Name: testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing at JoVE.com

M.J.M. reconnaît le soutien d’un prix du directeur des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis (DP2 TR002776), d’un Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), d’un prix CAREER de la National Science Foundation des États-Unis (CBET-2145491) et d’un financement supplémentaire des National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 et NIDDK R01 DK123049).

REMARQUE : Maintenez toujours des conditions exemptes de RNase lors de la formulation de RNm-LNP en essuyant les surfaces et l’équipement avec un décontaminant de surface pour les RNases et l’ADN. N’utilisez que des embouts et des réactifs sans RNase.
Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Pennsylvanie et à un protocole approuvé par le Com...

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	<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+organ+targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing.">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis.">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).</li><li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+patisiran,+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis.">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li><li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device.">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery:+Applications+in+cancer+immunotherapy.">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li><li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides.">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li><li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening.">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li><li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3.">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver.">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li><li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids.">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).</li><li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA.">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983 (2020).</li><li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA.">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li><li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+(LNPs)+designed+for+oligonucleotide+delivery.">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals.">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).</li><li>Granot, Y., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+right+message:+Challenges+and+opportunities+in+lipid+nanoparticles-mediated+modified+mRNA+therapeutics-An+innate+immune+system+standpoint.">Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint.</a> Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+containing+constrained+phospholipids+deliver+mRNA+to+liver+immune+cells+in+vivo+without+targeting+ligands.">Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).</li><li>Patel, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells.">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li><li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis.">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li><li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-like+materials+for+low-dose,+in+vivo+gene+silencing.">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering.">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li><li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy.">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li><li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core.">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells.">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li><li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice.">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications.">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li><li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes.">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+CRISPR/Cas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing.">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency.">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I.">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).</li><li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey.">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li><li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes.">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).</li><li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system.">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).</li><li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy.">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li><li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery.">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Tomb&#225;cz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CD4++T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4++cell-homing+mRNA-LNPs.">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation.">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li><li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells.">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li></ol>

Grâce à ce flux de travail, une variété d’ARNm-LNP peuvent être formulés et testés pour leur efficacité in vitro et in vivo. Les lipides et les excipients ionisables peuvent être échangés et combinés à différents rapports molaires et à différents rapports de poids lipides/ARNm ionisables pour produire des ARNm-LNP ayant des propriétés physico-chimiques différentes22. Ici, nous avons formulé des ARNm-LNP C12-200 avec un rapport molaire de 35/16/46,5/2,5 (lipi...

