Name: non-aqueous isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from cannabis sativa
Uploaded: 2023-05-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent le soutien financier de CannabiVar Ltd. Tout le matériel végétal a été généreusement fourni par le professeur Hinanit Koltai du Volcani Center, en Israël.

NOTE: Le matériel végétal utilisé dans cette étude consistait en quatre souches de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 et CS-14) qui ont été cultivées dans le Volcani Center, Israël, comme décrit ailleurs11. Les trichomes à tige de capitate glandulaire ont été isolés à partir d’inflorescences à fleurs matures, et les trichomes sessiles glandulaires capitates ont été isolés à partir de grandes feuilles en éventail de plantes mères matures non florifères. Tou...

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	<li>Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+plant+trichome+biochemistry+for+the+production+of+useful+compounds.">Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds.</a> Plant Journal for Cell &amp; Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).</li><li>Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-volatile+natural+products+in+plant+glandular+trichomes:+chemistry,+biological+activities+and+biosynthesis.">Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis.</a> Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).</li><li>Fairbairn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trichomes+and+glands+of+Cannabis+sativa+L.">The trichomes and glands of Cannabis sativa L.</a> UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).</li><li>Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terpene+synthases+from+Cannabis+sativa.">Terpene synthases from Cannabis sativa.</a> PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).</li><li>Yerger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+isolating+glandular+trichomes.">A rapid method for isolating glandular trichomes.</a> Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).</li><li>Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+histochemical+localization+of+monoterpene+biosynthesis+in+the+glandular+trichomes+of+spearmint+(Mentha+spicata).">Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata).</a> Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).</li><li>Gershenzon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+secretory+cells+from+plant+glandular+trichomes+and+their+use+in+biosynthetic+studies+of+monoterpenes+and+other+gland+products.">Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products.</a> Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).</li><li>Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Cannabis+sativa+glandular+trichome+proteome.">Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome.</a> PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).</li><li>Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+transcription+factors+involved+in+cannabinoid+biosynthesis+in+Cannabis+sativa+L.">Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L.</a> Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).</li><li>Slone, J. H., Kelsey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+glandular+secretory+cells+from+Artemisia+tridentata+(ssp.+vaseyana)+by+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation.</a> American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).</li><li>Namdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terpenoids+and+Phytocannabinoids+Co-Produced+in+Cannabis+Sativa+Strains+Show+Specific+Interaction+for+Cell+Cytotoxic+Activity.">Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity.</a> Molecules. 24 (17), 3031 (2019).</li><li>McDowell, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomic+analysis+of+Solanum+glandular+trichome+types.">Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types.</a> Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).</li><li>Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+as+a+signal+to+sort+developing+glandular+trichomes+by+flow+cytometry.">Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).</li><li>Livingston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabis+glandular+trichomes+alter+morphology+and+metabolite+content+during+flower+maturation.">Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation.</a> The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).</li><li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gland+distribution+and+cannabinoid+content+in+clones+of+Cannabis+sativa+L.">Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L.</a> American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).</li><li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+cannabinoids+in+individual+glandular+trichomes+of+Cannabis+sativa+L.+(Cannabaceae).">Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae).</a> American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).</li><li>Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glandular+hairs+of+Cannabis+sativa+from+scanning+electron+microscopy.">Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy.</a> American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).</li><li>Marks, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+isolating+large+quantities+of+Arabidopsis+trichomes+for+transcriptome,+cell+wall,+and+other+types+of+analyses.">A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses.</a> The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).</li><li>Huebbers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+method+for+the+release,+enrichment+and+purification+of+high-quality+Arabidopsis+thaliana+rosette+leaf+trichomes+enables+profound+insights+into+the+trichome+proteome.">An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome.</a> Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).</li></ol>

Par rapport aux protocoles d’isolement des trichomes actuellement disponibles, deux modifications principales sont décrites dans le présent protocole. Il s’agit notamment du détachement des trichomes du matériel végétal à l’aide de glace sèche à l’étape initiale et de la substitution du LN au milieu tampon liquide couramment utilisé. La première modification pour la purification des trichomes de C. sativa est basée sur un protocole antérieur qui a introduit l’utilisation de glace sèche p...

