Name: testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing at JoVE.com

M.J.M. erkent de steun van een Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) Director's New Innovator Award (DP2 TR002776), een Burroughs Wellcome Fund Career Award bij de Scientific Interface (CASI), een US National Science Foundation CAREER Award (CBET-2145491) en aanvullende financiering van de National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 en NIDDK R01 DK123049).

NOTITIE: Handhaaf altijd RNase-vrije omstandigheden bij het formuleren van mRNA-LNP's door de oppervlakken en apparatuur af te vegen met een oppervlakteontsmettingsmiddel voor RNases en DNA. Gebruik alleen RNasevrije tips en reagentia.
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren aan de Universiteit van Pennsylvania en een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de ...

<ol>
	<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+organ+targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing.">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis.">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).</li><li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+patisiran,+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis.">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li><li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device.">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery:+Applications+in+cancer+immunotherapy.">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li><li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides.">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li><li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening.">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li><li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3.">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver.">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li><li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids.">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).</li><li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA.">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983 (2020).</li><li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA.">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li><li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+(LNPs)+designed+for+oligonucleotide+delivery.">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals.">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).</li><li>Granot, Y., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+right+message:+Challenges+and+opportunities+in+lipid+nanoparticles-mediated+modified+mRNA+therapeutics-An+innate+immune+system+standpoint.">Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint.</a> Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+containing+constrained+phospholipids+deliver+mRNA+to+liver+immune+cells+in+vivo+without+targeting+ligands.">Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).</li><li>Patel, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells.">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li><li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis.">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li><li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-like+materials+for+low-dose,+in+vivo+gene+silencing.">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering.">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li><li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy.">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li><li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core.">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells.">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li><li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice.">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications.">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li><li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes.">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+CRISPR/Cas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing.">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency.">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I.">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).</li><li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey.">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li><li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes.">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).</li><li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system.">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).</li><li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy.">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li><li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery.">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Tomb&#225;cz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CD4++T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4++cell-homing+mRNA-LNPs.">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation.">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li><li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells.">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li></ol>

Met deze workflow kan een verscheidenheid aan mRNA-LNP's worden geformuleerd en getest op hun in vitro en in vivo efficiëntie. Ioniseerbare lipiden en hulpstoffen kunnen worden verwisseld en gecombineerd met verschillende molaire verhoudingen en verschillende ioniseerbare lipide-mRNA-gewichtsverhoudingen om mRNA-LNP's te produceren met verschillende fysisch-chemische eigenschappen22. Hier formuleerden we C12-200 mRNA-LNP's met een molaire verhouding van 35/16/46,5/2,5 (ioniseerb...

