Name: voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique at JoVE.com

Vi sætter pris på den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (82130113) og Key F &D and Transformation Program fra Science & Technology Department of Qinghai Province (2020-SF-C33).

De kommercielt opnåede H9c2 rotte kardiomyocytter (se materialetabellen) blev inkuberet i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet atmosfære. Helcelle-patch-clamp-teknikken blev derefter anvendt til at detektere ændringerne i IKv i normale H9c2-celler og 4-AP- eller AC-behandlede celler (figur 1 og figur 2).
<...

<ol>
	<li>Luan, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+transport+and+ion+channels+in+biofilms.">Passive transport and ion channels in biofilms.</a> Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).</li><li>Lei, M., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+mechanism+of+arrhythmia+induced+by+sodium+channel+disease.">Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease.</a> Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).</li><li>Varr&#243;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+transmembrane+ion+channels+and+action+potentials:+Cellular+physiology+and+arrhythmogenic+behavior.">Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior.</a> Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).</li><li>Campuzano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+autopsy+and+sudden+cardiac+death.">Negative autopsy and sudden cardiac death.</a> International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).</li><li>Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+sodium+channelopathies.">Cardiac sodium channelopathies.</a> Pflu&#776;gers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).</li><li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+gated+Ca2++currents+in+the+human+pathophysiologic+heart:+A+review.">Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).</li><li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+dissection+of+multiple+ionic+currents+in+single+cardiac+myocytes+under+action+potential-clamp.">Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).</li><li>Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+functional+myocardial+potassium+channel+diversity.">Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity.</a> Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Olson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv1.5+channelopathy+due+to+KCNA5+loss-of-function+mutation+causes+human+atrial+fibrillation.">Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation.</a> Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).</li><li>Christophersen, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+KCNA5:+impact+on+the+atrial-specific+potassium+current+IKur+in+patients+with+lone+atrial+fibrillation.">Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation.</a> European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).</li><li>Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+knockout+of+the+transient+outward+current,+long-QT+syndrome,+and+cardiac+remodeling+in+mice+expressing+a+dominant-negative+Kv4+alpha+subunit.">Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit.</a> Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).</li><li>Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ancillary+subunits+on+ventricular+repolarization.">Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization.</a> Journal of Electrocardiology. 40, 42-46 (2007).</li><li>Jia, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+studies+on+the+application+of+patch-clamp+technique+in+cellular+electrophysiology.">Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology.</a> Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).</li><li>Leuthardt, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+electrocorticographic+speech+network+to+control+a+brain-computer+interface+in+humans.">Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans.</a> Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).</li><li>Tian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applying+progress+of+patch-clamp+technique.">The applying progress of patch-clamp technique.</a> Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).</li><li>Wang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shensong+yangxin+capsule+on+c-type+Kv1.4+potassium+channel.">Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel.</a> Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).</li><li>Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+resveratrol+on+Kv2.1+potassium+channels+in+cardiac+myocytes.">The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes.</a> Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neferine+on+Kv4.3+channels+expressed+in+HEK293+cells+and+ex+vivo+electrophysiology+of+rabbit+hearts.">Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aconitine:+A+review+of+its+pharmacokinetics,+pharmacology,+toxicology+and+detoxification.">Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification.</a> Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+efficacy+and+toxicity+of+aconitine:+A+new+frontier+for+the+ancient+poison.">Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison.</a> Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).</li><li>An, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+tegaserod,+a+gastrokinetic+agent,+on+voltage-gated+K++channels+in+rabbit+coronary+arterial+smooth+muscle+cells.">The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).</li><li>Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Kv2.1+by+BACE1+decreases+potassium+current+and+reduces+neuronal+apoptosis.">Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis.</a> Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).</li><li>Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+and+multi-electrode+array+electrophysiological+analysis+in+acute+mouse+brain+slices.">Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).</li><li>Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+pressure-clamped+patch-clamp+recording+at+the+node+of+Ranvier+of+rat+myelinated+nerves.">Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li><li>Yoshimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+in+vivo+patch-clamp+technique+to+pharmacological+analysis+of+synaptic+transmission+in+the+CNS.">Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS.</a> Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).</li><li>Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+and+perforated+patch-clamp+recordings+from+acutely-isolated+murine+sinoatrial+node+cells.">Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells.</a> Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).</li><li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+problems+with+in+vitro+screening+of+drugs+for+QT+interval+prolongation+using+HERG+K++channels+expressed+in+mammalian+cell+lines+and+Xenopus+oocytes.">Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).</li><li>Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+whole-cell+patch-clamp+configuration+on+the+pharmacological+assessment+of+the+hERG+channel:+Trazodone+as+a+case+example.">Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).</li><li>Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+in+vivo+patch+clamp+technique.">The development of in vivo patch clamp technique.</a> Chinese Remedies &amp; Clinics. 5, 399-401 (2003).</li><li>Lin, Y. F., Ouyang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+and+application+of+patch+clamp+technique.">Research progress and application of patch clamp technique.</a> Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+current+advances+on+pharmacology,+pharmacokinetics,+toxicity+and+detoxification+of+aconitine.">An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).</li><li>Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chinese+herbal+medicines+revisited:+A+Hong+Kong+perspective.">Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective.</a> Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).</li><li>Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+meta-analysis+based+on+the+preclinical+evidence+of+mechanism+of+aconitine-induced+cardiotoxicity.">An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+toxicity+of+aconite+alkaloids.">Myocardial toxicity of aconite alkaloids.</a> Shenyang Pharmaceutical University. , (2007).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aconitine+blocks+HERG+and+Kv1.5+potassium+channels.">Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels.</a> Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).</li><li>Campbell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+kinetics+and+selectivity+of+sodium+channels+in+frog+skeletal+muscle+fibers+treated+with+aconitine.">Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine.</a> The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).</li><li>Huang, X. Y., Ying, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+specific+protein+1+on+Kv2.1+potassium+channel+in+cardiac+myocytes.">The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes.</a> Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).</li><li>Cao, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+patch+clamp+technique.">Development and application of patch clamp technique.</a> Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).</li></ol>

