Name: voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique at JoVE.com

Wir freuen uns über die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Foundation of China (82130113) und des Key R&D and Transformation Program der Science & Technology Department der Provinz Qinghai (2020-SF-C33).

Die kommerziell gewonnenen H9c2-Kardiomyozyten der Ratte (siehe Materialtabelle) wurden in DMEM inkubiert, das 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einer mit 5%CO2 befeuchteten Atmosphäre enthielt. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik wurde dann verwendet, um die Veränderungen in IKv in normalen H9c2-Zellen und 4-AP- oder AC-behandelten Zellen zu erkennen (Abbildung 1 und Abbild...

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Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).</li><li>Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+and+perforated+patch-clamp+recordings+from+acutely-isolated+murine+sinoatrial+node+cells.">Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells.</a> Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).</li><li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. 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Die elektrophysiologische Patch-Clamp-Technik wird hauptsächlich verwendet, um die elektrische Aktivität und funktionelle Eigenschaften von Ionenkanälen auf der Zellmembran25 aufzuzeichnen und zu reflektieren. Gegenwärtig umfassen die Hauptaufzeichnungsverfahren der Patch-Clamp-Technik die Einkanalaufzeichnung und die Ganzzellenaufzeichnung26. Für den Ganzzellenmodus werden die Glasmikroelektrode und der Unterdruck verwendet, um eine hochohmige Abdichtung zwischen eine...

Ionenkanäle sind spezielle integrierte Proteine, die in die Lipiddoppelschicht der Zellmembran eingebettet sind. In Gegenwart von Aktivatoren bilden die Zentren solcher speziellen integrierten Proteine hochselektive hydrophile Poren, die Ionen geeigneter Größe und Ladung passiv transportieren1. Ionenkanäle sind die Grundlage der Zellerregbarkeit und Bioelektrizität und spielen eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von zellulären Aktivitäten2. Das Herz versorgt andere Organe durch regelmäßige Kontraktionen mit Blut, die aus einem Erregungs-Kontraktions-gekoppelten Prozess resultieren, der durch Aktionspotentiale ausgelöstwird 3. Frühere Studien haben bestätigt, dass die Erzeugung von Aktionspotentialen in Kardiomyozyten durch die Änderung der intrazellulären Ionenkonzentration verursacht wird, und die Aktivierung und Inaktivierung von Na+, Ca2+ und K + Ionenkanälen in menschlichen Kardiomyozyten führt zur Bildung von Aktionspotentialen in einer bestimmten Sequenz 4,5,6. Gestörte spannungsabhängige Kalium (Kv) Kanalströme (IKv) können den normalen Herzrhythmus verändern und zu Arrhythmien führen, die eine der häufigsten Todesursachen sind. Daher ist die Erfassung des IKv entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von Medikamenten zur Behandlung lebensbedrohlicher Arrhythmien7.
Der Kv-Kanal ist ein wichtiger Bestandteil des Kaliumkanals. Die Koordinationsfunktion des Kv-Kanals spielt eine wichtige Rolle bei der elektrischen Aktivität und myokardialen Kontraktilität des Säugetierherzens 8,9,10. In Kardiomyozyten hängen Amplitude und Dauer der Aktionspotentiale von der Koleitung von nach außen gerichteten K+-Strömen durch mehrere Kv-Kanal-Subtypen11 ab. Die Regulation der Kv-Kanalfunktion ist sehr wichtig für die normale Repolarisation des kardialen Aktionspotentials. Schon die geringste Änderung der Kv-Leitfähigkeit wirkt sich stark auf die kardiale Repolarisation aus und erhöht die Möglichkeit einer Arrhythmie12,13.
Als grundlegende Methode in der zellulären elektrophysiologischen Forschung kann durch Anlegen eines Unterdrucks eine hochohmige Abdichtung zwischen einem kleinen Bereich der Zellmembran und einer Pipettenspitze für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung hergestellt werden. Durch den kontinuierlichen Unterdruck kommt die Zellmembran mit der Pipettenspitze in Kontakt und haftet an der Innenwand der Pipette. Der resultierende vollständige elektrische Schaltkreis ermöglicht es, jeden einzelnen Ionenkanalstrom über die Oberfläche der Zellmembran14 aufzuzeichnen. Diese Technik hat eine sehr hohe Empfindlichkeit für den Ionenkanalstrom der Zellmembran und kann verwendet werden, um Ströme in allen Ionenkanälen zu detektieren, und die Anwendungen sind extrem breit15. Darüber hinaus hat Patch-Clamp im Vergleich zur fluoreszierenden Markierung und radioaktiven Markierung eine höhere Autorität und Genauigkeit16. Gegenwärtig wird die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Komponenten der traditionellen chinesischen Medizin nachzuweisen, die auf Kv-Kanalströme17,18,19 wirken. Zum Beispiel verwendeten Wang et al. die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik und bestätigten, dass die effektive Komponente des Lotussamens die Hemmung des Kv4.3-Kanals erreichen könnte, indem sie die aktivierten Zustandskanäleblockiert 19. Aconitin (AC) ist einer der wirksamen und aktiven Inhaltsstoffe von Aconitum-Arten, wie Aconitum carmichaeli Debx und Aconitum pendulum Busch. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Überdosierungen von AC Arrhythmien und sogar Herzstillstand verursachen können20. Die Wechselwirkung zwischen AC- und spannungsabhängigen Ionenkanälen führt zur Störung der intrazellulären Ionenhomöostase, die der Schlüsselmechanismus der Kardiotoxizität ist21. Daher wird in dieser Studie die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Auswirkungen von AC auf das IKv von Kardiomyozyten zu bestimmen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ2184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitine</td>
			<td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td>DSTDW000602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP Na2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>416O022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>163225-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>1192022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>3012022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 6. 0. 13</td>
			<td>data acqusition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>RH289133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>Axon digidata 1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8121587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>EZ6789D115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2166090RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 cells</td>
			<td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CL0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImageLive</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.5.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td>2106081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd</td>
			<td>20210221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020082501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020112601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td>
			<td>20160408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021020101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (20 &#215; 20 mm)</td>
			<td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd</td>
			<td>80340-0630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td>
			<td>Milli-Q IQ 7005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B commander</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp commander 2.0</td>
			<td>signal-amplifier software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>17C18B16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH&#160;meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S201K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>J210045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique

Kaliumkanäle auf der myokardialen Zellmembran spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der elektrophysiologischen Aktivitäten der Zellen. Als einer der wichtigsten Ionenkanäle sind spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (Kv) eng mit einigen schweren Herzerkrankungen wie medikamenteninduzierten Myokardschäden und Myokardinfarkt verbunden. In der vorliegenden Studie wurde die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Wirkungen von 1,5 mM 4-Aminopyridin (4-AP, ein Breitband-Kaliumkanalinhibitor) und Aconitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM und 200 μM) auf den Kv-Kanalstrom (IKv) in H9c2-Kardiomyozyten zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass 4-AP das I Kv um etwa 54% hemmte, während die hemmende Wirkung von AC auf das IKv einen dosisabhängigen Trend zeigte (keine Wirkung für 25 μM, 30% Hemmrate für 50 μM, 46% Hemmrate für 100 μM und 54% Hemmrate für 200 μM). Aufgrund der Eigenschaften einer höheren Empfindlichkeit und Präzision wird diese Technik die Erforschung der Kardiotoxizität und der pharmakologischen Wirkungen der Ethnomedizin auf Ionenkanäle fördern.

Dieses Protokoll ermöglichte die Aufzeichnung des IKv gemäß den Parametern, die in der Ganzzellen-Patch-Clamp-Technik eingestellt wurden. Das IKv wurde durch 150 ms depolarisierenden Pulsstimulus von −40 bis +60 mV bei einem Haltepotential von −60 mV ausgelöst (Abbildung 3A). Das IKv der H9c2-Kardiomyozyten der Ratte erschien zuerst um −20 mV, und dann nahm die Amplitude mit weiterer Depolarisation zu. Aus den gemessenen Stromamplituden wurde die mi...