Les trichomes glandulaires sont des structures ressemblant à des cheveux présentes dans les plantes qui contiennent de nombreux métabolites secondaires1 et représentent une banque précieuse de nouveaux gènes et enzymes biosynthétiques2. Dans le cannabis, la biosynthèse des métabolites secondaires importants, cannabinoïdes3 et terpènes4, est localisée dans les trichomes. Compte tenu du rôle des trichomes dans la détermination de la qualité du cannabis à des fins médicinales et récréatives, l’étude de l’expression des gènes des trichomes est intéressante. Pour caractériser l’expression des gènes spécifiques aux trichomes, les trichomes d’intérêt doivent d’abord être isolés. Les protocoles d’isolement des trichomes ont été décrits pour la première fois dès 19925, et leurs derniers développements ont été récemment examinés2. En général, les protocoles d’extraction des trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique peuvent être divisés en deux étapes séquentielles distinctes. La première étape implique une séparation physique complète des trichomes du tissu végétal. Cette étape peut être réalisée en utilisant de la glace sèche5, des billes de verre avec un appareil commercial6,7, en broyant le matériel végétal contre un tamis à mailles8, ou en tourbillonnant le tissu végétal dans un tampon d’isolement9. La deuxième étape consiste à séparer plus finement les trichomes d’intérêt des résidus de plantes microscopiques et/ou d’autres types de trichomes. Cette étape peut être exécutée en utilisant la centrifugation à gradient de densité 8,10 ou des tamis de différentes tailles 7,9. En raison de l’extrême sensibilité de l’ARN dans les tissus traités aux agents dégradants, ces deux étapes séquentielles sont généralement conduites dans le milieu d’isolement glacé, souvent en présence d’inhibiteurs de protéines4.
Les protocoles conventionnels d’isolement des trichomes nécessitent, en plus des températures glaciales, de grandes quantités de milieu d’isolement pour assurer une procédure d’extraction efficace. La combinaison de ces composants entraîne un processus d’isolation long et fastidieux qui entrave un débit élevé. La présentation d’un protocole alternatif simple et convivial d’isolement des trichomes est donc susceptible d’être bénéfique pour divers aspects associés à la caractérisation des trichomes. Le présent article vise à offrir un protocole alternatif pour isoler les trichomes de tête glandulaires pédonculés et sessiles de Cannabis sativa en combinant et en intégrant plusieurs éléments des protocoles conventionnels. Ces éléments comprennent la glace carbonique5, le passage des trichomes à travers plusieurs micro-tamis avec des pores de taille décroissante7,9, et la substitution de l’azote liquide (LN) au milieu isolant8.
La nouveauté du protocole actuel d’isolement des trichomes, par rapport aux protocoles conventionnels, se présente de plusieurs façons. Ce protocole est pratique, car il ne nécessite pas de composants dangereux. La procédure peut être effectuée en laboratoire avec un minimum de précautions et facilite un débit élevé. La substitution du LN au milieu d’isolation liquide standard garantit l’intégrité des trichomes tout au long du processus d’isolement, ce qui permet une analyse transcriptomique ultérieure. Lors de la sublimation du LN et de la glace sèche, les trichomes isolés sont laissés exempts de résidus nocifs. De plus, la propension du LN à se sublimer à température ambiante permet son utilisation généreuse tout au long du protocole. En revanche, l’utilisation de grands volumes de milieu isolant conventionnel génère des difficultés pratiques dans sa manipulation. Enfin, le protocole diminue la séparation de la cellule discale de la structure de tête fragile restante du trichome glandulaire, permettant la rétention du contenu de l’espace de tête.
Ce protocole est présenté étape par étape détaillée pour faciliter la pratique technique d’isolement des trichomes à tête glandulaire de C. sativa. Le protocole fournit un flux de travail gérable qui se traduit par des trichomes isolés avec une concentration et une pureté élevées qui sont appropriés pour l’analyse moléculaire en aval.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip</td>
			<td>Agilent, Germany</td>
			<td>Reorder number 5067-1513</td>
			<td>Lab-on-a-chip system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transsonic-310</td>
			<td>Elma, Germany</td>
			<td>D-78224</td>
			<td>Ultrasonic cleaning unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Sample Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina, USA</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>Sample preperation for RNA sequencing library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum Plant Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH, USA</td>
			<td>STRN50-1KT</td>
			<td>Plant Total RNA Kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 &#181;m (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0350n350210</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size of 150 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0150n360465</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size o 105 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0105n320718</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size o 80 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0080n370465</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size o 65 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0065n340715</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size o 50 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0080n370465</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suitable gloves for handling low temperatures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety goggles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 block of dry ice (0.5-1 kg)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer and hard flat object</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 5 L plastic containers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter&#39;s circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Several clothespins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two containers of liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm wide painting brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-aqueous isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from cannabis sativa

