Name: voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique at JoVE.com

Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82130113) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo y Transformación del Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Qinghai (2020-SF-C33).

Los cardiomiocitos de rata H9c2 obtenidos comercialmente (ver la Tabla de materiales) se incubaron en DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C en una atmósfera humidificada deCO2 al 5%. La técnica de patch-clamp de células enteras se empleó para detectar los cambios en IKv en células H9c2 normales y células tratadas con 4-AP o CA (Figura 1 y Figura 2</st...

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Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).</li><li>Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+and+perforated+patch-clamp+recordings+from+acutely-isolated+murine+sinoatrial+node+cells.">Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells.</a> Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).</li><li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. 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La técnica electrofisiológica patch-clamp se utiliza principalmente para registrar y reflejar la actividad eléctrica y las características funcionales de los canales iónicos en la membrana celular25. En la actualidad, los principales métodos de grabación de la técnica patch-clamp incluyen la grabación de un solo canal y la grabación de célulascompletas 26. Para el modo de celda completa, el microelectrodo de vidrio y la presión negativa se utilizan para formar u...

Los canales iónicos son proteínas integradas especiales incrustadas en la bicapa lipídica de la membrana celular. En presencia de activadores, los centros de tales proteínas integradas especiales forman poros hidrófilos altamente selectivos, permitiendo que iones de un tamaño y carga apropiados pasen a través de una manera de transporte pasivo1. Los canales iónicos son la base de la excitabilidad celular y la bioelectricidad y desempeñan un papel clave en una variedad de actividades celulares2. El corazón suministra sangre a otros órganos a través de contracciones regulares resultantes de un proceso acoplado excitación-contracción iniciado por potenciales de acción3. Estudios previos han confirmado que la generación de potenciales de acción en los cardiomiocitos es causada por el cambio en la concentración de iones intracelulares, y la activación e inactivación de los canales iónicos Na+, Ca2+ y K+ en los cardiomiocitos humanos conducen a la formación de potenciales de acción en una cierta secuencia 4,5,6. Las corrientes alteradas del canal de potasio (Kv) dependientes de voltaje (IKv) podrían cambiar el ritmo cardíaco normal, lo que lleva a arritmias, que son una de las principales causas de muerte. Por lo tanto, el registro del IKv es crítico para comprender los mecanismos de los fármacos para el tratamiento de arritmias potencialmente mortales7.
El canal Kv es un componente importante del canal de potasio. La función de coordinación del canal Kv juega un papel importante en la actividad eléctrica y la contractilidad miocárdica del corazón de los mamíferos 8,9,10. En los cardiomiocitos, la amplitud y la duración de los potenciales de acción dependen de la coconducción de las corrientes K+ hacia el exterior por múltiples subtipos de canales Kv11. La regulación de la función del canal Kv es muy importante para la repolarización normal del potencial de acción cardíaco. Incluso el más mínimo cambio en la conductancia del Kv afecta en gran medida la repolarización cardíaca y aumenta la posibilidad de arritmia12,13.
Representando un método fundamental en la investigación electrofisiológica celular, se puede establecer un sello de alta resistencia entre un área pequeña de la membrana celular y una punta de pipeta para el registro de pinza de parche de células enteras aplicando una presión negativa. La presión negativa continua hace que la membrana celular entre en contacto con la punta de la pipeta y se adhiera a la pared interna de la pipeta. El circuito eléctrico completo resultante permite registrar cualquier corriente de canal iónico a través de la superficie de la membrana celular14. Esta técnica tiene una sensibilidad muy alta para la corriente del canal iónico de la membrana celular y se puede utilizar para detectar corrientes en todos los canales iónicos, y las aplicaciones son extremadamente amplias15. Además, en comparación con el etiquetado fluorescente y el etiquetado radiactivo, la pinza de parche tiene mayor autoridad y precisión16. En la actualidad, se ha utilizado la técnica de patch-clamp de células enteras para detectar los componentes de la medicina tradicional china que actúan sobre las corrientes del canal Kv17,18,19. Por ejemplo, Wang et al. utilizaron la técnica de patch-clamp de células enteras y confirmaron que el componente efectivo de la semilla de loto podría lograr la inhibición del canal Kv4.3 bloqueando los canales de estado activado19. La aconitina (AC) es uno de los ingredientes efectivos y activos de las especies de Aconitum, como Aconitum carmichaeli Debx y Aconitum pendulum Busch. Numerosos estudios han demostrado que las sobredosis de CA pueden causar arritmias e incluso paro cardíaco20. La interacción entre la CA y los canales iónicos dependientes de voltaje conduce a la interrupción de la homeostasis iónica intracelular, que es el mecanismo clave de la cardiotoxicidad21. Por lo tanto, en este estudio, se utiliza la técnica de patch-clamp de células enteras para determinar los efectos de AC en el IKv de los cardiomiocitos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ2184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitine</td>
			<td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td>
			<td>DSTDW000602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP Na2</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>416O022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>163225-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>1192022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>3012022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices, LLC.</td>
			<td>Version 10. 6. 0. 13</td>
			<td>data acqusition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>RH289133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>Axon digidata 1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8121587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>EZ6789D115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2166090RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 cells</td>
			<td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CL0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImageLive</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>4.5.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td>2106081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd</td>
			<td>20210221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020082501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2020112601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td>
			<td>20160408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021020101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (20 &#215; 20 mm)</td>
			<td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd</td>
			<td>80340-0630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td>
			<td>Milli-Q IQ 7005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B commander</td>
			<td>Axon Instrument</td>
			<td>MultiClamp commander 2.0</td>
			<td>signal-amplifier software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>17C18B16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH&#160;meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S201K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>J210045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-dependent potassium current recording on h9c2 cardiomyocytes via the whole-cell patch-clamp technique

