Name: voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique at JoVE.com

Nous apprécions le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82130113) et du programme clé de R&D et de transformation du Département des sciences et de la technologie de la province du Qinghai (2020-SF-C33).

Les cardiomyocytes H9c2 de rat obtenus commercialement (voir le tableau des matières) ont été incubés dans du DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. La technique de patch-clamp à cellules entières a ensuite été utilisée pour détecter les changements dans IKv dans les cellules H9c2 normales et les cellules traitées 4-AP- ou AC (Figure <strong cl...

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Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).</li><li>Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+and+perforated+patch-clamp+recordings+from+acutely-isolated+murine+sinoatrial+node+cells.">Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells.</a> Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).</li><li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+kinetics+and+selectivity+of+sodium+channels+in+frog+skeletal+muscle+fibers+treated+with+aconitine.">Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine.</a> The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).</li><li>Huang, X. Y., Ying, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+specific+protein+1+on+Kv2.1+potassium+channel+in+cardiac+myocytes.">The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes.</a> Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).</li><li>Cao, J. 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La technique électrophysiologique patch-clamp est principalement utilisée pour enregistrer et refléter l’activité électrique et les caractéristiques fonctionnelles des canaux ioniques sur la membrane cellulaire25. À l’heure actuelle, les principales méthodes d’enregistrement de la technique patch-clamp comprennent l’enregistrement monocanal et l’enregistrement de cellules entières26. Pour le mode cellule entière, la microélectrode de verre et la pressio...

Les canaux ioniques sont des protéines intégrées spéciales intégrées dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. En présence d’activateurs, les centres de ces protéines intégrées spéciales forment des pores hydrophiles hautement sélectifs, permettant aux ions d’une taille et d’une charge appropriées de passer à travers de manière passive1. Les canaux ioniques sont à la base de l’excitabilité cellulaire et de la bioélectricité et jouent un rôle clé dans une variété d’activités cellulaires2. Le cœur fournit du sang à d’autres organes par des contractions régulières résultant d’un processus couplé excitation-contraction initié par des potentiels d’action3. Des études antérieures ont confirmé que la génération de potentiels d’action dans les cardiomyocytes est causée par le changement de la concentration d’ions intracellulaires, et l’activation et l’inactivation des canaux ioniques Na+, Ca2+ et K+ dans les cardiomyocytes humains conduisent à la formation de potentiels d’action dans une certaine séquence 4,5,6. Les courants perturbés des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) (IKv) pourraient modifier le rythme cardiaque normal, entraînant des arythmies, qui sont l’une des principales causes de décès. Par conséquent, l’enregistrement de l’IKv est essentiel pour comprendre les mécanismes des médicaments pour traiter les arythmies potentiellement mortelles7.
Le canal Kv est un composant important du canal potassique. La fonction de coordination du canal Kv joue un rôle important dans l’activité électrique et la contractilité myocardique du cœur des mammifères 8,9,10. Dans les cardiomyocytes, l’amplitude et la durée des potentiels d’action dépendent de la co-conduction des courants K+ sortants par plusieurs sous-types de canaux Kv11. La régulation de la fonction du canal Kv est très importante pour la repolarisation normale du potentiel d’action cardiaque. Même le moindre changement de conductance Kv a un impact considérable sur la repolarisation cardiaque et augmente la possibilité d’arythmie12,13.
Représentant une méthode fondamentale dans la recherche électrophysiologique cellulaire, un joint à haute résistance entre une petite zone de la membrane cellulaire et une pointe de pipette pour l’enregistrement de patch-clamp à cellules entières peut être établi en appliquant une pression négative. La pression négative continue fait que la membrane cellulaire entre en contact avec l’embout de la pipette et colle à la paroi interne de la pipette. Le circuit électrique complet résultant permet d’enregistrer n’importe quel courant de canal ionique unique à travers la surface de la membrane cellulaire14. Cette technique a une très grande sensibilité pour le courant du canal ionique de la membrane cellulaire et peut être utilisée pour détecter des courants dans tous les canaux ioniques, et les applications sont extrêmement larges15. De plus, par rapport au marquage fluorescent et au marquage radioactif, le patch-clamp a une autorité et une précision plus élevées16. À l’heure actuelle, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour détecter les composants de la médecine traditionnelle chinoise agissant sur les courants du canal Kv17,18,19. Par exemple, Wang et al. ont utilisé la technique du patch-clamp à cellules entières et ont confirmé que le composant efficace de la graine de lotus pourrait atteindre l’inhibition du canal Kv4.3 en bloquant les canaux d’étatactivés 19. L’aconitine (AC) est l’un des ingrédients efficaces et actifs des espèces d’Aconitum, telles que Aconitum carmichaeli Debx et Aconitum pendulum Busch. De nombreuses études ont montré que les surdoses de CA peuvent provoquer des arythmies et même un arrêt cardiaque20. L’interaction entre l’AC et les canaux ioniques voltage-dépendants conduit à la perturbation de l’homéostasie ionique intracellulaire, qui est le mécanisme clé de la cardiotoxicité21. Par conséquent, dans cette étude, la technique de patch-clamp à cellules entières est utilisée pour déterminer les effets de l’AC sur le IKv des cardiomyocytes.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ2184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitine</td>
			<td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td>DSTDW000602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP Na2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>416O022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>163225-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>1192022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>3012022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 6. 0. 13</td>
			<td>data acqusition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>RH289133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>Axon digidata 1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8121587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>EZ6789D115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2166090RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 cells</td>
			<td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CL0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImageLive</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.5.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td>2106081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd</td>
			<td>20210221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020082501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020112601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td>
			<td>20160408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021020101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (20 &#215; 20 mm)</td>
			<td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd</td>
			<td>80340-0630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td>
			<td>Milli-Q IQ 7005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B commander</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp commander 2.0</td>
			<td>signal-amplifier software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>17C18B16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH&#160;meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S201K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>J210045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique