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Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Echtzeit- und dynamischen Erfassung von spannungsgesteuerten Kaliumkanalströmen (Kv) in H9c2-Kardiomyozyten unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik.

Spannungsabhängige Kaliumstromaufzeichnung an H9C2-Kardiomyozyten mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Technik

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Dieses Protokoll zeichnet erfolgreich die Auswirkungen des Aconitins auf das IKv von H9C2-Zellen auf. Förderung neuer Phasen zur Untersuchung des Mechanismus der Kardiotoxizität von Arzneimitteln aus der Perspektive von Ionenkanälen. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik ist der Goldstandard der Ionenkanalforschung mit hoher Empfindlichkeit, hoher Präzision und hoher Spezifität.Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik kann eingesetzt werden, um die pharmakologischen oder toxischen Mechanismen der Gegenüberstellung spezifischer Ionenkanäle für Multisystemerkrankungen wie Herz-Kreislauf-System und Nervensystem zu erforschen. Um zu beginnen, verdauen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin für 30 Sekunden, sobald die H9C2-Kulturschale 80% konfluent ist. Kultur 2 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter mit normalem Medium oder arzneimittelhaltigem Medium in einer 35-Millimeter-Schale, die mit Glasplatten ausgelegt ist, für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, mit einer Kohlendioxidatmosphäre von 5% und 70 bis 80% relativer Luftfeuchtigkeit.Schalten Sie den Mikropipettenzieher ein und heizen Sie ihn 30 Minuten vor. Dann legen Sie eine Borosilikatglaskapillare mit einem Filament auf den Mikropipettenzieher. Wählen Sie das Programm aus und klicken Sie in der Systemsteuerung auf Enter.Klicken Sie auf das Rampenprogramm in der oberen rechten Ecke, um den Heizwert der Glaskapillare zu bestimmen. Schreiben Sie das Programm zum Ziehen der Elektrode gemäß dem durch den Rampentest ermittelten Wert und klicken Sie auf Pull, um mit der Herstellung der Pipetten zu beginnen. Schalten Sie den digitalen Analogwandler, den Signalverstärker, den Mikromanipulator, das Mikroskop und die Kamera ein.Öffnen Sie die Imaging-Anwendung, die Signalverstärker-Software und die Datenerfassungssoftware nacheinander. Klicken Sie auf Erfassen und wählen Sie Protokoll bearbeiten in der Datenerfassungssoftware. Bearbeiten Sie das Programm in der Wellenformschnittstelle.Geben Sie Werte für die erste Ebene, die Delta-Ebene, die erste Dauer und die Delta-Dauer für Epoche A, Epoche B und Epoche C ein.Klicken Sie dann auf die Modus-Tarifschnittstelle und legen Sie die Testhierarchiedaten fest. Klicken Sie anschließend auf Protokoll bearbeiten, um die Stimulus-Schaltfläche auszuwählen und das Leck-Subtraktionsprogramm im PM-Leck-Subtraktionsdialog einzustellen. Um den Datenspeicherpfad einzurichten, klicken Sie auf Datei und wählen Sie Datendateinamen in der Datenerfassungssoftware festlegen.Öffnen Sie dann das etablierte lKv-Protokoll, indem Sie in der Datenerfassungssoftware Acquire auswählen und auf Open Protocol klicken. Klicken Sie abschließend auf die Option Tools und wählen Sie Membrantest, um die Ausführung des Protokolls zu starten. Die extrazelluläre Lösung wird in das Zellbad auf dem Ganzzellen-Patch-Clamp-Apparat gegeben und der Deckel mit den H9C2-Zellen im Bad nach oben gelegt.Füllen Sie 30% der Pipette mit der extrazellulären Lösung und installieren Sie sie auf dem in die Patchklemmvorrichtung integrierten Aufzeichnungselektrodenhalter. Ziehen Sie die Pipette mit dem Aufnahmeelektrodenhalter fest. Lassen Sie dann die Pipette mit dem Mikromanipulator in das Bad fallen.Klicken Sie auf die Pipettenoffset-Schnittstelle