Den elektrofysiologiske teknik med patch-clamp bruges hovedsageligt til at registrere og reflektere den elektriske aktivitet og funktionelle egenskaber ved ionkanaler på cellemembranen25. På nuværende tidspunkt inkluderer de vigtigste optagelsesmetoder for patch-clamp-teknikken enkeltkanalsoptagelse og helcelleoptagelse26. Til helcelletilstand bruges glasmikroelektroden og undertrykket til at danne en højmodstandsforsegling mellem et lille område af cellemembranen og e...

Ionkanaler er specielle integrerede proteiner indlejret i lipiddobbeltlaget i cellemembranen. I nærværelse af aktivatorer danner centrene for sådanne specielle integrerede proteiner meget selektive hydrofile porer, hvilket tillader ioner af en passende størrelse og ladning at passere igennem på en passiv transportmåde1. Ionkanaler er grundlaget for celle excitabilitet og bioelektricitet og spiller en nøglerolle i en række cellulære aktiviteter2. Hjertet leverer blod til andre organer gennem regelmæssige sammentrækninger som følge af en excitation-kontraktion-koblet proces initieret af handlingspotentialer3. Tidligere undersøgelser har bekræftet, at dannelsen af handlingspotentialer i kardiomyocytter er forårsaget af ændringen i intracellulær ionkoncentration, og aktivering og inaktivering af Na +, Ca2+ og K + ionkanaler i humane kardiomyocytter fører til dannelse af handlingspotentialer i en bestemt sekvens 4,5,6. Forstyrrede spændingsstyrede kaliumkanalstrømme (Kv) (IKv) kan ændre den normale hjerterytme, hvilket fører til arytmier, som er en af de førende dødsårsager. Derfor er optagelse af IKv afgørende for at forstå mekanismerne i lægemidler til behandling af livstruende arytmier7.
Kv-kanalen er en vigtig bestanddel af kaliumkanalen. Kv-kanalens koordinationsfunktion spiller en vigtig rolle i pattedyrshjertets elektriske aktivitet og myokardiekontraktilitet 8,9,10. I kardiomyocytter afhænger amplituden og varigheden af handlingspotentialer af co-ledningen af udadgående K + strømme af flere Kv-kanalundertyper11. Reguleringen af Kv-kanalfunktionen er meget vigtig for den normale repolarisering af hjertehandlingspotentialet. Selv den mindste ændring i Kv-konduktans påvirker i høj grad hjerterepolarisering og øger muligheden for arytmi12,13.
Som en grundlæggende metode i cellulær elektrofysiologisk forskning kan en tætning med høj modstand mellem et lille område af cellemembranen og en pipettespids til optagelse af helcelleplaster etableres ved at anvende et undertryk. Det kontinuerlige undertryk får cellemembranen til at komme i kontakt med pipettespidsen og klæbe fast på pipettens indre væg. Det resulterende komplette elektriske kredsløb gør det muligt at registrere en hvilken som helst enkelt ionkanalstrøm over overfladen af cellemembranen14. Denne teknik har en meget høj følsomhed for cellemembranens ionkanalstrøm og kan bruges til at detektere strømme i alle ionkanaler, og applikationerne er ekstremt brede15. Desuden har patch-clamp højere autoritet og nøjagtighed16 sammenlignet med fluorescerende mærkning og radioaktiv mærkning. På nuværende tidspunkt er helcelle-patch-clamp-teknikken blevet brugt til at detektere de traditionelle kinesiske medicinkomponenter, der virker på Kv-kanalstrømme17,18,19. For eksempel brugte Wang et al. helcelle-patch-klemme-teknikken og bekræftede, at den effektive komponent i lotusfrøet kunne opnå hæmning af Kv4.3-kanalen ved at blokere de aktiverede tilstandskanaler19. Aconitin (AC) er en af de effektive og aktive ingredienser i Aconitum arter, såsom Aconitum carmichaeli Debx og Aconitum pendul Busch. Talrige undersøgelser har vist, at overdoser af AC kan forårsage arytmier og endda hjertestop20. Samspillet mellem AC og spændingsstyrede ionkanaler fører til forstyrrelse af intracellulær ionhomeostase, som er nøglemekanismen for kardiotoksicitet21. Derfor anvendes helcelleplaster-klemme-teknikken i denne undersøgelse til at bestemme virkningerne af AC på IKv af kardiomyocytter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ2184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitine</td>
			<td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td>DSTDW000602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP Na2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>416O022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>163225-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>1192022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>3012022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 6. 0. 13</td>
			<td>data acqusition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>RH289133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>Axon digidata 1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8121587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>EZ6789D115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2166090RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 cells</td>
			<td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CL0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImageLive</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.5.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td>2106081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd</td>
			<td>20210221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020082501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020112601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td>
			<td>20160408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021020101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (20 &#215; 20 mm)</td>
			<td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd</td>
			<td>80340-0630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td>
			<td>Milli-Q IQ 7005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B commander</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp commander 2.0</td>
			<td>signal-amplifier software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>17C18B16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH&#160;meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S201K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>J210045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique

Kaliumkanaler på myokardiecellemembranen spiller en vigtig rolle i reguleringen af celleelektrofysiologiske aktiviteter. At være en af de vigtigste ionkanaler, spændingsstyrede kaliumkanaler (Kv) er tæt forbundet med nogle alvorlige hjertesygdomme, såsom lægemiddelinduceret myokardieskade og myokardieinfarkt. I denne undersøgelse blev helcelle-patch-clamp-teknikken anvendt til at bestemme virkningerne af 1,5 mM 4-aminopyridin (4-AP, en bredspektret kaliumkanalhæmmer) og aconitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM) på Kv-kanalstrømmen (IKv) i H9c2-kardiomyocytter. Det blev konstateret, at 4-AP hæmmede I Kv med ca. 54%, mens den hæmmende virkning af AC på IKv viste en dosisafhængig tendens (ingen effekt for 25 μM, 30% hæmningshastighed for 50 μM, 46% hæmmende sats for 100 μM og 54% hæmmende sats for 200 μM). På grund af egenskaberne ved højere følsomhed og præcision vil denne teknik fremme udforskningen af kardiotoksicitet og de farmakologiske virkninger af etnomedicin rettet mod ionkanaler.