Cet article présente un protocole pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Les voies de biosynthèse pour le métabolisme des cannabinoïdes et des terpènes volatils sont localisées principalement dans les trichomes de cannabis , et les trichomes isolés sont bénéfiques pour l’analyse du transcriptome. Les protocoles existants pour isoler les trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique sont peu pratiques et fournissent des têtes de trichomes compromises et une quantité relativement faible de trichomes isolés. De plus, ils s’appuient sur des appareils coûteux et des milieux d’isolement contenant des inhibiteurs de protéines pour éviter la dégradation de l’ARN. Le protocole actuel suggère de combiner trois modifications individuelles pour obtenir une grande quantité de trichomes glandulaires et de trichomes sessiles isolés à partir d’inflorescences femelles matures et de feuilles en éventail, respectivement. La première modification consiste à substituer l’azote liquide au milieu isolant conventionnel pour faciliter le passage des trichomes à travers les micro-tamis. La deuxième modification consiste à utiliser de la glace sèche pour détacher les trichomes de la source végétale. La troisième modification consiste à faire passer le matériel végétal consécutivement à travers cinq micro-tamis de taille décroissante des pores. L’imagerie microscopique a démontré l’efficacité de la technique d’isolement pour les deux types de trichomes. De plus, la qualité de l’ARN extrait des trichomes isolés était appropriée pour l’analyse transcriptomique en aval.

La principale modification incluse dans ce protocole par rapport aux protocoles conventionnels d’isolement de trichomes est de remplacer le milieu d’isolement standard par LN. L’utilisation du LN comme milieu d’isolement permet un flux de travail détendu, car tant que les échantillons sont immergés dans le LN, il est peu probable qu’une dégradation métabolique se produise. De plus, comme le protocole évite les composants dangereux (c.-à-d. l’acide aurintricarboxylique et le β-mercaptoéthanol) utilis?...

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Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa

Un protocole est présenté pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Le protocole est basé sur une extraction sèche et non tampon des trichomes en utilisant uniquement de l’azote liquide, de la glace sèche et des tamis en nylon et convient à l’extraction d’ARN et à l’analyse transcriptomique.

Isolement non aqueux et enrichissement des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa

This paper presents a protocol for the convenient and high-throughput isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from ...

