Name: non-aqueous isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from cannabis sativa
Uploaded: 2023-05-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung von CannabiVar Ltd. Das gesamte Pflanzenmaterial wurde großzügigerweise von Professor Hinanit Koltai vom Volcani Center, Israel, zur Verfügung gestellt.

HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Pflanzenmaterial bestand aus vier C. sativa-ARO-Volcani-Stämmen (CS-11, CS-12, CS-13 und CS-14 ), die im Volcani Center, Israel, angebaut wurden, wie an anderer Stelle beschrieben11. Drüsige Trichome mit Stielstielen wurden aus reifen Blütenständen isoliert, und drüsige sitzende Trichome wurden aus großen Fächerblättern von reifen, nicht blühenden Mutterpflanzen isoliert. Sämtliches Pflanzenmaterial wurde frisch gepflückt und sofort bei ...

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	<li>Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+plant+trichome+biochemistry+for+the+production+of+useful+compounds.">Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds.</a> Plant Journal for Cell &amp; Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).</li><li>Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-volatile+natural+products+in+plant+glandular+trichomes:+chemistry,+biological+activities+and+biosynthesis.">Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis.</a> Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).</li><li>Fairbairn, J. 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J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Cannabis+sativa+glandular+trichome+proteome.">Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome.</a> PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).</li><li>Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+transcription+factors+involved+in+cannabinoid+biosynthesis+in+Cannabis+sativa+L.">Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L.</a> Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).</li><li>Slone, J. H., Kelsey, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabis+glandular+trichomes+alter+morphology+and+metabolite+content+during+flower+maturation.">Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation.</a> The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).</li><li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gland+distribution+and+cannabinoid+content+in+clones+of+Cannabis+sativa+L.">Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L.</a> American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).</li><li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+cannabinoids+in+individual+glandular+trichomes+of+Cannabis+sativa+L.+(Cannabaceae).">Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae).</a> American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).</li><li>Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+glandular+hairs+of+Cannabis+sativa+from+scanning+electron+microscopy.">Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy.</a> American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).</li><li>Marks, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+isolating+large+quantities+of+Arabidopsis+trichomes+for+transcriptome,+cell+wall,+and+other+types+of+analyses.">A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses.</a> The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).</li><li>Huebbers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+method+for+the+release,+enrichment+and+purification+of+high-quality+Arabidopsis+thaliana+rosette+leaf+trichomes+enables+profound+insights+into+the+trichome+proteome.">An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome.</a> Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).</li></ol>

Im Vergleich zu den derzeit verfügbaren Trichom-Isolationsprotokollen werden im vorliegenden Protokoll zwei wesentliche Modifikationen beschrieben. Dazu gehört das Ablösen der Trichome vom Pflanzenmaterial mit Hilfe von Trockeneis im ersten Schritt und das Ersetzen des üblicherweise verwendeten flüssigen Puffermediums durch LN. Die erste Modifikation für die Reinigung von C. sativa-Trichomen basiert auf einem früheren Protokoll, das die Verwendung von zerkleinertem Trockeneis zur Ablösung der Trichome vo...