Denne protokol tillod optagelse af IKv i henhold til parametrene i helcelle patch-clamp-teknikken. IKv blev udløst af 150 ms depolariserende pulsstimulering fra -40 til +60 mV ved et holdepotentiale på -60 mV (figur 3A). IKv af H9c2 rotte kardiomyocytter dukkede først op omkring -20 mV, og derefter steg amplituden med yderligere depolarisering. Det gennemsnitlige forhold mellem IKv og membranpotentialet blev beregnet ud fra de målte strømampli...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique at JoVE.com

Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

Den nuværende protokol beskriver en effektiv metode til realtid og dynamisk erhvervelse af spændingsstyrede kalium (Kv) kanalstrømme i H9c2 kardiomyocytter ved hjælp af helcelle patch-clamp-teknikken.

Spændingsafhængig kaliumstrømsoptagelse på H9c2-kardiomyocytter via helcelle-patch-klemme-teknikken

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Denne protokol registrerer med succes virkningerne af aconitin på IKv af H9C2-celler. Fremme af nye faser til undersøgelse af mekanismen for kardiotoksicitet af lægemidler ud fra ionkanalers perspektiv. Helcelle-patch-clamp-teknikken er guldstandarden for ionkanalforskning med høj følsomhed, høj præcision og høj specificitet.Helcelle-patch-clamp-teknikken kan anvendes til at udforske de farmakologiske eller toksiske mekanismer ved sammenstilling af specifikke ionkanaler til multisystemsygdomme, såsom kardiovaskulært system og nervesystem. Til at begynde med fordøjes cellerne med 0,25% trypsin i 30 sekunder, når H9C2-kulturskålen bliver 80% sammenflydende. Kultur 2 gange 10 til 5. celler pr. milliliter med normalt medium eller lægemiddelholdigt medium i en 35 millimeter skål tæppebelagt med glasplader i 24 timer ved 37 grader celsius, med en 5% kuldioxidatmosfære og 70 til 80% relativ luftfugtighed.Tænd mikropipettetrækkeren og forvarm i 30 minutter. Sæt derefter en borosilikatglaskapillær med et filament på mikropipettetrækkeren. Vælg programmet, og klik på enter på kontrolpanelet.Klik på rampeprogrammet i øverste højre hjørne for at bestemme varmeværdien af glaskapillæren. Skriv programmet til at trække elektroden i henhold til den værdi, der bestemmes af rampetesten, og klik på træk for at begynde at fremstille pipetterne. Tænd for den digitale analoge konverter, signalforstærkeren, mikromanipulatoren, mikroskopet og kameraet.Åbn billedbehandlingsprogrammet, signalforstærkersoftwaren og dataindsamlingssoftwaren i rækkefølge. Klik på anskaf og vælg rediger protokol i dataindsamlingssoftwaren. Rediger programmet i bølgeformsgrænsefladen.Indtast værdier for første niveau, deltaniveau, første varighed og deltavarighed for epoke A, epoke B og epoke C.Klik derefter på tilstandshastighedsgrænsefladen, og indstil prøvehierarkidataene. Klik derefter på redigeringsprotokol for at vælge stimulusknappen og indstille lækage-subtraktionsprogrammet i dialogboksen PM-lækage-subtraktion. For at etablere datalagringsstien skal du klikke på filen og vælge indstillede datafilnavne i dataindsamlingssoftwaren.