Name: testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing at JoVE.com

M.J.M.은 미국 국립보건원(NIH) Director's New Innovator Award(DP2 TR002776), Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface(CASI), US National Science Foundation CAREER Award(CBET-2145491) 및 National Institutes of Health(NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 및 NIDDK R01 DK123049)의 추가 자금 지원을 인정합니다.

참고: RNase 및 DNA에 대한 표면 오염 제거제로 표면과 장비를 닦아 mRNA-LNP를 제형화할 때 항상 RNase가 없는 상태를 유지하십시오. RNase가 없는 팁과 시약만 사용하십시오.
모든 동물 시술은 펜실베니아 대학의 실험 동물 관리 및 사용 지침과 펜실베니아 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 사전 ?...

<ol>
	<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+organ+targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing.">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis.">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).</li><li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+patisiran,+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis.">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li><li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device.">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery:+Applications+in+cancer+immunotherapy.">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li><li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides.">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li><li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening.">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li><li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3.">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver.">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li><li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids.">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).</li><li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA.">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983 (2020).</li><li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA.">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li><li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+(LNPs)+designed+for+oligonucleotide+delivery.">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells.">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li><li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis.">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li><li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-like+materials+for+low-dose,+in+vivo+gene+silencing.">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering.">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li><li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy.">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li><li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core.">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells.">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li><li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice.">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications.">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li><li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes.">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+CRISPR/Cas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing.">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency.">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I.">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).</li><li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey.">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li><li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes.">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).</li><li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system.">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).</li><li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy.">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li><li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery.">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Tomb&#225;cz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CD4++T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4++cell-homing+mRNA-LNPs.">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation.">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li><li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells.">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li></ol>

이 워크플로우를 통해 다양한 mRNA-LNP를 제형화하고 in vitro 및 in vivo 효율을 테스트할 수 있습니다. 이온화 가능한 지질과 부형제는 서로 다른 몰비 및 서로 다른 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량비로 스왑 및 결합하여 서로 다른 물리화학적 특성을 가진 mRNA-LNP를 생성할 수 있습니다22. 여기서는 10:1 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량비에서 35/16/46.5/2.5(이온화 가능한 지?...

지질 나노입자(LNP)는 최근 몇 년 동안 비바이러스 유전자 치료 분야에서 큰 가능성을 보여주었습니다. 2018년 미국 식품의약국(FDA)은 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증 1,2,3,4 치료를 위해 최초의 RNA 간섭(RNAi) 치료제인 Onpattro by Alnylam을 승인했습니다. 이는 지질 나노입자 및 RNA 기반 치료법의 중요한 진전이었습니다. 최근에는 Moderna와 Pfizer/BioNTech가 SARS-CoV-2 4,5에 대한 mRNA-LNP 백신에 대한 FDA 승인을 받았습니다. 이러한 각각의 LNP 기반 핵산 치료제에서 LNP는 뉴클레아제에 의한 분해로부터 화물을 보호하고 강력한 세포 내 전달을 촉진하는 역할을 합니다 6,7. LNP는 RNAi 치료제 및 백신 응용 분야에서 성공을 거두었으며, mRNA-LNP는 단백질 대체 요법8과 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 시스템의 전달을 위한 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA의 동시 전달을 위해 연구되었습니다9. 그러나, 모든 응용에 적합한 하나의 특정 제형은 존재하지 않으며, LNP 제형 파라미터의 미묘한 변화는 생체내 효능 및 생체내 분포에 크게 영향을 미칠 수 있다 8,10,11. 따라서 각 LNP 기반 치료제에 대한 최적의 제형을 결정하기 위해 개별 mRNA-LNP를 개발하고 평가해야 합니다.
LNP는 일반적으로 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 지질 고정 폴리에틸렌-글리콜(PEG) 접합체(지질-PEG)의 4가지 지질 성분으로 제조됩니다11,12,13. LNP에 의해 촉진되는 강력한 세포내 전달은 부분적으로 이온화 가능한 지질 성분12에 의존한다. 이 성분은 생리학적 pH에서는 중성이지만 엔도솜11의 산성 환경에서는 양전하를 띠게 된다. 이러한 이온 전하의 변화는 엔도솜 탈출(endosomal escape)의 주요 원인으로 생각된다12,14,15. 이온화 가능한 지질 외에도 인지질(도우미 지질) 성분은 화물의 캡슐화를 개선하고 엔도솜 탈출을 돕고, 콜레스테롤은 안정성을 제공하고 막 융합을 향상시키며, 지질-PEG는 순환 중 LNP 응집 및 옵손화를 최소화합니다10,11,14,16. LNP를 제형화하기 위해, 이들 지질 성분은 유기상, 전형적으로 에탄올로 결합되고, 핵산 화물을 함유하는 수성 상과 혼합된다. LNP 제형 공정은 다수의 물리화학적 특성(10,17)을 갖는 많은 LNP 제형을 제형화하기 위해 상이한 성분을 상이한 몰비로 용이하게 치환하고 결합할 수 있도록 한다는 점에서 매우 다재다능하다. 그러나 이처럼 다양한 LNP를 탐색할 때는 표준화된 절차를 사용하여 각 제형을 평가하여 특성화 및 성능의 차이를 정확하게 측정하는 것이 중요합니다.
여기에서는 mRNA-LNP의 제형화와 세포 및 동물에서의 성능 평가를 위한 전체 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 M Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Slip Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A52976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate, 1 Kilogram</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>&#160;631-61-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Citrate dibasic</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-200 Ionizable Lipid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>36699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>L-7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L2916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel Insulin Syringes - 0.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1484132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep G2 [HEPG2]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Instrument</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>Q2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter Lysis 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7601-54-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing

지질 나노입자(LNP)는 최근 모더나와 화이자/바이오엔테크의 코로나19 mRNA 백신 개발에 성공하면서 주목을 받고 있다. 이 백신은 mRNA-LNP 치료제의 효능을 입증하고 향후 임상 적용의 문을 열었습니다. mRNA-LNP 시스템에서 LNP는 뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA 화물을 보호하고 세포 내 전달을 매개하는 전달 플랫폼 역할을 합니다. LNP는 일반적으로 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 지질 고정 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합체(지질-PEG)의 네 가지 구성 요소로 구성됩니다. 여기서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP는 LNP 지질 성분을 함유하는 유기상과 mRNA를 함유하는 수성상의 미세유체 혼합에 의해 제형화된다. 그런 다음 이러한 mRNA-LNP를 체외에서 테스트하여 생물 발광 플레이트 기반 분석을 사용하여 HepG2 세포에서 transfection 효율을 평가합니다. 또한 mRNA-LNP는 측면 꼬리 정맥을 통한 정맥 주입 후 C57BL/6 마우스에서 in vivo로 평가됩니다. 전신 생물 발광 이미징은 in vivo 이미징 시스템을 사용하여 수행됩니다. 대표적인 결과는 mRNA-LNP 특성, HepG2 세포에서의 transfection 효율 및 C57BL/6 마우스의 총 발광 플럭스에 대한 것입니다.

mRNA-LNP는 평균 유체역학적 직경이 76.16nm이고 다분산성 지수가 0.098인 미세유체 기기를 사용하여 제형화되었습니다. mRNA-LNP의pKa는 TNS 분석(18)을 수행하여 5.75로 확인되었다. 이러한 mRNA-LNP에 대한 캡슐화 효율은 수정된 형광 분석 및 방정식 4.4를 사용하여 92.3%로 계산되었습니다. 세포 처리 및 동물 투여에 사용된 전체 RNA 농도는 40.24ng/μL였습니다. 이 값?...

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Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

여기에서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)를 제형화하기 위한 프로토콜이 제시된다. 이 LNP는 HepG2 세포의 in vitro 및 C57BL/6 마우스의 in vivo 에서 효능을 테스트했습니다.