L’importance du protocole réside dans sa commodité dans le peu de temps nécessaire pour son achèvement. Cela permet un débit élevé, une concentration élevée et un degré élevé d’isolement des trichomes pédonculés et sessiles. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité.Au cours de cette technique, il convient de considérer la densité des trichomes de la source végétale et d’inspecter le degré d’isolement à chaque étape au microscope tout en effectuant le protocole pour la première fois. Nurit Shalev, une experte en cannabis du Volcani Center, fera la démonstration de cette technique. Commencez par écraser un bloc de glace carbonique en petits flocons fins à l’aide d’un marteau et d’un objet dur et plat dans un récipient en plastique de cinq litres.Utilisez une grande passoire et tamisez les fines flocons de glace sèche de la glace sèche non broyée dans un autre récipient en plastique de cinq litres. Versez environ 200 centimètres cubes de flocons de glace sèche dans un bécher en verre vertical d’un litre. Ajoutez jusqu’à 10 grammes d’inflorescences de cannabis sativa congelées sur la première couche de glace sèche pilée et recouvrez-la d’une couche supplémentaire de 200 centimètres cubes de glace sèche finement broyée.Ensuite, couvrez l’ouverture du bécher en verre d’un litre avec deux à trois couches d’une moustiquaire de porte moustiquaire d’un millimètre et fixez-la avec des élastiques. Ensuite, versez de l’azote liquide dans un grand récipient en acier inoxydable à fond rond. Insérez un treillis de 350 micromètres dans un tamis à farine ou une passoire à tamis pour couvrir le treillis du tamis de farine par le bas.Placez ce tamis à farine au-dessus du grand récipient en acier inoxydable à fond rond rempli d’azote liquide. Pour minimiser la perte de la masse tamisée, assurez-vous que la largeur du récipient dépasse celle du tamis à farine. Séparez les trichomes de la matière végétale en secouant le verre d’un litre avec son ouverture pointant vers le bas vers le tamis à farine.Réserver le bécher toutes les deux à trois minutes, en permettant le tamisage de la glace sèche broyée et du matériel végétal accumulé sur le tamis à farine. Tamiser le tamis à farine horizontalement pour faciliter le passage de la matière végétale dans l’azote liquide dans le récipient en acier inoxydable à fond rond placé en dessous. Ensuite, ajoutez de l’azote liquide au récipient en acier inoxydable et de la glace sèche pilée au bécher en verre d’un litre lorsque leurs niveaux sont faibles.Lorsque le matériel végétal sur le tamis de farine est épuisé, remplissez le matériel végétal usagé dans le bécher en verre avec 10 grammes supplémentaires de matériel végétal frais et répétez le processus de tamisage jusqu’à la collecte d’une quantité suffisante de trichomes enrichis dans le récipient. Vérifier la présence d’une substance blanche semblable à une poudre au fond du récipient en acier inoxydable immergé dans l’azote liquide avant une observation au microscope pour confirmer la collecte d’un nombre suffisant de trichomes. Ajouter une petite quantité d’azote liquide dans un petit récipient en acier inoxydable propre à fond rond.Ensuite, pliez un microtamis de 40 par 40 centimètres ayant une maille de 150 micromètres deux fois pour obtenir un pli de 20 par 20 centimètres et ouvrez-le en forme de cône. Fixez le cône en maille au bord du récipient en acier inoxydable à fond rond avec une ou deux épingles à linge de sorte que la partie ouverte du cône soit verticale et que sa partie pointue soit partiellement immergée dans de l’azote liquide. Une fois cela fait, versez doucement l’azote liquide contenant la substance poudreuse blanche obtenue plus tôt dans le cône microtamis.À l’aide d’une brosse large, rassembler et transférer tout matériel végétal restant du premier récipient dans le cône à mailles de 150 micromètres. Ensuite, détachez soigneusement la pince à linge du couvercle du récipient et ouvrez le cône de microtamis pour localiser les trichomes au milieu du microtamis ouvert. Tenez les quatre coins du microtamis ensemble et immergez la partie centrale contenant les trichomes dans de l’azote liquide.Trempez doucement et agitez le microtamis dans l’azote liquide pendant une minute. À l’aide d’une aiguille stérile, faites de minuscules trous dans le bouchon d’un tube à essai de 50 millilitres pour éviter la montée en pression. Ramassez les débris végétaux non tamisés, la glace sèche et les trichomes plus gros enveloppés au centre du microtamis dans un tube à essai de 50 millilitres et stockez-les à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.Transférer séquentiellement les trichomes tamisés immergés dans l’azote liquide à travers des microtamis, en diminuant la taille des coulées de 105 à 80 à 65, puis à 50 micromètres. Après chaque transfert, collectez séparément les trichomes de différentes tailles restant sur le tamis et étiquetez-les. Faites de minuscules trous dans le bouchon du tube à l’aide d’une aiguille stérile.Transférer les trichomes désirés immergés dans de l’azote liquide et enveloppés dans le tamis de 50 micromètres dans une assiette propre à l’aide d’une cuillère pré-réfrigérée. Ensuite, transférez rapidement les trichomes en poudre dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre étiqueté à l’aide d’une spatule pré-refroidie, et stockez immédiatement les tubes à moins 80 degrés Celsius pour d’autres études. Au stade initial du processus d’isolement, les morceaux de tissu foliaire étaient prédominants dans la partie isolée, contrairement au produit d’isolement final, qui était entièrement composé de trichomes isolés non contaminés.La qualité de la tige granulaire isolée et des trichomes sessiles a été observée lors de la dernière étape d’isolement. La pureté des trichomes isolés à l’aide de cette méthode était comparable à un protocole conventionnel. La structure délicate de la tête du trichome pédonculé a été conservée et toutes les têtes du trichome à tige isolée étaient visibles, contrairement à la méthode traditionnelle, où la structure complète de la tête du trichome était manquante et où seules des cellules discales étaient présentes.L’extraction de l’ARN et l’estimation de l’intégrité de l’ARN des trichomes isolés ont indiqué un nombre élevé d’intégrité de l’ARN ou des valeurs RIN de 9,4 à 10, et la chromatographie sur gel a indiqué une intégrité élevée de l’ARN. Effectuez soigneusement le mouvement de perfusion en forme de sac T de l’isolement microtamisé de 150 à 50 micro-tamis. Cette méthode peut fournir des informations sur la composition transcriptomique et probablement protéomique des trichomes du cannabis et des trichomes d’autres espèces végétales.Suite à cette procédure, des caractérisations métaboliques et transcriptomiques peuvent être effectuées. Ces méthodes supplémentaires peuvent aider à comprendre les niveaux d’expression des gènes dans les trichomes isolés et leurs profils métaboliques. Cette technique a permis la caractérisation transcriptomique de trichomes glandulaires de différentes variétés de cannabis.

Research

JoVE Journal

Genetics

Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Isolement du géant lampbrush Chromosomes de Living oocytes de grenouilles et salamandres

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

Recherche

Génétique

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

D&#39;un produit naturel à son cluster Gène biosynthétique: Une démonstration utilisant Polyketomycin de<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimisation et analyse comparative des méthodes d&#39;enrichissement de l&#39;ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Séquençage de l’ARNm de sang total à l’aide du séquençage NANOPORE

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...