Drüsen-Trichome sind haarähnliche Strukturen, die in Pflanzen vorkommen und viele sekundäre Metabolitenenthalten 1 und eine wertvolle Bank neuer biosynthetischer Gene und Enzymedarstellen 2. Bei Cannabis ist die Biosynthese der wichtigen Sekundärmetaboliten, Cannabinoide3 und Terpene4, in den Trichomen lokalisiert. In Anbetracht der Rolle der Trichome bei der Bestimmung der Qualität von Cannabis sowohl für medizinische als auch für Freizeitzwecke ist die Untersuchung der Trichom-Genexpression von Interesse. Um die Expression von trichomspezifischen Genen zu charakterisieren, müssen zunächst die interessierenden Trichome isoliert werden. Trichom-Isolationsprotokolle wurden erstmals 1992 beschrieben5, und ihre neuesten Entwicklungen wurden kürzlich überprüft2. Im Allgemeinen können Protokolle zur Extraktion von Drüsentrichomen zur transkriptomischen Charakterisierung in zwei verschiedene aufeinanderfolgende Schritte unterteilt werden. Der erste Schritt beinhaltet eine gründliche physikalische Trennung der Trichome vom Pflanzengewebe. Dieser Schritt kann durch die Verwendung von Trockeneis5, Glasperlen mit einer handelsüblichen Vorrichtung6,7, das Mahlen des Pflanzenmaterials gegen ein Maschensieb8 oder das Vortexen des Pflanzengewebes in einem Isolationspuffer9 durchgeführt werden. Der zweite Schritt beinhaltet eine verfeinerte Trennung der interessierenden Trichome von den mikroskopisch kleinen Pflanzenresten und/oder anderen Trichomtypen. Dieser Schritt kann mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation 8,10 oder Sieben verschiedener Größen 7,9 durchgeführt werden. Aufgrund der extremen Empfindlichkeit der RNA in prozessierten Geweben gegenüber Abbaustoffen werden diese beiden aufeinanderfolgenden Schritte in der Regel im eiskalten Isolationsmedium durchgeführt, oft in Gegenwart von Proteininhibitoren4.
Herkömmliche Trichom-Isolationsprotokolle erfordern neben den eiskalten Temperaturen auch große Mengen an Isolationsmedium, um ein effizientes Extraktionsverfahren zu gewährleisten. Die Kombination dieser Komponenten führt zu einem mühsamen, zeitaufwändigen Isolationsprozess, der einen hohen Durchsatz verhindert. Die Präsentation eines einfachen, benutzerfreundlichen alternativen Protokolls zur Isolierung von Trichomen ist daher wahrscheinlich für verschiedene Aspekte im Zusammenhang mit der Trichomcharakterisierung von Vorteil. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, ein alternatives Protokoll zur Isolierung von gestielten und sitzenden Drüsen-Kopftrichomen aus Cannabis sativa anzubieten, indem mehrere Elemente aus den konventionellen Protokollen kombiniert und integriert werden. Zu diesen Elementen gehören Trockeneis5, das Durchlaufen der Trichome durch mehrere Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße 7,9 und die Substitution des Isolationsmediums8 durch flüssigen Stickstoff (LN).
Die Neuartigkeit des vorliegenden Trichom-Isolationsprotokolls im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen zeigt sich in vielerlei Hinsicht. Dieses Protokoll ist praktisch, da es keine gefährlichen Komponenten benötigt. Das Verfahren kann mit minimalen Vorsichtsmaßnahmen im Labor durchgeführt werden und ermöglicht einen hohen Durchsatz. Durch den Ersatz des flüssigen Standard-Isolationsmediums durch LN wird die Integrität der Trichome während des gesamten Isolationsprozesses sichergestellt und eine anschließende transkriptomische Analyse ermöglicht. Nach der Sublimation des LN und des Trockeneises bleiben die isolierten Trichome frei von schädlichen Rückständen. Darüber hinaus ermöglicht die Neigung von LN, bei Raumtemperatur zu sublimieren, seine großzügige Verwendung im gesamten Protokoll. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung großer Mengen herkömmlicher Isolationsmedien zu praktischen Schwierigkeiten bei der Handhabung. Schließlich verringert das Protokoll die Trennung der Bandscheibenzelle von der verbleibenden zerbrechlichen Kopfstruktur des Drüsentrichoms und ermöglicht so die Beibehaltung des Kopfrauminhalts.
Dieses Protokoll wird in einer detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitung vorgestellt, um die technische Praxis der Isolierung von C. sativa-Drüsen-Kopftrichomen zu unterstützen . Das Protokoll bietet einen überschaubaren Arbeitsablauf, der zu isolierten Trichomen mit einer hohen Konzentration und Reinheit führt, die für die nachgelagerte molekulare Analyse geeignet sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
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		<tr>
			<td>Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip</td>
			<td>Agilent, Germany</td>
			<td>Reorder number 5067-1513</td>
			<td>Lab-on-a-chip system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transsonic-310</td>
			<td>Elma, Germany</td>
			<td>D-78224</td>
			<td>Ultrasonic cleaning unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Sample Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina, USA</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>Sample preperation for RNA sequencing library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum Plant Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH, USA</td>
			<td>STRN50-1KT</td>
			<td>Plant Total RNA Kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 &#181;m (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0350n350210</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size of 150 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0150n360465</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size o 105 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0105n320718</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size o 80 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0080n370465</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size o 65 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0065n340715</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon micro-sieve with mesh size o 50 &#181;m (size of 30 x 30 cm)</td>
			<td>Sinun Tech, Israel</td>
			<td>r0080n370465</td>
			<td>Nylon&#160;screen aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suitable gloves for handling low temperatures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety goggles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 block of dry ice (0.5-1 kg)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammer and hard flat object</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 5 L plastic containers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter&#39;s circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Several clothespins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two containers of liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm wide painting brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-aqueous isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from cannabis sativa