Les canaux potassiques sur la membrane cellulaire du myocarde jouent un rôle important dans la régulation des activités électrophysiologiques cellulaires. Étant l’un des principaux canaux ioniques, les canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) sont étroitement associés à certaines maladies cardiaques graves, telles que les lésions myocardiques induites par les médicaments et l’infarctus du myocarde. Dans la présente étude, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour déterminer les effets de 1,5 mM de 4-aminopyridine (4-AP, un inhibiteur des canaux potassiques à large spectre) et d’aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM) sur le courant du canal Kv (IKv) dans les cardiomyocytes H9c2. Il a été constaté que la 4-AP inhibait le I Kv d’environ 54%, tandis que l’effet inhibiteur de l’AC sur le IKv montrait une tendance dose-dépendante (aucun effet pour 25 μM, taux inhibiteur de 30% pour 50 μM, taux inhibiteur de 46% pour 100 μM et taux inhibiteur de 54% pour 200 μM). En raison des caractéristiques de sensibilité et de précision plus élevées, cette technique favorisera l’exploration de la cardiotoxicité et des effets pharmacologiques de l’ethnomédecine ciblant les canaux ioniques.

Ce protocole a permis l’enregistrement du IKv selon les paramètres définis dans la technique du patch-clamp à cellules entières. Le IKv a été déclenché par 150 ms de stimulus d’impulsion dépolarisant de −40 à +60 mV à un potentiel de maintien de −60 mV (Figure 3A). Le IKv des cardiomyocytes H9c2 du rat est d’abord apparu autour de -20 mV, puis l’amplitude a augmenté avec la dépolarisation. La relation moyenne entre le IKv e...

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Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique (Video) | JoVE

Le présent protocole décrit une méthode efficace pour l’acquisition dynamique et en temps réel des courants des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) dans les cardiomyocytes H9c2 en utilisant la technique de patch-clamp à cellules entières.

Enregistrement du courant de potassium voltage-dépendant sur les cardiomyocytes H9C2 via la technique de patch-clamp à cellules entières