Lipide nanodeeltjes (LNP's) zijn de afgelopen jaren veelbelovend gebleken op het gebied van niet-virale gentherapie. In 2018 keurde de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) het allereerste RNA-interferentietherapeutisch middel (RNAi), Onpattro van Alnylam, goed voor de behandeling van erfelijke transthyretine-amyloïdose 1,2,3,4. Dit was een belangrijke stap voorwaarts voor lipide nanodeeltjes en RNA-gebaseerde therapieën. Meer recentelijk ontvingen Moderna en Pfizer/BioNTech FDA-goedkeuringen voor hun mRNA-LNP-vaccins tegen SARS-CoV-2 4,5. In elk van deze op LNP gebaseerde nucleïnezuurtherapieën dient de LNP om zijn lading te beschermen tegen afbraak door nucleasen en om krachtige intracellulaire afgifte te vergemakkelijken 6,7. Hoewel LNP's succes hebben geboekt in RNAi-therapieën en vaccintoepassingen, zijn mRNA-LNP's ook onderzocht voor gebruik in eiwitvervangende therapieën8 en voor de gelijktijdige afgifte van Cas9-mRNA en gids-RNA voor de levering van het CRISPR-Cas9-systeem voor genbewerking9. Er is echter niet één specifieke formulering die geschikt is voor alle toepassingen, en subtiele veranderingen in de LNP-formuleringsparameters kunnen de potentie en biodistributie in vivo sterk beïnvloeden 8,10,11. Individuele mRNA-LNP's moeten dus worden ontwikkeld en geëvalueerd om de optimale formulering voor elke op LNP gebaseerde therapie te bepalen.
LNP's worden gewoonlijk geformuleerd met vier lipidecomponenten: een ioniseerbaar lipide, een fosfolipide, cholesterol en een lipide-verankerd polyethyleenglycol (PEG)-conjugaat (lipide-PEG)11,12,13. De krachtige intracellulaire afgifte die door LNP's wordt gefaciliteerd, is gedeeltelijk afhankelijk van de ioniseerbare lipidecomponent12. Deze component is neutraal bij fysiologische pH, maar wordt positief geladen in de zure omgeving van het endosoom11. Deze verandering in ionische lading wordt verondersteld een belangrijke bijdrage te leveren aan endosomale ontsnapping12,14,15. Naast het ioniseerbare lipide verbetert de fosfolipidecomponent (helperlipide) de inkapseling van de lading en helpt bij endosomale ontsnapping, het cholesterol biedt stabiliteit en verbetert de membraanfusie, en de lipide-PEG minimaliseert LNP-aggregatie en opsonisatie in circulatie10,11,14,16. Om het LNP te formuleren, worden deze lipidecomponenten gecombineerd in een organische fase, meestal ethanol, en gemengd met een waterige fase die de nucleïnezuurlading bevat. Het LNP-formuleringsproces is zeer veelzijdig omdat het het mogelijk maakt om verschillende componenten gemakkelijk te vervangen en te combineren in verschillende molaire verhoudingen om veel LNP-formuleringen te formuleren met een veelheid aan fysisch-chemische eigenschappen10,17. Bij het verkennen van deze grote verscheidenheid aan LNP's is het echter van cruciaal belang dat elke formulering wordt geëvalueerd met behulp van een gestandaardiseerde procedure om de verschillen in karakterisering en prestaties nauwkeurig te meten.
Hier wordt de volledige workflow voor de formulering van mRNA-LNP's en de beoordeling van hun prestaties in cellen en dieren geschetst.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 M Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Slip Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A52976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate, 1 Kilogram</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>&#160;631-61-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Citrate dibasic</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-200 Ionizable Lipid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>36699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>L-7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L2916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel Insulin Syringes - 0.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1484132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep G2 [HEPG2]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Instrument</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>Q2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter Lysis 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7601-54-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing

Lipide nanodeeltjes (LNP's) hebben de laatste tijd veel aandacht getrokken met de succesvolle ontwikkeling van de COVID-19 mRNA-vaccins door Moderna en Pfizer/BioNTech. Deze vaccins hebben de werkzaamheid van mRNA-LNP-therapieën aangetoond en de deur geopend voor toekomstige klinische toepassingen. In mRNA-LNP-systemen dienen de LNP's als leveringsplatforms die de mRNA-lading beschermen tegen afbraak door nucleasen en hun intracellulaire afgifte bemiddelen. De LNP's bestaan doorgaans uit vier componenten: een ioniseerbaar lipide, een fosfolipide, cholesterol en een lipide-verankerd polyethyleenglycol (PEG)-conjugaat (lipide-PEG). Hier worden LNP's die mRNA inkapselen dat codeert voor vuurvliegluciferase geformuleerd door microfluïdische menging van de organische fase met LNP-lipidecomponenten en de waterige fase die mRNA bevat. Deze mRNA-LNP's worden vervolgens in vitro getest om hun transfectie-efficiëntie in HepG2-cellen te evalueren met behulp van een bioluminescente plaatgebaseerde test. Bovendien worden mRNA-LNP's in vivo geëvalueerd bij C57BL/6-muizen na een intraveneuze injectie via de laterale staartader. Bioluminescentiebeeldvorming van het hele lichaam wordt uitgevoerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem. Representatieve resultaten worden getoond voor de mRNA-LNP-kenmerken, hun transfectie-efficiëntie in HepG2-cellen en de totale luminescente flux in C57BL/6-muizen.

mRNA-LNP's werden geformuleerd met behulp van een microfluïdisch instrument met een gemiddelde hydrodynamische diameter van 76,16 nm en een polydispersiteitsindex van 0,098. De pKa van de mRNA-LNP's bleek 5,75 te zijn door een TNS-test18 uit te voeren. De inkapselingsefficiëntie voor deze mRNA-LNP's werd berekend op 92,3% met behulp van de gemodificeerde fluorescentietest en vergelijking 4.4. De totale RNA-concentratie die werd gebruikt voor de celbehandeling...

