थि में हाइपरटोनिक ट्रिस-हाइड्रोक्लोराइड समाधान जोड़ें और इसे शेकर पर रखें जैसा कि दिखाया गया है।एक बार बाँझ पीबीएस के साथ धोने के बाद, ऊतक को 24 घंटे के लिए 1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान में डुबोएं। ट्राइटन एक्स -100 को हटाने के बाद, डिसेल्युलराइज्ड कार्टिलेज को तीन दिनों के लिए आसुत पानी से धोएं, हर 12 घंटे में पानी बदलें। तीन दिनों के बाद, उपास्थि में पेरासिटिक एसिड का घोल जोड़ें और इसे चार घंटे के लिए भिगो दें।एक बार पीबीएस के साथ धोने के बाद, प्लास्टिक की छलनी का उपयोग करके उपास्थि एकत्र करें जैसा कि पहले दिखाया गया था। तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके, डीसेल्यूलराइज्ड कार्टिलेज पाउडर तैयार करें। दो ग्राम कार्टिलेज पाउडर में 80 मिलीलीटर 0.5 मोलर एसिटिक एसिड और 20 मिलीग्राम पेप्सिन मिलाएं, और मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक पचाएं।पाचन के बाद, 10 मिनट के लिए 400 ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें, जिसे अब डीसी-ईसीएम समाधान कहा जाता है डीसी-ईसीएम समाधान के भंडारण के लिए, छह-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर घोल जोड़ें और इसे लियोफिलाइज़र में रखें। एक बार घोल फ्रीज सूख जाने के बाद, इसे सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। हाइड्रोजेल बनाने के लिए, 20 मिलीग्राम फ्रीज सूखे डीसी-ईसीएम घोल को एक मिलीलीटर बाँझ आसुत जल में घोलें।एक बार भंवर होने के बाद, डीसी-ईसीएम समाधान में विटामिन बी 2 का एक मिलीग्राम जोड़ें। इनक्यूबेशन बाद, इसे यूवी प्रकाश के साथ तीन मिनट के लिए विकिरणित करें। 20 मिलीग्राम डीसी-ईसीएम कार्टिलेज पाउडर में बफर जीटीएल और प्रोटीनके जोड़ें, और भंवर दोलन का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं।पूर्ण उपास्थि विघटन के लिए, मिश्रण को चार घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक बार भंवर में आने के बाद, 200 माइक्रोलीटर बफर जीटीएल जोड़ें और उसके बाद निर्जल इथेनॉल डालें। भंवर के बाद, नमूने को चार डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट के लिए 6000 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।फिर पांडुलिपि में वर्णित डीएनए को इकट्ठा और मात्रा निर्धारित करें। कोलेजन का विश्लेषण करने के लिए, 20 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोक्लोरिक एसिड में डीसी-ईसीएम पाउडर के पांच मिलीग्राम को अम्लीय करें। फिर इसे छह मोलर सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के पांच मिलीलीटर के साथ बेअसर करें।हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन मानक के खिलाफ 570 नैनोमीटर पर अवशोषण का उपयोग करके बेअसर नमूने की हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन सामग्री की गणना करें। मिश्रण के बाद डीसी-ईसीएम पाउडर के 200 मिलीग्राम में 500 माइक्रोलीटर अभिकर्मक ए जोड़ें। नमूने को 16 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।एक बार सेंट्रीफ्यूज होने के बाद, 50 माइक्रोलीटर नमूना घोल एकत्र करें और 50 माइक्रोलीटर अभिकर्मक बी जोड़ें, इसके बाद अभिकर्मक सी। 10 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करने के बाद, अभिकर्मक डी के 750 माइक्रोलीटर जोड़ें और अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, गोली में एक माइक्रोलीटर अभिकर्मक ई जोड़ें और सेंट्रीफ्यूजिंग से पहले अच्छी तरह मिलाएं। फिर जीएजी सामग्री माप से पहले नमूने को अलग करें।तैयार डीसी-ईसीएम उपास्थि में, डीएनए सामग्री को काफी समाप्त कर दिया गया था। हालांकि, देशी उपास्थि की तुलना में कोलेजन और जीएजी सामग्री को बरकरार रखा गया था। एसईएम और टीईएम विश्लेषण ने तैयार डीसी-ईसीएम की अल्ट्रा संरचना का प्रदर्शन किया।उल्टे ट्यूब में तैयार हाइड्रोगेल नीचे तक प्रवाहित नहीं हुआ, इस प्रकार गेलेशन का प्रदर्शन हुआ। इसके अलावा, डीसी-ईसीएम केवल समाधान की तुलना में, विटामिन बी 2 के अतिरिक्त डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल गठन के दौरान प्रेरित क्रॉसलिंकिंग के कारण गेलेशन समय कम हो गया। डीसी-ईसीएम हाइड्रोगेल चिपचिपाहट समाधान चिपचिपाहट से अधिक थी और कतरनी दरों में वृद्धि ने समाधान चिपचिपाहट को कम कर दिया।इसके अलावा, डीसी-ईसीएम समाधान और हाइड्रोगेल के उच्च भंडारण मापांक ने संकेत दिया कि उन दोनों में तरल गुणों के बजाय जेल था। एसईएम विश्लेषण से पता चला है कि डीसी-ईसीएम समाधान का छिद्र आकार क्रॉसलिंकिंग और फ्रीज सुखाने के बाद हाइड्रोगेल रूप में काफी कम हो गया था। प्रोटोकॉल में संरचना और ईसीएम की बातचीत को संरक्षित करते हुए सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए भौतिक और रासायनिक व्यवधान और एंजाइमेटिक पाचन का संयोजन शामिल है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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