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Ce protocole enregistre avec succès les effets de l’aconitine sur l’IKv des cellules H9C2. Promouvoir de nouvelles phases pour étudier le mécanisme de cardiotoxicité des médicaments du point de vue des canaux ioniques. La technique de patch-clamp à cellules entières est l’étalon-or de la recherche sur les canaux ioniques avec une sensibilité élevée, une haute précision et une spécificité élevée.La technique de patch-clamp à cellules entières peut être utilisée pour explorer les mécanismes pharmacologiques ou toxiques de la juxta gating des canaux ioniques spécifiques pour des maladies multisystémiques, telles que le système cardiovasculaire et le système nerveux. Pour commencer, digérez les cellules avec 0,25% de trypsine pendant 30 secondes, une fois que la boîte de culture H9C2 devient 80% confluente. Culture 2 fois 10 à la 5ème cellule par millilitre avec un milieu normal ou contenant un médicament dans un plat de 35 millimètres tapissé de plaques de verre pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, avec une atmosphère de dioxyde de carbone de 5% et 70 à 80% d’humidité relative.Allumez l’extracteur de micropipette et préchauffez pendant 30 minutes. Placez ensuite un capillaire en verre borosilicaté avec un filament sur l’extracteur de micropipette. Sélectionnez le programme et cliquez sur Entrée dans le panneau de configuration.Cliquez sur le programme de rampe dans le coin supérieur droit pour déterminer le pouvoir calorifique du capillaire en verre. Écrivez le programme de tirage de l’électrode en fonction de la valeur déterminée par le test de rampe et cliquez sur tirer pour commencer à fabriquer les pipettes. Allumez le convertisseur analogique numérique, l’amplificateur de signal, le micromanipulateur, le microscope et l’appareil photo.Ouvrez l’application d’imagerie, le logiciel d’amplificateur de signal et le logiciel d’acquisition de données en séquence. Cliquez sur acquérir et sélectionnez modifier le protocole dans le logiciel d’acquisition de données. Modifiez le programme dans l’interface de forme d’onde.Entrez des valeurs pour le premier niveau, le niveau delta, la première durée et la durée delta pour l’époque A, l’époque B et l’époque C.Cliquez ensuite sur l’interface de débit de mode et définissez les données de hiérarchie d’essai. Ensuite, cliquez sur modifier le protocole pour sélectionner le bouton de stimulus et définissez le programme de soustraction de fuite dans la boîte de dialogue de soustraction de fuite PM. Pour établir le chemin de stockage des données, cliquez sur fichier et sélectionnez définir les noms de fichiers de données dans le logiciel d’acquisition de données.Ouvrez ensuite le protocole lKv établi en sélectionnant acquérir et en cliquant sur protocole ouvert dans le logiciel d’acquisition de données. Enfin, cliquez sur l’option Outils et sélectionnez test de membrane pour commencer à exécuter le protocole. Ajouter la solution extracellulaire au bain cellulaire sur l’appareil de serrage patch-clamp à cellules entières et placer le couvercle vers le haut avec les cellules H9C2 dans le bain.Remplissez 30% de la pipette avec la solution extracellulaire et installez-la sur le support d’électrode d’enregistrement intégré dans l’appareil de serrage patch. Serrez la pipette avec le porte-électrode d’enregistrement. Déposez ensuite la pipette dans le bain avec le micro manipulateur.Cliquez sur l’interface de décalage de la pipette du logiciel de l’amplificateur de signal pour maintenir la ligne de base du courant lKv à zéro picoampères. Délivrez manuellement une pression positive appropriée avec une seringue de 1,0 millilitre, connectée au porte-électrode d’enregistrement, à travers un tube en plastique. Déplacez légèrement la pipette en manipulant le micromanipulateur en trois dimensions pour entrer en contact avec la cellule.Une fois que la membrane teste les ondes carrées chute d’un tiers à la moitié après que la pipette touche la membrane cellulaire, retirez la pression positive et délivrez manuellement une pression négative appropriée. Cliquez ensuite sur l’interface patch du logiciel d’acquisition de données pour former le gigaseal. Utilisez le logiciel d’amplificateur de signal rapide et lent de compensation de capacité pendant le plafond de la cellule pour compenser la capacité rapide et lente.Appliquez de brèves impulsions de pression négative pour rompre un patch de la membrane cellulaire. Exécutez la compensation capacitive de la membrane de la cellule entière en cliquant sur le bouton de la cellule entière du logiciel d’amplificateur de signal. Enfin, enregistrez et enregistrez les données en cliquant sur le bouton d’enregistrement des données.Ouvrez les données lKv enregistrées avec le logiciel d’analyse de données. Enregistrez les relations de tension actuelles. Cliquez sur analyser pour sélectionner les statistiques.Sélectionnez la plage en tant que curseurs 1 et 2 pour l’analyse des données, cliquez sur les boutons d’amplitude de crête et de moyenne, puis cliquez sur OK pour afficher les données dans la page de résultats. Enfin, copiez la colonne des données moyennes lKv dans le logiciel de dessin de fonction pour une analyse plus approfondie. Enregistrez les traces de courant lKv représentatives.Cliquez sur modifier pour sélectionner les traces de transfert, puis sélectionnez la trace complète dans la région à transférer. Ensuite, cliquez sur sélectionner dans la sélection de trace et sélectionnez IN 0 dans les signaux. Enfin, cliquez sur OK pour afficher les données dans la page de résultats et copiez les données totales dans le logiciel de dessin de fonction pour dessiner les traces actuelles.Enregistrez le protocole lKv. Cliquez sur modifier pour sélectionner créer un signal de forme d’onde de stimulus et sélectionnez OK. Répétez ensuite l’étape pour dessiner des traces de courant sans sélectionner le signal.Le lKv a été déclenché par 150 millisecondes de stimulus d’impulsion dépolarisant de moins 40 à plus 60 millivolts à un potentiel de maintien de moins 60 millivolts. Le lKv des cardiomyocytes de rat H9C2 est apparu pour la première fois autour de moins 20 millivolts, puis l’amplitude a augmenté avec la dépolarisation. En comparaison avec le groupe témoin, l’amplitude lKv a été sensiblement réduite après les cinq minutes de traitement avec 1,5 millimolaire 4-AP.De plus, le lKv a diminué de manière significative aux potentiels membranaires de 10 à 60 millivolts de manière dose-dépendante, après le traitement AC de 24 heures. La cellule individuelle, après l’enregistrement du canal ionique, peut être utilisée pour d’autres évaluations omiques unicellulaires, telles que la génomique unicellulaire, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique.

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