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von gestielten und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Die Biosynthesewege für den Cannabinoid- und flüchtigen Terpenstoffwechsel sind hauptsächlich in den Cannabis-Trichomen lokalisiert, und isolierte Trichome sind für die Transkriptomanalyse von Vorteil. Die bestehenden Protokolle zur Isolierung von Drüsentrichomen für die transkriptomische Charakterisierung sind unpraktisch und liefern kompromittierte Trichomköpfe und eine relativ geringe Menge an isolierten Trichomen. Darüber hinaus sind sie auf teure Apparaturen und Isolationsmedien angewiesen, die Proteininhibitoren enthalten, um den RNA-Abbau zu vermeiden. Das vorliegende Protokoll schlägt vor, drei einzelne Modifikationen zu kombinieren, um eine große Menge an isolierten Drüsen-, Kopf-, Stiel- und sitzenden Trichomen aus reifen weiblichen Blütenständen bzw. Fächerblättern von C. sativa zu erhalten. Die erste Modifikation besteht darin, das herkömmliche Isolationsmedium durch flüssigen Stickstoff zu ersetzen, um den Durchgang der Trichome durch die Mikrosiebe zu erleichtern. Die zweite Modifikation beinhaltet die Verwendung von Trockeneis, um die Trichome von der Pflanzenquelle zu lösen. Bei der dritten Modifikation wird das Pflanzenmaterial nacheinander durch fünf Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße geleitet. Die mikroskopische Bildgebung zeigte die Wirksamkeit der Isolationstechnik für beide Trichomtypen. Darüber hinaus war die Qualität der RNA, die aus den isolierten Trichomen extrahiert wurde, für die nachgelagerte transkriptomische Analyse geeignet.

Die wichtigste Änderung, die in diesem Protokoll im Vergleich zu herkömmlichen Trichom-Isolationsprotokollen enthalten ist, besteht darin, das Standard-Isolationsmedium durch LN zu ersetzen. Die Verwendung von LN als Isolationsmedium ermöglicht einen entspannten Arbeitsablauf, denn solange die Proben in LN eingetaucht sind, ist kein metabolischer Abbau wahrscheinlich. Da das Protokoll außerdem die gefährlichen Komponenten (d. h. Aurintricarbonsäure und β-Mercaptoethanol) vermeidet, die in herkömmlichen Trichom-Is...

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Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa

Es wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von Drüsen-, Kopfstiel- und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Das Protokoll basiert auf einer trockenen, nicht pufferartigen Extraktion von Trichomen, bei der nur flüssiger Stickstoff, Trockeneis und Nylonsiebe verwendet werden, und eignet sich für die RNA-Extraktion und transkriptomische Analyse.

Nicht-wässrige Isolierung und Anreicherung von glandulären, gestielten und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa

This paper presents a protocol for the convenient and high-throughput isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from ...