Les nanoparticules lipidiques (LNP) se sont révélées très prometteuses ces dernières années dans le domaine de la thérapie génique non virale. En 2018, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a approuvé le tout premier traitement d’interférence ARN (ARNi), Onpattro d’Alnylam, pour le traitement de l’amylose héréditaire à transthyrétine 1,2,3,4. Il s’agit d’une avancée importante pour les nanoparticules lipidiques et les thérapies à base d’ARN. Plus récemment, Moderna et Pfizer/BioNTech ont reçu l’approbation de la FDA pour leurs vaccins à ARNm-LNP contre le SRAS-CoV-2 4,5. Dans chacune de ces thérapies à base d’acides nucléiques à base de LNP, le LNP sert à protéger sa cargaison de la dégradation par les nucléases et à faciliter une administration intracellulaire puissante 6,7. Alors que les LNP ont connu du succès dans les thérapies à base d’ARNi et les applications vaccinales, les ARNm-LNP ont également été explorés pour une utilisation dans les thérapies de remplacement des protéines8 ainsi que pour la co-livraison de l’ARNm Cas9 et de l’ARN guide pour l’administration du système CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes9. Cependant, il n’existe pas de formulation spécifique qui convienne à toutes les applications, et des changements subtils dans les paramètres de formulation du LNP peuvent grandement affecter la puissance et la biodistribution in vivo 8,10,11. Ainsi, des ARNm-LNP individuels doivent être développés et évalués afin de déterminer la formulation optimale pour chaque thérapie à base de LNP.
Les LNP sont généralement formulés avec quatre composants lipidiques : un lipide ionisable, un phospholipide, du cholestérol et un conjugué polyéthylène-glycol (PEG) ancré dans les lipides (lipide-PEG)11,12,13. La puissante délivrance intracellulaire facilitée par les LNP repose, en partie, sur le composant lipidique ionisable12. Ce composant est neutre au pH physiologique mais se charge positivement dans l’environnement acide de l’endosome11. On pense que ce changement de charge ionique est un contributeur clé à l’échappement endosomal12,14,15. En plus du lipide ionisable, le composant phospholipide (lipide auxiliaire) améliore l’encapsulation de la cargaison et aide à l’échappement endosomal, le cholestérol offre une stabilité et améliore la fusion membranaire, et le lipide-PEG minimise l’agrégation et l’opsonisation du LNP dans la circulation10,11,14,16. Pour formuler le LNP, ces composants lipidiques sont combinés dans une phase organique, généralement de l’éthanol, et mélangés à une phase aqueuse contenant la cargaison d’acide nucléique. Le procédé de formulation du LNP est très polyvalent en ce sens qu’il permet de substituer et de combiner facilement différents composants à différents rapports molaires afin de formuler de nombreuses formulations de LNP avec une multitude de propriétés physico-chimiques10,17. Cependant, lors de l’exploration de cette grande variété de LNP, il est crucial que chaque formulation soit évaluée à l’aide d’une procédure standardisée pour mesurer avec précision les différences de caractérisation et de performance.
Ici, le flux de travail complet pour la formulation des ARNm-LNP et l’évaluation de leurs performances dans les cellules et les animaux sont décrits.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 M Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Slip Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A52976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate, 1 Kilogram</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>&#160;631-61-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Citrate dibasic</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-200 Ionizable Lipid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>36699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>L-7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L2916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel Insulin Syringes - 0.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1484132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep G2 [HEPG2]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Instrument</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>Q2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter Lysis 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7601-54-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing

Les nanoparticules lipidiques (LNP) ont récemment attiré l’attention avec le développement réussi des vaccins à ARNm contre la COVID-19 par Moderna et Pfizer/BioNTech. Ces vaccins ont démontré l’efficacité des thérapies à base d’ARNm-LNP et ont ouvert la voie à de futures applications cliniques. Dans les systèmes ARNm-LNP, les LNP servent de plates-formes d’administration qui protègent la cargaison d’ARNm de la dégradation par les nucléases et interviennent dans leur livraison intracellulaire. Les LNP sont généralement composés de quatre composants : un lipide ionisable, un phospholipide, du cholestérol et un conjugué de polyéthylène glycol (PEG) ancré dans les lipides (lipide-PEG). Ici, les LNP encapsulant l’ARNm codant pour la luciférase luciole sont formulés par mélange microfluidique de la phase organique contenant les composants lipidiques du LNP et de la phase aqueuse contenant l’ARNm. Ces ARNm-LNP sont ensuite testés in vitro pour évaluer leur efficacité de transfection dans les cellules HepG2 à l’aide d’un test bioluminescent sur plaque. De plus, les ARNm-LNP sont évalués in vivo chez des souris C57BL/6 à la suite d’une injection intraveineuse via la veine caudale latérale. L’imagerie par bioluminescence du corps entier est réalisée à l’aide d’un système d’imagerie in vivo . Des résultats représentatifs sont présentés pour les caractéristiques de l’ARNm-LNP, leur efficacité de transfection dans les cellules HepG2 et le flux luminescent total chez les souris C57BL/6.

Les ARNm-LNP ont été formulés à l’aide d’un instrument microfluidique possédant un diamètre hydrodynamique moyen de 76,16 nm et un indice de polydispersité de 0,098. Le pKa des ARNm-LNP s’est avéré être de 5,75 en effectuant un test TNS18. L’efficacité d’encapsulation de ces ARNm-LNP a été calculée à 92,3 % en utilisant le test de fluorescence modifié et l’équation 4.4. La concentration globale d’ARN utilisée pour le traitement c...