Watch this Scientific Journal Video about Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing at JoVE.com

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het formuleren van lipide nanodeeltjes (LNP's) die mRNA inkapselen dat codeert voor vuurvliegluciferase. Deze LNP's werden in vitro getest op hun werkzaamheid in HepG2-cellen en in vivo in C57BL/6-muizen.

Testen van de in vitro en in vivo efficiëntie van mRNA-lipide nanodeeltjes geformuleerd door microfluïdische menging

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

Dit protocol kan worden gebruikt om consistente lipide nanodeeltjes te formuleren die MRA inkapselen. De formuleringsparameters kunnen worden afgestemd en de verschillende lipide nanodeeltjes kunnen worden geëvalueerd op hun potentie en biodistributie. Een gestandaardiseerd protocol voor de formulering van lipide-nanodeeltjes en in-vitro- en in-vivotests kan worden gebruikt om consistente lipide-nanodeeltjes te formuleren die met elkaar kunnen worden vergeleken.Er zijn veel kleine details om in gedachten te houden bij het formuleren en evalueren van de potentie van nanodeeltjes, maar welke details zijn verantwoordelijk? Het bereiden van de formulering zou niet moeilijk moeten zijn. Begin met het vullen van een schone beker van vier liter met 200 tot 300 milliliter verse 10X PBS en verdun deze tot 1X met ultrapuur water.Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van PBS tussen de twee en drie liter ligt. Plaats dialysecassettes met de juiste capaciteit voor het lipide-nanodeeltje, of LNP-formulering, in de veldbeker. Maak de tienvoudige verdunning van een 100 millimolaire citroenzuurbuffervoorraad met behulp van ultrapuur water om een 10 millimolaire citroenzuurbuffer te creëren voor mRNA-verdunning.Maak vervolgens C 12 200 ioniseerbare lipiden, helperlipiden, cholesterol en lipideverankerde PEG- of lipide PEG-voorraadoplossingen door elk lipide op te lossen in 100% ethanol. Zorg ervoor dat de voorraadoplossingen volledig zijn opgelost door ze te verwarmen en te mengen bij 37 graden Celsius. Combineer de berekende volumes van de verschillende lipidecomponenten in een conische buis.Verdun de lipiden met 100% ethanol tot het uiteindelijke volume van V, wat overeenkomt met 25% van het uiteindelijke volume van LNP. Bereken de hoeveelheid mRNA die nodig is voor formulering op basis van de ioniseerbare lipide-mRNA-gewichtsverhouding en het totale volume mRNA-LNP. Ontdooi vervolgens de vuurvlieg luciferase die codeert voor mRNA op ijs.Verdun vervolgens het mRNA tot een eindvolume dat driemaal zo hoog is als de organische fase met behulp van de 10 millimolaire citroenzuurbuffer. Spuit een delicaat taakdoekje met een oppervlakteontsmetting voor RNA's en DNA en veeg de binnenkant van het microfluïdische instrument grondig schoon. Open vervolgens een nieuwe microfluïdische cartridge en plaats deze met de inlaatkanalen naar beneden en van elkaar af.Plaats twee steriele conische buisjes van 15 milliliter op de houder met de doppen eraf. Als u klaar bent, vult u een spuit van vijf milliliter met de mRNA-oplossing die mRNA bevat, verdund in een citroenzuurbuffer van 10 millimolair. Vul vervolgens een injectiespuit van drie milliliter met de lipidenoplossing met daarin de lipiden verdund in 100% ethanol.Zorg ervoor dat u alle lucht uit de spuiten verwijdert. Steek vervolgens zonder de naald de spuit van vijf milliliter met de mRNA-oplossing in de linkerinlaat van de cartridge en steek de spuit van drie milliliter met de lipideoplossing in de rechterinlaat van de cartridge. Schakel het microfluïdische instrument in en selecteer snel uitvoeren.Nadat u de juiste spuittypes hebt geselecteerd voor de ingebrachte spuiten van vijf en drie milliliter, voert u de parameters voor LNP-formulering in met een verhouding van drie op één waterig tot organisch debiet, voordat u op de startknop drukt om de mRNA-LNP's te formuleren. Laad de mRNA-LNP's die in de rechter conische buis zijn verzameld met een injectiespuit in de eerder gehydrateerde dialysecassettes zonder het cassettemembraan aan te prikken of aan te raken, plaats de dialysecassettes met de mRNA-LNP's terug in het bekerglas met PBS en laat ze ten minste twee uur dialyseren. Breng na de dialyse de dialysecassettes met