Name: testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing at JoVE.com

M.J.M. reconhece o apoio de um Prêmio Novo Inovador do Diretor do National Institutes of Health (NIH) dos EUA (DP2 TR002776), um Prêmio de Carreira do Fundo Burroughs Wellcome na Interface Científica (CASI), um prêmio CAREER da Fundação Nacional de Ciência dos EUA (CBET-2145491) e financiamento adicional dos Institutos Nacionais de Saúde (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 e NIDDK R01 DK123049).

NOTA: Sempre mantenha as condições livres de RNase ao formular mRNA-LNPs, limpando as superfícies e equipamentos com um descontaminante de superfície para RNases e DNA. Use apenas pontas e reagentes sem RNase.
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade da Pensilvânia e um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Pensilvânia.
<p cla...

<ol>
	<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+organ+targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing.">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis.">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).</li><li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+patisiran,+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis.">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li><li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device.">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery:+Applications+in+cancer+immunotherapy.">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li><li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides.">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li><li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening.">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li><li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3.">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver.">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li><li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids.">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).</li><li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA.">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983 (2020).</li><li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA.">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li><li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+(LNPs)+designed+for+oligonucleotide+delivery.">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals.">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).</li><li>Granot, Y., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+right+message:+Challenges+and+opportunities+in+lipid+nanoparticles-mediated+modified+mRNA+therapeutics-An+innate+immune+system+standpoint.">Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint.</a> Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+containing+constrained+phospholipids+deliver+mRNA+to+liver+immune+cells+in+vivo+without+targeting+ligands.">Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).</li><li>Patel, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells.">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li><li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis.">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li><li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-like+materials+for+low-dose,+in+vivo+gene+silencing.">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering.">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li><li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy.">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li><li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core.">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells.">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li><li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice.">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications.">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li><li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes.">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+CRISPR/Cas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing.">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency.">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I.">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).</li><li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey.">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li><li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes.">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).</li><li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system.">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).</li><li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy.">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li><li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery.">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Tomb&#225;cz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CD4++T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4++cell-homing+mRNA-LNPs.">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation.">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li><li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells.">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li></ol>

Com esse fluxo de trabalho, uma variedade de mRNA-LNPs pode ser formulada e testada quanto à sua eficiência in vitro e in vivo. Lipídios ionizáveis e excipientes podem ser trocados e combinados em diferentes razões molares e diferentes razões de peso de lipídios ionizáveis para RNAm para produzir RNAm-LNPs com diferentes propriedades físico-químicas22. Aqui, formulamos C12-200 mRNA-LNPs com uma razão molar de 35/16/46,5/2,5 (lipídio ionizável:lipídio auxiliar:colest...

Nanopartículas lipídicas (LNPs) têm se mostrado promissoras nos últimos anos no campo da terapia gênica não viral. Em 2018, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos aprovou a primeira terapêutica de RNA de interferência (RNAi), Onpattro by Alnylam, para o tratamento da amiloidose transtirretina hereditária 1,2,3,4. Este foi um passo importante para nanopartículas lipídicas e terapias baseadas em RNA. Mais recentemente, a Moderna e a Pfizer/BioNTech receberam aprovações da FDA para suas vacinas de mRNA-LNP contra o SARS-CoV-2 4,5. Em cada uma dessas terapias de ácidos nucleicos baseadas em LNP, o LNP serve para proteger sua carga da degradação por nucleases e facilitar a potente liberação intracelular 6,7. Enquanto LNPs têm visto sucesso em terapias de RNAi e aplicações de vacinas, mRNA-LNPs também têm sido explorados para uso em terapias de substituição de proteínas8, bem como para a co-entrega de mRNA Cas9 e RNA guia para a entrega do sistema CRISPR-Cas9 para edição de genes9. No entanto, não há uma formulação específica que seja adequada para todas as aplicações, e mudanças sutis nos parâmetros de formulação do LNP podem afetar sobremaneira a potência e a biodistribuição in vivo 8,10,11. Assim, RNAm-LNPs individuais devem ser desenvolvidos e avaliados para determinar a formulação ideal para cada terapia baseada em LNP.
Os LNPs são comumente formulados com quatro componentes lipídicos: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG)11,12,13. A potente liberação intracelular facilitada pelos LNPs reside, em parte, no componente lipídico ionizável12. Esse componente é neutro em pH fisiológico, mas torna-se carregado positivamente no ambiente ácido do endossomo11. Acredita-se que essa mudança na carga iônica seja um dos principais contribuintes para o escape endossômico12,14,15. Além do lipídio ionizável, o componente fosfolipídeo (lipídio auxiliar) melhora a encapsulação da carga e auxilia no escape endossomal, o colesterol oferece estabilidade e aumenta a fusão da membrana, e o lipídio-PEG minimiza a agregação e opsonização do LNP na circulação10,11,14,16. Para formular o LNP, esses componentes lipídicos são combinados em uma fase orgânica, tipicamente etanol, e misturados com uma fase aquosa contendo a carga de ácido nucleico. O processo de formulação do LNP é muito versátil, pois permite que diferentes componentes sejam facilmente substituídos e combinados em diferentes razões molares para formular muitas formulações de LNP com uma infinidade de propriedades físico-químicas10,17. No entanto, ao explorar essa grande variedade de LNPs, é crucial que cada formulação seja avaliada usando um procedimento padronizado para medir com precisão as diferenças na caracterização e desempenho.
Aqui, o fluxo de trabalho completo para a formulação de mRNA-LNPs e a avaliação de seu desempenho em células e animais é descrito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 M Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Slip Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A52976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate, 1 Kilogram</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>&#160;631-61-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Citrate dibasic</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-200 Ionizable Lipid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>36699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>L-7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L2916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel Insulin Syringes - 0.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1484132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep G2 [HEPG2]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Instrument</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>Q2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter Lysis 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7601-54-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing