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Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Ici, un protocole de formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) qui encapsulent l’ARNm codant pour la luciférase lucifly est présenté. Ces LNP ont été testés pour leur puissance in vitro dans des cellules HepG2 et in vivo chez des souris C57BL/6.

Tester l’efficacité in vitro et in vivo de nanoparticules d’ARNm-lipides formulées par mélange microfluidique

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

Ce protocole peut être utilisé pour formuler des nanoparticules lipidiques cohérentes encapsulant l’ARM. Les paramètres de formulation peuvent être ajustés et les différentes nanoparticules lipidiques peuvent être évaluées pour leur puissance et leur biodistribution. Un protocole standardisé pour la formulation de nanoparticules lipidiques et les tests in vitro et in vivo peut être utilisé pour formuler des nanoparticules lipidiques cohérentes qui peuvent être comparées les unes aux autres.Il y a beaucoup de petits détails à garder à l’esprit lors de la formulation et de l’évaluation de la puissance des nanoparticules, mais quels détails ont pris en compte ? La préparation de la formulation ne devrait pas être difficile. Commencez par remplir un bécher propre de quatre litres avec 200 à 300 millilitres de PBS frais 10X et diluez-le à 1X avec de l’eau ultra-pure.Assurez-vous que le volume final de PBS est compris entre deux et trois litres. Placer des cassettes de dialyse de la capacité appropriée pour la formulation de nanoparticules lipidiques, ou LNP, dans le bécher de champ. Diluez dix fois un tampon d’acide citrique de 100 millimolaires en utilisant de l’eau ultrapure pour créer un tampon d’acide citrique de 10 millimolaires pour la dilution de l’ARNm.Ensuite, fabriquez du C 12 200 lipide ionisable, du lipide auxiliaire, du cholestérol et du PEG ancré lipidique ou des solutions mères de PEG lipidique en dissolvant chaque lipide dans de l’éthanol à 100 %. Assurez-vous que les solutions mères sont complètement dissoutes en les chauffant et en les mélangeant à 37 degrés Celsius. Combinez les volumes calculés des différents composants lipidiques dans un tube conique.Diluer les lipides avec 100% d’éthanol jusqu’au volume final de V, ce qui représente 25% du volume final de LNP. Calculez la quantité d’ARNm nécessaire à la formulation en fonction du rapport lipide/poids de l’ARNm ionisable et du volume total d’ARNm-LNP. Ensuite, décongelez la luciférase luciole codant pour l’ARNm sur la glace.Diluez ensuite l’ARNm jusqu’à obtenir un volume final trois fois supérieur à celui de la phase organique à l’aide du tampon d’acide citrique de 10 millimolaires. Vaporisez une lingette délicate avec un décontaminant de surface pour les ARN et l’ADN, et essuyez soigneusement l’intérieur de l’instrument microfluidique. Ensuite, ouvrez une nouvelle cartouche microfluidique et insérez-la avec les canaux d’entrée vers le bas et vers l’extérieur.Disposez deux tubes coniques stériles de 15 millilitres sur le support avec les bouchons enlevés. Une fois cela fait, remplissez une seringue de cinq millilitres avec la solution d’ARNm contenant de l’ARNm diluée dans un tampon d’acide citrique de 10 millimolaires. Remplissez ensuite une seringue de trois millilitres avec la solution lipidique contenant les lipides dilués dans de l’éthanol à 100 %.Assurez-vous d’éliminer l’air des seringues. Ensuite, sans l’aiguille, insérez la seringue de cinq millilitres contenant la solution d’ARNm dans l’entrée gauche de la cartouche, et insérez la seringue de trois millilitres contenant la solution lipidique dans l’entrée droite de la cartouche. Allumez l’instrument microfluidique et sélectionnez l’exécution rapide.Après avoir sélectionné les types de seringues appropriés pour les seringues de cinq et trois millilitres insérées, entrez les paramètres de la formulation du LNP à un rapport de débit aqueux/organique de trois pour un, avant d’appuyer sur le bouton de démarrage pour formuler les ARNm-LNP. Chargez les ARNm-LNP collectés dans le tube conique droit dans les cassettes de dialyse préalablement hydratées à l’aide d’une seringue sans percer ni toucher la membrane de la cassette, replacez les cassettes de dialyse contenant les