Åbn derefter den etablerede lKv-protokol ved at vælge erhverve og klikke på åben protokol i dataindsamlingssoftwaren. Til sidst skal du klikke på værktøjsindstillingen og vælge membrantest for at begynde at køre protokollen. Tilsæt den ekstracellulære opløsning til cellebadet på helcelleplaster-klemmeapparatet, og placer dækselen opad med H9C2-cellerne i badet.Fyld 30% af pipetten med den ekstracellulære opløsning, og installer den på optageelektrodeholderen, der er integreret i patch-clamp-apparatet. Spænd pipetten med optageelektrodeholderen. Slip derefter pipetten i badet med mikromanipulatoren.Klik på pipetteforskydningsgrænsefladen i signalforstærkersoftwaren for at opretholde lKv-strømbasen ved nul picoamps. Lever et passende positivt tryk manuelt med en 1,0 ml sprøjte, der er forbundet til optageelektrodeholderen, gennem et plastrør. Flyt pipetten lidt ved at manipulere mikromanipulatoren i tre dimensioner for at komme i kontakt med cellen.Når membranen tester kvadratisk bølgefald, falder den med en tredjedel til en halv, efter at pipetten har rørt cellemembranen, fjern det positive tryk og manuelt levere et passende undertryk. Klik derefter på patch-grænsefladen til dataindsamlingssoftwaren for at danne gigaseal. Brug kapacitanskompensationen hurtigt og kapacitanskompensationen langsom signalforstærkersoftware under celleloftet for at kompensere for den hurtige og langsomme kapacitans.Påfør korte impulser af undertryk for at sprænge et plaster af cellemembranen. Udfør helcellemembrankapacitanskompensation ved at klikke på helcelleknappen i signalforstærkersoftwaren. Til sidst skal du gemme og registrere dataene ved at klikke på knappen til dataoptagelse.Åbn de gemte lKv-data med dataanalysesoftwaren. Gem de aktuelle spændingsforhold. Klik på analyser for at vælge statistik.Vælg området som markører 1 2 til dataanalyse, klik på spidsamplitude og middelknapper, og klik derefter på okay for at se dataene på resultatsiden. Endelig skal du kopiere kolonnen med lKv middeldata til funktionstegningssoftwaren til yderligere analyse. Gem de repræsentative lKv aktuelle spor.Klik på rediger for at vælge overfør spor, og vælg derefter den fulde sporing i det område, der skal overføres. Klik derefter på vælg i sporingsvalg og vælg IN 0 i signaler. Til sidst skal du klikke på okay for at se dataene på resultatsiden og kopiere de samlede data til funktionstegningssoftwaren for at tegne de aktuelle spor.Gem lKv-protokollen. Klik på rediger for at vælge opret stimulusbølgeformsignal og vælg okay. Gentag derefter trinnet for at tegne aktuelle spor uden at vælge signalet.lKv blev udløst af 150 millisekunder depolariserende pulsstimulering fra minus 40 til plus 60 millivolt ved at holde potentiale på minus 60 millivolt. LKv af H9C2 rotte kardiomyocytter optrådte først omkring minus 20 millivolt, og derefter steg amplituden med yderligere depolarisering. I sammenligning med kontrolgruppen blev lKv-amplituden observerbart reduceret efter de fem minutters behandling med 1,5 millimolar 4-AP.Derudover faldt lKv signifikant ved membranpotentialer fra 10 til 60 millivolt på en dosisafhængig måde efter 24 timers AC-behandling. Den enkelte celle efter optagelse af ionkanal kan bruges til yderligere enkeltcelle omics vurdering, såsom enkeltcellegenomik, transkriptomik, proteomics og metabolomics.