de mRNA-LNP's in een steriele bioveiligheidskast en verwijder de mRNA-LNP's met behulp van een spuit met een naald.Filter de mRNA-LNP's steriel met behulp van een spuitfilter van 0,22 micrometer en vang ze op in een steriele conische buis. Plaats vervolgens 65 microliter van de mRNA-LNP-oplossing in een microbuis van 1,5 milliliter voor karakterisering. Plaat 5, 000 HepG2-cellen in een witte wand, heldere bodem, 96-wells plaat in 100 microliter compleet celkweekmedium en incubeer de cellen 's nachts in een gecontroleerde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Verwijder voor de behandeling van cellen met mRNA-LNP's het volledige medium uit de putjes. Behandel de cellen vervolgens met ofwel 100 microliter mRNA-LNP's verdund in compleet celkweekmedium in de gewenste doses, ofwel 100 microliter compleet medium vóór een incubatie van 24 uur. Verwijder na incubatie het celkweekmedium van de plaat met 96 putjes, voeg 20 microliter lysisbuffer toe aan elk putje, gevolgd door 100 microliter van de luciferase-testreagentia.Bescherm de plaat tegen licht en plaats de plaat in een plaatlezer om het bioluminescente signaal te meten. Verdun de mRNA-LNP-oplossing met behulp van steriele PBS zodat twee microgram totaal mRNA aanwezig is in 100 microliter van het injectievolume van de staartader. Vul een insulinespuit van 29 gauge met 100 microliter mRNA-LNP of 100 microliter PBS en verwijder eventuele luchtbellen uit de spuit.Steek de naald met de schuine kant naar boven in de laterale staartader van de muis en injecteer langzaam de 100 microliter mRNA-LNP of PBS. Bereid zes uur na injectie een 15 milligram per milliliter voorraadoplossing van D-Luciferine-kaliumzout in steriele PBS. Selecteer in de beeldvormingssoftware voor het in-vivobeeldvormingssysteem, of IVIS, het vakje naast luminescentie voordat u op initialiseren drukt om het instrument voor te bereiden op gegevensverzameling.Dien vervolgens 200 microliter D-Luciferine intraperitonealie toe aan de eerder behandelde muizen en wacht 10 minuten terwijl het luciferasesignaal stabiliseert voordat de muizen worden verdoofd. Breng de verdoofde muizen over naar de neuskegels in het in vivo beeldvormingssysteem en zorg ervoor dat ze op hun rug liggen met hun buik bloot, voordat ze de kamerdeur sluiten. Zorg er in de beeldvormingssoftware voor dat het juiste gezichtsveld is geselecteerd en stel de belichtingstijd in op automatisch, klik op de knop Verkrijgen in de software om bioluminescentiebeelden te verkrijgen.De inkapselingsefficiëntie van de mRNA-LNP's werd bepaald als 92,3% met behulp van de gemodificeerde fluorescentietest en -vergelijking die hier worden getoond. Toenemende bioluminescentie werd waargenomen bij behandeling van 5.000 HepG2-cellen met toenemende doses mRNA-LNP. Luciferase-expressie werd gemakkelijk gedetecteerd bij de laagste dosis van deze studie van vijf nanogram per putje.Een sterk bioluminescentiesignaal werd waargenomen in de bovenbuik van de muizen die werden behandeld met geformuleerde LNP's. Interessegebieden werden rond de leversignalen getekend om de totale luminescente flux te berekenen. De totale lichtstroom was ongeveer vijf keer 10 tot de 9e.Handhaaf altijd de gewichtsverhouding tussen ioniseerbare lipiden en nucleïnezuren bij het formuleren van LNP's. Elk volume van de organische fase moet ioniseerbaar lipide bevatten dat overeenkomt met mRNA in drie volumes van de waterige fase.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusie Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kwantificering van Global diastolische functie door Kinematisch Modeling-gebaseerde analyse van transmitraal Flow via de Geparameteriseerde diastolische Vullen formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Het analyseren van Mengen Inhomogeniteit in een microfluïdische apparaat door Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Productie van Metaal Nanoparticles door Pulsed Laser Ablation in Liquids: Een Tool voor het bestuderen van de Antibacteriële Eigenschappen van Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Stijve inbedding van vaste en gekleurd, geheel Millimeter-schaal Specimens voor sectie-gratis 3D histologie door Micro-berekend tomografie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...