As nanopartículas lipídicas (LNPs) atraíram atenção generalizada recentemente com o desenvolvimento bem-sucedido das vacinas de mRNA COVID-19 pela Moderna e Pfizer/BioNTech. Essas vacinas demonstraram a eficácia da terapêutica mRNA-LNP e abriram as portas para futuras aplicações clínicas. Em sistemas de mRNA-LNP, os LNPs servem como plataformas de entrega que protegem a carga de mRNA da degradação por nucleases e mediam sua entrega intracelular. Os LNPs são tipicamente compostos por quatro componentes: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG). Aqui, LNPs encapsulando mRNA que codificam a luciferase de vagalumes são formulados por mistura microfluídica da fase orgânica contendo componentes lipídicos do LNP e da fase aquosa contendo mRNA. Esses mRNA-LNPs são então testados in vitro para avaliar sua eficiência de transfecção em células HepG2 usando um ensaio baseado em placa bioluminescente. Além disso, os mRNA-LNPs são avaliados in vivo em camundongos C57BL/6 após uma injeção intravenosa através da veia lateral da cauda. A imagem de bioluminescência de corpo inteiro é realizada usando um sistema de imagem in vivo . Resultados representativos são mostrados para as características do RNAm-LNP, sua eficiência de transfecção em células HepG2 e o fluxo luminescente total em camundongos C57BL/6.

Os mRNA-LNPs foram formulados usando um instrumento microfluídico que possuía um diâmetro hidrodinâmico médio de 76,16 nm e um índice de polidispersidade de 0,098. O pKa dos RNAm-LNPs foi encontrado em 5,75 através da realização de um ensaio TNS18. A eficiência de encapsulação para esses mRNA-LNPs foi calculada em 92,3% usando o ensaio de fluorescência modificado e a equação 4.4. A concentração total de RNA utilizada para o tratamento celular e...

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Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Aqui, um protocolo para a formulação de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulam RNAm que codifica a luciferase do vagalume é apresentado. Esses LNPs foram testados quanto à sua potência in vitro em células HepG2 e in vivo em camundongos C57BL/6.

Testando a Eficiência In Vitro e In Vivo de Nanopartículas de RNAm-Lipídios Formuladas por Mistura Microfluídica