Los canales de potasio en la membrana celular miocárdica juegan un papel importante en la regulación de las actividades electrofisiológicas celulares. Al ser uno de los principales canales iónicos, los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) están estrechamente asociados con algunas enfermedades cardíacas graves, como el daño miocárdico inducido por medicamentos y el infarto de miocardio. En el presente estudio, se empleó la técnica de patch-clamp de células enteras para determinar los efectos de 1,5 mM 4-aminopiridina (4-AP, un inhibidor de los canales de potasio de amplio espectro) y aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM y 200 μM) sobre la corriente del canal Kv (IKv) en cardiomiocitos H9c2. Se encontró que la 4-AP inhibió el I Kv en aproximadamente un 54%, mientras que el efecto inhibitorio de la CA sobre el IKv mostró una tendencia dependiente de la dosis (ningún efecto para 25 μM, tasa inhibitoria del 30% para 50 μM, tasa inhibitoria del 46% para 100 μM y tasa inhibitoria del 54% para 200 μM). Debido a las características de mayor sensibilidad y precisión, esta técnica promoverá la exploración de la cardiotoxicidad y los efectos farmacológicos de la etnomedicina dirigida a los canales iónicos.

Este protocolo permitió el registro del IKv de acuerdo con los parámetros establecidos en la técnica de patch-clamp de células enteras. El IKv fue activado por 150 ms de estímulo de pulso despolarizante de -40 a +60 mV a un potencial de retención de -60 mV (Figura 3A). El IKv de los cardiomiocitos de rata H9c2 apareció por primera vez alrededor de -20 mV, y luego la amplitud aumentó con una mayor despolarización. La relación media entre el IKv<...

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Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

El presente protocolo describe un método eficiente para la adquisición dinámica y en tiempo real de corrientes de canal de potasio (Kv) dependientes de voltaje en cardiomiocitos H9c2 utilizando la técnica de pinza de parche de células enteras.

Registro de corriente de potasio dependiente del voltaje en cardiomiocitos H9c2 mediante la técnica de pinza de parche de células enteras