der Signalverstärkersoftware, um die lKv-Strombasislinie bei null Pikoampere zu halten. Liefern Sie manuell einen geeigneten Überdruck mit einer 1,0-Milliliter-Spritze, die mit dem Aufzeichnungselektrodenhalter verbunden ist, durch einen Kunststoffschlauch. Bewegen Sie die Pipette leicht, indem Sie den Mikromanipulator dreidimensional manipulieren, um die Zelle zu kontaktieren.Sobald die Rechteckwelle der Membrantests um ein Drittel bis zur Hälfte abfällt, nachdem die Pipette die Zellmembran berührt hat, entfernen Sie den Überdruck und liefern Sie manuell einen entsprechenden Unterdruck. Klicken Sie dann auf die Patch-Oberfläche der Datenerfassungssoftware, um das Gigaseal zu bilden. Verwenden Sie die Software für die Kapazitätskompensation schnell und die Kapazitätskompensation für langsame Signalverstärker während der Zelldecke, um die schnelle und langsame Kapazität zu kompensieren.Wenden Sie kurze Unterdruckimpulse an, um einen Fleck der Zellmembran zu zerreißen. Führen Sie die Kapazitätskompensation der Ganzzellenmembran aus, indem Sie auf die Ganzzellentaste der Signalverstärkersoftware klicken. Speichern und notieren Sie abschließend die Daten, indem Sie auf die Schaltfläche Datenaufzeichnung klicken.Öffnen Sie die gespeicherten lKv-Daten mit der Datenanalysesoftware. Speichern Sie die aktuellen Spannungsbeziehungen. Klicken Sie auf Analysieren, um Statistiken auszuwählen.Wählen Sie den Bereich als Cursor 1 2 für die Datenanalyse aus, klicken Sie auf die Schaltflächen Spitzenamplitude und Mittelwert und klicken Sie dann auf OK, um die Daten auf der Ergebnisseite anzuzeigen. Kopieren Sie schließlich die Spalte mit lKv-Mittelwertdaten zur weiteren Analyse in die Funktionszeichnungssoftware. Speichern Sie die repräsentativen lKv-Stromspuren.Klicken Sie auf Bearbeiten, um Übertragungsspuren auszuwählen, und wählen Sie dann die vollständige Ablaufverfolgung in der zu übertragenden Region aus. Klicken Sie anschließend auf Select in trace selection und wählen Sie IN 0 in Signalen. Klicken Sie abschließend auf OK, um die Daten auf der Ergebnisseite anzuzeigen, und kopieren Sie die Gesamtdaten in die Funktionszeichensoftware, um die aktuellen Spuren zu zeichnen.Speichern Sie das lKv-Protokoll. Klicken Sie auf Bearbeiten, um Stimulus-Wellenformsignal erstellen auszuwählen, und wählen Sie OK. Wiederholen Sie dann den Schritt zum Zeichnen von Stromspuren, ohne das Signal auszuwählen.Der lKv wurde durch 150 Millisekunden depolarisierenden Impulsreizes von minus 40 bis plus 60 Millivolt bei einem Haltepotential von minus 60 Millivolt ausgelöst. Der lKv der H9C2-Kardiomyozyten der Ratte erschien zuerst um minus 20 Millivolt, und dann nahm die Amplitude mit weiterer Depolarisation zu. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die lKv-Amplitude nach der fünfminütigen Behandlung mit 1,5 Millimolar 4-AP beobachtbar reduziert.Zusätzlich sank der lKv bei Membranpotentialen dosisabhängig nach der 24-stündigen AC-Behandlung signifikant von 10 bis 60 Millivolt. Die einzelne Zelle nach der Aufnahme des Ionenkanals kann für weitere Einzelzell-Omics-Beurteilungen verwendet werden, wie z.B. Einzelzellgenomik, Transkriptomik, Proteomik und die Metabolomik.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medizin

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Acute liver injury (ALI) plays a crucial role in the development of hepatic failure, which is characterized by severe liver dysfunction including ...

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Optische Hochdurchsatzkontrolle und Aufzeichnung des Kalziumsignals in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für Toxizitätstests und phänotypisches Arzneimittelscreening

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...