Name: voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique at JoVE.com

Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130113) e do Programa Chave de P&D e Transformação do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Qinghai (2020-SF-C33).

Os cardiomiócitos de ratos H9c2 obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) foram incubados em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%. A técnica de patch-clamp de células inteiras foi então empregada para detectar as alterações no IKv em células H9c2 normais e células tratadas com 4-AP- ou AC (Figura 1 e Figura...

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Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).</li><li>Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+and+perforated+patch-clamp+recordings+from+acutely-isolated+murine+sinoatrial+node+cells.">Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells.</a> Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).</li><li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. 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A técnica eletrofisiológica patch-clamp é utilizada principalmente para registrar e refletir a atividade elétrica e as características funcionais dos canais iônicos na membrana celular25. Atualmente, os principais métodos de gravação da técnica patch-clamp incluem a gravação de canal único e a gravação de célula inteira26. Para o modo de célula inteira, o microeletrodo de vidro e a pressão negativa são usados para formar uma vedação de alta resistência...

Os canais iônicos são proteínas especiais integradas embutidas na bicamada lipídica da membrana celular. Na presença de ativadores, os centros dessas proteínas especiais integradas formam poros hidrofílicos altamente seletivos, permitindo que íons de tamanho e carga apropriados passem de forma passivade transporte 1. Os canais iônicos são a base da excitabilidade celular e da bioeletricidade e desempenham um papel fundamental em uma variedade de atividades celulares2. O coração fornece sangue a outros órgãos através de contrações regulares resultantes de um processo acoplado à excitação-contração iniciado pelos potenciais de ação3. Estudos prévios confirmaram que a geração de potenciais de ação em cardiomiócitos é causada pela alteração da concentração de íons intracelulares, e a ativação e inativação dos canais iônicos Na+, Ca2+ e K+ em cardiomiócitos humanos levam à formação de potenciais de ação em uma determinada sequência 4,5,6. Correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) perturbadas (IKv) podem alterar o ritmo cardíaco normal, levando a arritmias, que são uma das principais causas de morte. Portanto, o registro do IKv é fundamental para a compreensão dos mecanismos das drogas para o tratamento de arritmias com risco de vida7.
O canal de Kv é um componente importante do canal de potássio. A função de coordenação do canal de Kv desempenha um papel importante na atividade elétrica e na contratilidade miocárdica do coração de mamíferos 8,9,10. Nos cardiomiócitos, a amplitude e a duração dos potenciais de ação dependem da cocondução de correntes K+ externas por múltiplos subtipos de canais de Kv11. A regulação da função do canal de Kv é muito importante para a repolarização normal do potencial de ação cardíaco. Mesmo a menor alteração na condutância de Kv impacta sobremaneira a repolarização cardíaca e aumenta a possibilidade de arritmia12,13.
Representando um método fundamental na pesquisa eletrofisiológica celular, uma vedação de alta resistência entre uma pequena área da membrana celular e uma ponta de pipeta para gravação de patch clamp de célula inteira pode ser estabelecida aplicando uma pressão negativa. A pressão negativa contínua faz com que a membrana celular entre em contato com a ponta da pipeta e grude na parede interna da pipeta. O circuito elétrico completo resultante permite registrar qualquer corrente de canal iônico único através da superfície da membrana celular14. Esta técnica tem uma sensibilidade muito alta para a corrente do canal iônico da membrana celular e pode ser usada para detectar correntes em todos os canais iônicos, e as aplicações são extremamente amplas15. Além disso, em comparação com a marcação fluorescente e a marcação radioativa, o patch-clamp tem maior autoridade e precisão16. Atualmente, a técnica de patch-clamp de células inteiras tem sido utilizada para detectar os componentes da medicina tradicional chinesa que atuam sobre as correntes do canal Kv17,18,19. Por exemplo, Wang et al. usaram a técnica de pinça de pinça de célula inteira e confirmaram que o componente efetivo da semente de lótus poderia alcançar a inibição do canal Kv4.3 bloqueando os canais de estado ativados19. A aconitina (AC) é um dos ingredientes eficazes e ativos das espécies de Acconitum, como Aconitum carmichaeli Debx e Aconitum pendulum Busch. Numerosos estudos têm demonstrado que overdoses de CA podem causar arritmias e até parada cardíaca20. A interação entre CA e canais iônicos dependentes de voltagem leva à ruptura da homeostase iônica intracelular, que é o principal mecanismo de cardiotoxicidade21. Portanto, neste estudo, a técnica de patch-clamp de células inteiras é usada para determinar os efeitos da CA no IKv dos cardiomiócitos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ2184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitine</td>
			<td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td>DSTDW000602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP Na2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>416O022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>163225-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>1192022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>3012022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 6. 0. 13</td>
			<td>data acqusition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>RH289133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>Axon digidata 1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8121587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>EZ6789D115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2166090RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 cells</td>
			<td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CL0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImageLive</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.5.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td>2106081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd</td>
			<td>20210221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020082501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020112601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td>
			<td>20160408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021020101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (20 &#215; 20 mm)</td>
			<td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd</td>
			<td>80340-0630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td>
			<td>Milli-Q IQ 7005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B commander</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp commander 2.0</td>
			<td>signal-amplifier software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>17C18B16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH&#160;meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S201K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>J210045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique

Os canais de potássio na membrana celular miocárdica desempenham um papel importante na regulação das atividades eletrofisiológicas celulares. Sendo um dos principais canais iônicos, os canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) estão intimamente associados a algumas doenças cardíacas graves, como dano miocárdico induzido por drogas e infarto do miocárdio. No presente estudo, a técnica de patch-clamp de células inteiras foi empregada para determinar os efeitos de 1,5 mM de 4-aminopiridina (4-AP, um inibidor do canal de potássio de amplo espectro) e aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM e 200 μM) sobre a corrente do canal de Kv (IKv) em cardiomiócitos H9c2. Verificou-se que o 4-AP inibiu o I Kv em cerca de 54%, enquanto o efeito inibitório da CA sobre o IKv mostrou uma tendência dose-dependente (sem efeito para 25 μM, taxa inibitória de 30% para 50 μM, taxa inibitória de 46% para 100 μM e taxa inibitória de 54% para 200 μM). Devido às características de maior sensibilidade e precisão, esta técnica promoverá a exploração da cardiotoxicidade e dos efeitos farmacológicos da etnomedicina visando os canais iônicos.

Este protocolo permitiu o registro do IKv de acordo com os parâmetros estabelecidos na técnica patch-clamp de células inteiras. O IKv foi desencadeado por 150 ms de estímulo de pulso despolarizante de -40 a +60 mV a um potencial de retenção de -60 mV (Figura 3A). O IKv dos cardiomiócitos de ratos H9c2 apareceu pela primeira vez em torno de -20 mV e, em seguida, a amplitude aumentou com mais despolarização. A relação média entre o IKv e ...

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Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

O presente protocolo descreve um método eficiente para a aquisição dinâmica e em tempo real de correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) em cardiomiócitos H9c2 usando a técnica de patch-clamp de células inteiras.

Registro de Corrente de Potássio Dependente de Voltagem em Cardiomiócitos H9c2 através da Técnica de Patch-Clamp de Células Inteiras