미세유체 혼합으로 제조된 mRNA-지질 나노입자의 In vitro 및 In vivo 효율 테스트

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

이 프로토콜은 MRA를 캡슐화하는 일관된 지질 나노 입자를 제형화하는 데 사용할 수 있습니다. 제형 파라미터를 조정할 수 있으며 다양한 지질 나노입자의 효능 및 생체내 분포를 평가할 수 있습니다. 지질 나노입자 제형과 시험관 내 및 생체 내 테스트를 위한 표준화된 프로토콜을 사용하여 서로 비교할 수 있는 일관된 지질 나노입자를 제형화할 수 있습니다.나노 입자 효능을 공식화하고 평가할 때 명심해야 할 작은 세부 사항이 많이 있지만 어떤 세부 사항을 설명합니까? 제형을 준비하는 것은 어렵지 않아야합니다. 깨끗한 4리터 비커에 200-300밀리리터의 신선한 10X PBS를 채우고 초순수로 1X로 희석하는 것으로 시작합니다.PBS의 최종 부피가 2리터에서 3리터 사이인지 확인하십시오. 지질 나노입자 또는 LNP 제형에 적합한 용량의 투석 카세트를 필드 비커에 넣습니다. mRNA 희석을 위한 10m몰 구연산 완충액을 만들기 위해 초순수를 사용하여 100mcal 구연산 완충액을 10배 희석합니다.다음으로, 각 지질을 100% 에탄올에 용해시켜 C12200 이온화 가능한 지질, 보조 지질, 콜레스테롤 및 지질 고정 PEG 또는 지질 PEG 원액을 제조합니다. 원액이 섭씨 37도에서 가열하고 혼합하여 완전히 용해되었는지 확인합니다. 서로 다른 지질 성분의 계산된 부피를 원뿔형 튜브에 결합합니다.지질을 100% 에탄올로 희석하여 LNP 최종 부피의 25%를 나타내는 V의 최종 부피로 묽게 합니다. 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량 비율과 mRNA-LNP의 총 부피를 기반으로 제형에 필요한 mRNA의 양을 계산합니다. 다음으로, mRNA를 암호화하는 반딧불이 루시페라아제를 얼음 위에서 해동합니다.그런 다음 10 밀리몰 구연산 완충액을 사용하여 mRNA를 유기상의 3 배로 최종 부피로 희석합니다. RNA 및 DNA에 대한 표면 오염 제거제를 섬세한 작업 와이프에 뿌리고 미세유체 기기 내부를 철저히 닦습니다. 그런 다음 새 미세유체 카트리지를 열고 입구 채널이 아래를 향하도록 삽입합니다.캡을 닫은 상태에서 홀더에 두 개의 멸균 15밀리리터 원뿔형 튜브를 배치합니다. 완료되면 10밀리몰 구연산 완충액에 희석된 mRNA가 포함된 mRNA 용액으로 5밀리리터 주사기를 채웁니다. 그런 다음 100% 에탄올에 희석된 지질이 포함된 지질 용액으로 3밀리리터 주사기를 채웁니다.주사기에서 공기를 제거해야 합니다. 그런 다음 바늘 없이 mRNA 용액이 포함된 5밀리리터 주사기를 카트리지의 왼쪽 입구에 삽입하고 지질 용액이 포함된 3밀리리터 주사기를 카트리지의 오른쪽 입구에 삽입합니다. 미세유체 기기를 켜고 빠른 실행을 선택합니다.삽입된 5mL 및 3mL 시린지에 대한 올바른 시린지 유형을 선택한 후 시작 버튼을 눌러 mRNA-LNP를 포뮬레이션하기 전에 3:1 수용성 대 유기 유속 비율로 LNP 제형에 대한 파라미터를 입력합니다. 오른쪽 원뿔형 튜브에 수집된 mRNA-LNP를 카세트 멤브레인에 구멍을 뚫거나 건드리지 않고 주사기를 사용하여 이전에 수화된 투석 카세트에 로드하고, mRNA-LNP가 포함된 투석 카세트를 PBS가 들어 있는 비커에 다시 넣고 최소 2시간 동안 투석합니다. 투석 후 mRNA-LNP가 포함된 투석 카세트를 멸균 생물안전 캐비닛으로 가져오고 바늘이 있는 주사기를 사용하여 mRNA-LNP를 제거합니다.0.22마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 mRNA-LNP를 멸균 여과하고 멸균 원뿔형 튜브에 수집합니다. 그런 다음 특성 분석을 위해 65 마이크로리터의 mRNA-LNP 용액을 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 넣습니다. 플레이트 5, 000 HepG2 세포를 흰색 벽, 명확한 바닥, 완전한 세포 배양 배지의 100 마이크로 리터에 96 웰 플레이트하고 5 % 이산화탄소를 포함하는 섭씨 37도에서 제어 된 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.mRNA-LNP로 세포를 처리하기 전에 웰에서 전체 배지를 제거합니다. 