Research

JoVE Journal

Medicine

Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

Technique and Considerations in the Use of 4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation (HD-tDCS)

Technique and Considerations in the Use of 4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation HD-tDCS

Teknik og overvejelser i brugen af ​​4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation (HD-TDCs)

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS) has recently been developed as a noninvasive brain stimulation approach that increases ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Permanent Cerebral karokklusion<em&gt; Via</em&gt; Dobbelt Ligature og transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknik til subkutan Abdominal fedtvæv biopsi via en ikke-Diatermi metode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Vurdering af Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve og intracellulære diastolisk Calcium fjernelse i isolerede ventrikulær Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolering og dyrkning af voksen rotte Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Cavernous Nerve Stimulation and Recording of Intracavernous Pressure in a Rat

Bundløs nervestimulation og optagelse af intrakavernøs pres i en rotte

The stimulation of the cavernous nerve (CN) and measurement of intracavernous pressure (ICP) have been used extensively to test and evaluate therapies for ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Opdateret teknik til pålidelig, nem og tolereret Transcranial elektrisk stimulation, herunder Transcranial jævnstrøm stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube

Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride CCl4 Exposure Through an Orogastric Tube

Inducerende akut leverskade hos rotter via tetrachlormethan (CCl4)Eksponering gennem et orogastrisk rør

Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Optisk styring og registrering af calciumsignal med høj kapacitet i iPSC-afledte kardiomyocytter til toksicitetstest og fænotypisk lægemiddelscreening

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...