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Este protocolo registra com sucesso os efeitos da aconitina no IKv das células H9C2. Promover novas fases para investigar o mecanismo de cardiotoxicidade de fármacos sob a perspectiva dos canais iônicos. A técnica de patch-clamp de células inteiras é o padrão-ouro da pesquisa de canais iônicos com alta sensibilidade, alta precisão e alta especificidade.A técnica de patch-clamp de células inteiras pode ser empregada para explorar os mecanismos farmacológicos ou tóxicos de justagem de canais iônicos específicos para doenças multissistêmicas, como o sistema cardiovascular e o sistema nervoso. Para começar, digerir as células com tripsina a 0,25% por 30 segundos, uma vez que a placa de cultura H9C2 se torne 80% confluente. Cultura 2 vezes 10 a 5ª células por mililitro com meio normal ou meio contendo fármaco em um prato de 35 milímetros acarpetado com placas de vidro por 24 horas a 37 graus Celsius, com uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% e 70 a 80% de umidade relativa.Ligue o extrator da micropipeta e pré-aqueça por 30 minutos. Em seguida, coloque um capilar de vidro borossilicato com um filamento no puxador de micropipeta. Selecione o programa e clique em Enter no painel de controle.Clique no programa de rampa no canto superior direito para determinar o valor de calor do capilar de vidro. Escreva o programa para puxar o eletrodo de acordo com o valor determinado pelo teste de rampa e clique em puxar para começar a fabricar as pipetas. Ligue o conversor analógico digital, o amplificador de sinal, o micromanipulador, o microscópio e a câmera.Abra o aplicativo de imagem, o software amplificador de sinal e o software de aquisição de dados em sequência. Clique em adquirir e selecionar o protocolo de edição no software de aquisição de dados. Edite o programa na interface de forma de onda.Insira valores para primeiro nível, nível delta, primeira duração e duração delta para a época A, a época B e a época C.Em seguida, clique na interface de taxa de modo e defina os dados da hierarquia de avaliação. Em seguida, clique em editar protocolo para selecionar o botão de estímulo e defina o programa de subtração de vazamento na caixa de diálogo de subtração de vazamento PM. Para estabelecer o caminho de armazenamento de dados, clique em arquivo e selecione definir nomes de arquivo de dados no software de aquisição de dados.Em seguida, abra o protocolo lKv estabelecido selecionando adquirir e clicando em protocolo aberto no software de aquisição de dados. Finalmente, clique na opção ferramentas e selecione teste de membrana para começar a executar o protocolo. Adicionar a solução extracelular ao banho celular no aparelho de fixação de colchões de células inteiras e colocar a tampa deslizada para cima com as células H9C2 no banho.Encher 30% da pipeta com a solução extracelular e instalá-la no suporte do eléctrodo de gravação integrado no aparelho patch-praçadeira. Aperte a pipeta com o suporte do eléctrodo de gravação. Em seguida, solte a pipeta no banho com o micromanipulador.Clique na interface de deslocamento da pipeta do software do amplificador de sinal para manter a linha de base da corrente lKv em zero picoamps. Descarregue uma pressão positiva adequada manualmente com uma seringa de 1,0 mililitros, ligada ao suporte do elétrodo de gravação, através de um tubo de plástico. Mova ligeiramente a pipeta manipulando o micromanipulador em três dimensões para entrar em contacto com a célula.Uma vez que a membrana testa a onda quadrada cai de um terço a meio depois que a pipeta toca a membrana celular, remova a pressão positiva e entregue manualmente uma pressão negativa apropriada. Em seguida, clique na interface de patch do software de aquisição de dados para formar o gigaseal. Use o software de amplificador de sinal lento de compensação de capacitância rápida e compensação de capacitância durante o teto da célula para compensar a capacitância rápida e lenta.Aplique breves pulsos de pressão negativa para romper um pedaço da membrana celular. Execute a compensação da capacitância da membrana de célula inteira clicando no botão de célula inteira do software do amplificador de sinal. Por fim, salve e registre os dados, clicando no botão de gravação de dados.Abra os dados lKv salvos com o software de análise de dados. Salve as relações de tensão de corrente. Clique em analisar para selecionar estatísticas.Selecione o intervalo como Cursores 1 2 para análise de dados, clique nos botões de amplitude de pico e média e, em seguida, clique em OK para visualizar os dados na página de resultados. Finalmente, copie a coluna de dados médios lKv no software de desenho de funções para análise posterior. Salve os rastreamentos de corrente lKv representativos.Clique em editar para selecionar os rastreamentos de transferência e, em seguida, selecione o rastreamento completo na região a ser transferida. Em seguida, clique em selecionar na seleção de rastreamento e selecione IN 0 em sinais. Finalmente, clique em OK para visualizar os dados na página de resultados e copie os dados totais para o software de desenho de funções para desenhar os traços atuais.Salve o protocolo lKv. Clique em editar para selecionar criar sinal de forma de onda de estímulo e selecione ok. Em seguida, repita a etapa para desenhar traços de corrente sem selecionar o sinal.O lKv foi desencadeado por 150 milissegundos de estímulo de pulso despolarizante de menos 40 a mais 60 milivolts com potencial de retenção de menos 60 milivolts. O lKv dos cardiomiócitos de ratos H9C2 apareceu pela primeira vez em torno de menos 20 milivolts e, em seguida, a amplitude aumentou com mais despolarização. Em comparação com o grupo controle, a amplitude do lKv foi observavelmente reduzida após os cinco minutos de tratamento com 4-PA 1,5 milimolar.Além disso, o lKv diminuiu significativamente nos potenciais de membrana de 10 para 60 milivolts de forma dose-dependente, após o tratamento AC de 24 horas. A célula individual após o canal iônico de gravação pode ser usada para avaliação ômica adicional de célula única, como genômica de célula única, transcriptômica, proteômica e metabolômica.

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