Die Bedeutung des Protokolls liegt in seiner Bequemlichkeit in der kurzen Zeit, die für seine Fertigstellung benötigt wird. Dies ermöglicht einen hohen Durchsatz, eine hohe Konzentration und einen hohen Grad an Isolierung der gestielten und sessilen Trichomen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Geradlinigkeit.Bei dieser Technik sollte man die Trichomdichte der Pflanzenquelle berücksichtigen und den Isolationsgrad bei jedem Schritt unter dem Mikroskop überprüfen, während das Protokoll zum ersten Mal durchgeführt wird. Diese Technik wird von Nurit Shalev, einer Cannabis-Expertin vom Volcani Center, demonstriert. Beginnen Sie damit, einen Trockeneisblock mit einem Hammer und einem harten, flachen Gegenstand in einem Fünf-Liter-Plastikbehälter in kleine, feine Flocken zu zerkleinern.Verwenden Sie ein großes Sieb und sieben Sie die feinen Trockeneisflocken aus dem nicht zerkleinerten Trockeneis in einen weiteren Fünf-Liter-Kunststoffbehälter. Gießen Sie etwa 200 Kubikzentimeter der Trockeneisflocken in einen aufrechten Ein-Liter-Glasbecher. Gib bis zu 10 Gramm gefrorene Cannabis-Sativa-Blütenstände auf die erste Schicht zerkleinertes Trockeneis und bedecke sie mit einer zusätzlichen Schicht von 200 Kubikzentimetern fein zerkleinertem Trockeneis.Decken Sie dann die Öffnung des Ein-Liter-Glasbechers mit zwei bis drei Schichten eines ein Millimeter großen Moskitonetzes ab und sichern Sie es mit Gummibändern. Gießen Sie als Nächstes flüssigen Stickstoff in einen großen Edelstahlbehälter mit rundem Boden. Setzen Sie ein 350 Mikrometer dickes Sieb in ein Mehlsieb oder Sieb ein, um das Mehlsiebgewebe von unten abzudecken.Platzieren Sie dieses Mehlsieb über dem großen Edelstahlbehälter mit rundem Boden, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist. Um den Verlust der gesiebten Masse zu minimieren, achten Sie darauf, dass die Breite des Behälters die des Mehlsiebs überschreitet. Trennen Sie die Trichome vom Pflanzenmaterial, indem Sie das Ein-Liter-Glas mit der Öffnung nach unten in Richtung des Mehlsiebs schütteln.Stellen Sie das Becherglas alle zwei bis drei Minuten beiseite, damit das zerkleinerte Trockeneis und das Pflanzenmaterial, das sich auf dem Mehlsieb angesammelt hat, gesiebt werden können. Sieben Sie das Mehlsieb horizontal, um den Durchgang des Pflanzenmaterials in den flüssigen Stickstoff in dem darunter platzierten Edelstahlbehälter mit rundem Boden zu erleichtern. Als nächstes geben Sie flüssigen Stickstoff in den Edelstahlbehälter und das zerkleinerte Trockeneis in den Ein-Liter-Glasbecher, wenn deren Füllstand zur Neige geht.Wenn das Pflanzenmaterial auf dem Mehlsieb aufgebraucht ist, füllen Sie das gebrauchte Pflanzenmaterial im Glasbecher mit zusätzlichen 10 Gramm frischem Pflanzenmaterial auf und wiederholen Sie den Siebvorgang, bis eine ausreichende Menge angereicherter Trichome im Behälter gesammelt ist. Überprüfen Sie das Vorhandensein einer weißen, pulverartigen Substanz am Boden des Edelstahlbehälters, der in flüssigen Stickstoff getaucht ist, bevor Sie eine mikroskopische Betrachtung durchführen, um die Ansammlung ausreichender Trichome zu bestätigen. Geben Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff in einen sauberen, kleinen Edelstahlbehälter mit rundem Boden.Falten Sie dann ein 40 x 40 Zentimeter großes Mikrosieb mit einer Maschenweite von 150 Mikrometern zweimal, um eine 20 x 20 Zentimeter große Falte zu erhalten, und öffnen Sie es kegelförmig. Befestigen Sie den Maschenkegel mit einer oder zwei Wäscheklammern am Rand des Edelstahlbehälters mit rundem Boden, so dass der geöffnete Teil des Kegels aufrecht steht und sein spitzer Teil teilweise in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Wenn