다음으로, 원하는 용량으로 완전한 세포 배양 배지에 희석된 100마이크로리터의 mRNA-LNP 또는 24시간 배양 전에 100마이크로리터의 완전한 배지로 세포를 처리합니다. 배양 후 96웰 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거하고 각 웰에 20마이크로리터의 용해 완충액을 첨가한 다음 100마이크로리터의 루시페라아제 분석 시약을 추가합니다.플레이트를 빛으로부터 보호하고 플레이트를 플레이트 리더에 넣어 생물 발광 신호를 측정합니다. 멸균 PBS를 사용하여 mRNA-LNP 용액을 희석하여 총 mRNA 2마이크로그램이 꼬리 정맥 주입 부피 100마이크로리터에 존재하도록 합니다. 29게이지 인슐린 주사기에 100마이크로리터의 mRNA-LNP 또는 100마이크로리터의 PBS를 채우고 주사기에서 기포를 제거합니다.비스듬한 방향이 위를 향하도록 바늘을 쥐의 측면 꼬리 정맥에 삽입하고 100마이크로리터의 mRNA-LNP 또는 PBS를 천천히 주입합니다. 주사 후 6시간 후, 멸균 PBS에서 D-루시페린 칼륨염의 밀리리터당 15밀리그램 원액을 준비합니다. in vivo 이미징 시스템(IVIS)용 이미징 소프트웨어에서 초기화를 누르기 전에 발광 옆에 있는 상자를 선택하여 기기 데이터 수집을 준비합니다.다음으로, 이전에 치료한 마우스에 200마이크로리터의 D-루시페린을 복강내로 투여하고 루시페라아제 신호가 안정화되는 동안 10분 동안 기다렸다가 마우스를 마취합니다. 마취된 쥐를 생체 내 이미징 시스템 내부의 코뿔로 옮겨 챔버 도어를 닫기 전에 복부가 노출된 상태로 등을 대고 있는지 확인합니다. 이미징 소프트웨어에서 올바른 시야가 선택되었는지 확인하고 노출 시간을 자동으로 설정하고 소프트웨어에서 획득 버튼을 클릭하여 생물 발광 이미지를 얻습니다.mRNA-LNP의 캡슐화 효율은 여기에 표시된 수정된 형광 분석 및 방정식을 사용하여 92.3%로 측정되었습니다. 증가 bioluminescence는 5의 처리에, mRNA-LNP의 증가 복용량을 가진 000의 HepG2 세포에 관찰되었다. 루시페라아제 발현은 웰당 5나노그램의 이 연구의 가장 낮은 용량에서 쉽게 검출되었습니다.강력한 생물 발광 신호는 공식화 된 LNP로 처리 된 마우스의 상복부에서 관찰되었습니다. 총 발광 플럭스를 계산하기 위해 간 신호 주위에 관심 영역을 그렸습니다. 총 발광속은 9 일까지 약 5 배 10이었습니다.LNP를 제형화할 때 항상 이온화 가능한 지질 대 핵산 중량비를 유지하십시오. 유기상의 모든 부피는 수성상의 3개 부피에서 mRNA에 해당하는 이온화 가능한 지질을 포함해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

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에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

연구

생체공학

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

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태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

마이크로 스케일 슐 리렌 기술에 의해 미세 유체 소자 믹싱 비균질성 분석

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

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복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

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Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

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<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

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Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...