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Este protocolo registra con éxito los efectos de la aconitina en el IKv de las células H9C2. Promover nuevas fases para investigar el mecanismo de cardiotoxicidad de los fármacos desde la perspectiva de los canales iónicos. La técnica de pinza de parche de células enteras es el estándar de oro de la investigación del canal iónico con alta sensibilidad, alta precisión y alta especificidad.La técnica de patch-clamp de células enteras se puede emplear para explorar los mecanismos farmacológicos o tóxicos de la yuxta-gating de canales iónicos específicos para enfermedades multisistémicas, como el sistema cardiovascular y el sistema nervioso. Para comenzar, digiera las células con 0,25% de tripsina durante 30 segundos, una vez que la placa de cultivo de H9C2 se convierta en 80% confluente. Cultivo de 2 veces 10 a 5 células por mililitro con medio normal o medio que contiene fármaco en un plato de 35 milímetros alfombrado con placas de vidrio durante 24 horas a 37 grados centígrados, con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 70 a 80% de humedad relativa.Encienda el extractor de micropipetas y precaliente durante 30 minutos. Luego coloque un capilar de vidrio de borosilicato con un filamento en el extractor de micropipetas. Seleccione el programa y haga clic en enter en el panel de control.Haga clic en el programa de rampa en la esquina superior derecha para determinar el valor de calor del capilar de vidrio. Escriba el programa para tirar del electrodo de acuerdo con el valor determinado por la prueba de rampa y haga clic en tirar para comenzar a fabricar las pipetas. Encienda el convertidor analógico digital, el amplificador de señal, el micromanipulador, el microscopio y la cámara.Abra la aplicación de imágenes, el software del amplificador de señal y el software de adquisición de datos en secuencia. Haga clic en adquirir y seleccione editar protocolo en el software de adquisición de datos. Edite el programa en la interfaz de forma de onda.Introduzca los valores para el primer nivel, el nivel delta, la primera duración y la duración delta para la época A, la época B y la época C.A continuación, haga clic en la interfaz de velocidad de modo y establezca los datos de la jerarquía de prueba. A continuación, haga clic en editar protocolo para seleccionar el botón de estímulo y establecer el programa de sustracción de fugas en el cuadro de diálogo de sustracción de fugas de PM. Para establecer la ruta de almacenamiento de datos, haga clic en archivo y seleccione establecer nombres de archivos de datos en el software de adquisición de datos.Luego abra el protocolo lKv establecido seleccionando adquirir y haciendo clic en abrir protocolo en el software de adquisición de datos. Finalmente, haga clic en la opción herramientas y seleccione prueba de membrana para comenzar a ejecutar el protocolo. Agregue la solución extracelular al baño celular en el aparato de abrazadera de parche de células enteras y coloque el deslizamiento de la cubierta hacia arriba con las células H9C2 en el baño.Llene el 30% de la pipeta con la solución extracelular e instálela en el soporte del electrodo de registro integrado en el aparato de sujeción de parche. Apriete la pipeta con el soporte del electrodo de grabación. A continuación, deje caer la pipeta en el baño con el micromanipulador.Haga clic en la interfaz de desplazamiento de pipeta del software del amplificador de señal para mantener la línea de base de corriente lKv en cero picoamperios. Administre manualmente una presión positiva adecuada con una jeringa de 1,0 mililitros, conectada al soporte del electrodo de grabación, a través de un tubo de plástico. Mueva ligeramente la pipeta manipulando el micromanipulador en tres dimensiones para entrar en contacto con la célula.Una vez que la membrana prueba las caídas de onda cuadrada de un tercio a la mitad después de que la pipeta toque la membrana celular, elimine la presión positiva y administre manualmente una presión negativa adecuada. Luego haga clic en la interfaz de parche del software de adquisición de datos para formar el gigaseal. Utilice el software amplificador de señal lenta de compensación de capacitancia rápida y compensación de capacitancia lenta durante el techo de la celda para compensar la capacitancia rápida y lenta.Aplique pulsos breves de presión negativa para romper un parche de la membrana celular. Ejecute la compensación de capacitancia de membrana de toda la célula haciendo clic en el botón de celda completa del software del amplificador de señal. Finalmente, guarde y grabe los datos, haciendo clic en el botón de grabación de datos.Abra los datos lKv guardados con el software de análisis de datos. Guarde las relaciones de voltaje de corriente. Haga clic en analizar para seleccionar estadísticas.Seleccione el rango como Cursores 1 2 para el análisis de datos, haga clic en los botones amplitud máxima y media y, a continuación, haga clic en aceptar para ver los datos en la página de resultados. Finalmente, copie la columna de datos medios de lKv en el software de dibujo de funciones para su posterior análisis. Guarde las trazas de corriente representativas de lKv.Haga clic en editar para seleccionar los rastros de transferencia, luego seleccione el rastreo completo en la región para transferir. A continuación, haga clic en seleccionar en la selección de traza y seleccione IN 0 en las señales. Finalmente, haga clic en aceptar para ver los datos en la página de resultados y copie los datos totales en el software de dibujo de funciones para dibujar los trazos actuales.Guarde el protocolo lKv. Haga clic en editar para seleccionar crear señal de forma de onda de estímulo y seleccione OK. A continuación, repita el paso para dibujar trazas de corriente sin seleccionar la señal.El lKv fue activado por 150 milisegundos de estímulo de pulso despolarizante de menos 40 a más 60 milivoltios a un potencial de retención de menos 60 milivoltios. El lKv de los cardiomiocitos de rata H9C2, apareció por primera vez alrededor de menos 20 milivoltios, y luego la amplitud aumentó con una mayor despolarización. En comparación con el grupo control, la amplitud del lKv se redujo notablemente después de los cinco minutos de tratamiento con 1,5 milimolar 4-AP.Además, el lKv disminuyó significativamente a potenciales de membrana de 10 a 60 milivoltios de una manera dependiente de la dosis, después del tratamiento de CA de 24 horas. La célula individual después de registrar el canal iónico, se puede utilizar para evaluar otras ómicas unicelulares, como la genómica de una sola célula, la transcriptómica, la proteómica y la metabolómica.

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