Sie fertig sind, gießen Sie den flüssigen Stickstoff, der die zuvor erhaltene weiße, pulverartige Substanz enthält, vorsichtig in den Mikrosiebkegel.Sammeln Sie mit einer breiten Bürste das restliche Pflanzenmaterial aus dem ersten Behälter und geben Sie es in den 150 Mikrometer großen Maschenkegel. Löse als Nächstes vorsichtig die Wäscheklammer vom Deckel des Behälters und öffne den Mikrosiebkegel, um die Trichome in der Mitte des geöffneten Mikrosiebs zu lokalisieren. Halte alle vier Ecken des Mikrosiebs zusammen und tauche den mittleren Teil mit den Trichomen in flüssigen Stickstoff.Tauchen Sie das Mikrosieb vorsichtig ein und schütteln Sie es eine Minute lang im flüssigen Stickstoff. Machen Sie mit einer sterilen Nadel winzige Löcher in die Kappe eines 50-Milliliter-Reagenzglases, um einen Druckaufbau zu vermeiden. Schaufeln Sie die nicht gesiebten Pflanzenreste, das Trockeneis und die größeren Trichomen, die in der Mitte des Mikrosiebs eingewickelt sind, in ein 50-Milliliter-Reagenzglas und lagern Sie es für die zukünftige Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.Übertragen Sie die gesiebten Trichome, die in den flüssigen Stickstoff getaucht sind, nacheinander durch Mikrosiebe, wobei die Gießgrößen von 105 auf 80 bis 65 und dann auf 50 Mikrometer abnehmen. Sammeln Sie nach jedem Transfer die unterschiedlich großen Trichomen, die auf dem Mikrosieb verbleiben, separat und etikettieren Sie sie. Machen Sie mit einer sterilen Nadel winzige Löcher in die Kappe des Röhrchens.Übertragen Sie die gewünschten Trichome, die in flüssigen Stickstoff getaucht und in das 50-Mikrometer-Mikrosieb gewickelt sind, mit einem vorgekühlten Löffel auf einen sauberen Teller. Übertragen Sie dann die pulverartigen Trichome mit einem vorgekühlten Spatel schnell in ein beschriftetes, vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie die Röhrchen sofort bei minus 80 Grad Celsius für weitere Untersuchungen. In der Anfangsphase des Isolationsprozesses überwogen im isolierten Teil Blattgewebestücke, im Gegensatz zum endgültigen Isolationsprodukt, das vollständig aus nicht kontaminierten isolierten Trichomen bestand.Die Qualität der isolierten körnigen gestielten und sessilen Trichome wurde im letzten Isolationsschritt beobachtet. Die Reinheit der mit dieser Methode isolierten Trichome war vergleichbar mit einem konventionellen Protokoll. Die zarte Struktur des gestielten Trichomkopfes blieb erhalten, und die gesamten Köpfe des isolierten gestielten Trichoms waren sichtbar, im Gegensatz zur traditionellen Methode, bei der die vollständige Struktur des Trichomkopfes fehlte und nur Bandscheibenzellen vorhanden waren.Die RNA-Extraktion und die Abschätzung der RNA-Integrität der isolierten Trichome zeigten eine hohe RNA-Integritätszahl oder RIN-Werte von 9,4 bis 10, und die Gelchromatographie zeigte eine hohe RNA-Integrität. Führen Sie vorsichtig die T-Beutel-artige Infusionsbewegung der 150 bis 50 Mikro-Mikrosieb-Isolierung durch. Diese Methode kann Einblicke in die transkriptomische und wahrscheinlich proteomische Zusammensetzung von Trichomen aus Cannabis und Trichomen anderer Pflanzenarten geben.Im Anschluss an dieses Verfahren können metabolische und transkriptomische Charakterisierungen durchgeführt werden. Diese zusätzlichen Methoden können helfen, die Expressionsniveaus der Gene in den isolierten Trichomen und ihre Stoffwechselprofile zu verstehen. Diese Technik hat die transkriptomische Charakterisierung von Drüsentrichomen aus verschiedenen Cannabissorten ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Genetics

Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

Forschung

Genetik

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...