ARNm-LNP dans le bécher contenant le PBS et laissez-les se dialyser pendant au moins deux heures. Après la dialyse, amenez les cassettes de dialyse contenant les ARNm-LNP dans une enceinte de sécurité biologique stérile et retirez les ARNm-LNP à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille.Filtrer stérilement les ARNm-LNP à l’aide d’un filtre seringue de 0,22 micromètre et les recueillir dans un tube conique stérile. Placez ensuite 65 microlitres de la solution d’ARNm-LNP dans un microtube de 1,5 millilitre pour la caractérisation. Plaque 5 000 cellules HepG2 dans une paroi blanche, fond transparent, plaque de 96 puits dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire complet et incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur contrôlé à 37 degrés Celsius contenant 5% de dioxyde de carbone.Avant de traiter les cellules avec des ARNm-LNP, retirez le milieu complet des puits. Ensuite, traitez les cellules avec soit 100 microlitres d’ARNm-LNP dilués dans un milieu de culture cellulaire complet aux doses souhaitées, soit 100 microlitres de milieu complet avant une incubation de 24 heures. Après l’incubation, retirez le milieu de culture cellulaire de la plaque à 96 puits, ajoutez 20 microlitres de tampon de lyse dans chaque puits, puis 100 microlitres de réactifs de dosage de la luciférase.Protégez la plaque de la lumière et placez-la dans un lecteur de plaque pour mesurer le signal bioluminescent. Diluer la solution d’ARNm-LNP à l’aide de PBS stérile afin que deux microgrammes d’ARNm total soient présents dans 100 microlitres du volume d’injection de la veine caudale. Remplissez une seringue à insuline de calibre 29 avec 100 microlitres d’ARNm-LNP ou 100 microlitres de PBS et retirez toutes les bulles de la seringue.Insérez l’aiguille avec le biseau vers le haut dans la veine latérale de la queue de la souris et injectez lentement les 100 microlitres d’ARNm-LNP ou de PBS. Six heures après l’injection, préparez une solution mère de 15 milligrammes par millilitre de sel de potassium de D-luciférine dans du PBS stérile. Dans le logiciel d’imagerie du système d’imagerie in vivo, ou IVIS, cochez la case à côté de la luminescence avant d’appuyer sur initialiser pour préparer l’instrument à l’acquisition des données.Ensuite, administrez 200 microlitres de D-luciférine par voie intrapéritonéale aux souris précédemment traitées et attendez 10 minutes pendant que le signal de la luciférase se stabilise avant d’anesthésier les souris. Transférez les souris anesthésiées dans les cônes nasaux à l’intérieur du système d’imagerie in vivo, en vous assurant qu’elles sont sur le dos avec leur abdomen exposé, avant de fermer la porte de la chambre. Dans le logiciel d’imagerie, assurez-vous que le champ de vision correct est sélectionné et réglez le temps d’exposition sur auto, cliquez sur le bouton d’acquisition dans le logiciel pour obtenir des images de bioluminescence.L’efficacité d’encapsulation des ARNm-LNP a été déterminée à 92,3 % à l’aide du test de fluorescence modifié et de l’équation illustrés ici. Une augmentation de la bioluminescence a été observée lors du traitement de 5 000 cellules HepG2 avec des doses croissantes d’ARNm-LNP. L’expression de la luciférase a été facilement détectée à la dose la plus faible de cette étude, soit cinq nanogrammes par puits.Un fort signal de bioluminescence a été observé dans la partie supérieure de l’abdomen des souris traitées avec des LNP formulés. Des régions d’intérêt ont été dessinées autour des signaux hépatiques pour calculer le flux luminescent total. Le flux luminescent total était d’environ cinq fois 10 jusqu’au 9ème.Maintenez toujours le rapport lipide/acide nucléique ionisable lors de la formulation des LNP. Chaque volume de la phase organique doit contenir des lipides ionisables correspondant à l’ARNm dans trois volumes de la phase aqueuse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

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Les nanoparticules virales pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des tumeurs

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Recherche

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Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

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