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

Este protocolo pode ser usado para formular nanopartículas lipídicas consistentes encapsulando ARM. Os parâmetros de formulação podem ser ajustados e as várias nanopartículas lipídicas podem ser avaliadas quanto à sua potência e biodistribuição. Um protocolo padronizado para formulação de nanopartículas lipídicas e testes in vitro e in vivo pode ser usado para formular nanopartículas lipídicas consistentes que podem ser comparadas entre si.Há muitos pequenos detalhes a ter em mente ao formular e avaliar a potência das nanopartículas, mas quais detalhes foram contabilizados? O preparo da formulação não deve ser difícil. Comece enchendo um copo limpo de quatro litros com 200 a 300 mililitros de PBS 10X fresco e diluindo-o para 1X com água ultrapura.Certifique-se de que o volume final de PBS esteja entre dois e três litros. Coloque de diálise da capacidade apropriada para a nanopartícula lipídica, ou formulação LNP, no copo de campo. Faça a diluição de dez vezes de um estoque tampão de ácido cítrico de 100 milimolares usando água ultrapura para criar um tampão de ácido cítrico de 10 milimolares para diluição de mRNA.Em seguida, faça C 12 200 lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e soluções estoque de PEG ou PEG lipídico ancorado a lipídios, dissolvendo cada lipídio em etanol a 100%. Certifique-se de que as soluções de estoque estejam totalmente dissolvidas aquecendo-as e misturando-as a 37 graus Celsius. Combinar os volumes calculados dos diferentes componentes lipídicos em um tubo cônico.Diluir os lipídios com 100% de etanol até o volume final de V, que representa 25% do volume final do LNP. Calcular a quantidade de mRNA necessária para a formulação com base na relação entre o peso do lipídio ionizável e do mRNA e o volume total de mRNA-LNP. Em seguida, descongele a luciferase do vagalume que codifica o mRNA no gelo.Em seguida, diluir o RNAm para um volume final três vezes a fase orgânica usando o tampão de ácido cítrico de 10 milimolares. Borrife uma limpeza de tarefa delicada com uma superfície descontaminante para RNAs e DNA, e limpe o interior do instrumento microfluídico completamente. Em seguida, abra um novo cartucho microfluídico e insira-o com os canais de entrada voltados para baixo e para longe.Disponha dois tubos cônicos estéreis de 15 mililitros no suporte com as tampas desligadas. Uma vez feito, encha uma seringa de cinco mililitros com a solução de mRNA contendo mRNA diluída em tampão de ácido cítrico de 10 milimolares. Em seguida, encha uma seringa de três mililitros com a solução lipídica contendo os lipídios diluídos em etanol 100%.Certifique-se de remover qualquer ar das seringas. Em seguida, sem a agulha, insira a seringa de cinco mililitros contendo a solução de mRNA na entrada esquerda do cartucho e insira a seringa de três mililitros contendo a solução lipídica na entrada direita do cartucho. Ligue o instrumento microfluídico e selecione a execução rápida.Depois de selecionar os tipos de seringas corretos para as seringas de cinco e três mililitros inseridas, insira os parâmetros para a formulação do LNP em uma relação de fluxo aquoso para orgânico de três para um, antes de pressionar o botão de início para formular os mRNA-LNPs. Carregar os mRNA-LNPs coletados no tubo cônico direito nos de diálise previamente hidratados usando uma seringa sem puncionar ou tocar a membrana do, colocar os de diálise contendo os mRNA-LNPs de volta no copo contendo PBS e deixá-los dialisar por pelo menos duas horas. Após a diálise, traga as de diálise contendo os mRNA-LNPs para um gabinete de biossegurança estéril e remova os mRNA-LNPs usando uma seringa com uma agulha.Filtrar os RNAm-LNPs estéreis usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetro e coletá-los em um tubo cônico estéril. Em seguida, coloque 65 microlitros da solução de mRNA-LNP em um microtubo de 1,5 mililitro para caracterização. Placa 5.000 células HepG2 em uma parede branca, fundo claro, placa de 96 poços em 100 microlitros de meio de cultura celular completo e incubar as células durante a noite em uma incubadora controlada a 37 graus Celsius contendo 5% de dióxido de carbono.Antes do tratamento das células com mRNA-LNPs, remova o meio completo dos poços. Em seguida, tratar as células com 100 microlitros de mRNA-LNPs diluídos em meio de cultura celular completo nas doses desejadas, ou 100 microlitros de meio completo antes de uma incubação de 24 horas. Após a incubação, retirar o meio de cultura celular da placa de 96 poços, adicionar 20 microlitros de tampão de lise a cada poço seguido de 100 microlitros dos reagentes de ensaio de luciferase.Proteja a placa da luz e coloque-a em um leitor de placas para medir o sinal bioluminescente. Diluir a solução de mRNA-LNP usando PBS estéril para que dois microgramas de mRNA total estejam presentes em 100 microlitros do volume de injeção da veia caudal. Encha uma seringa de insulina calibre 29 com 100 microlitros de mRNA-LNP ou 100 microlitros de PBS e remova quaisquer bolhas da seringa.Insira a agulha com o bisel voltado para cima na veia lateral da cauda do rato e injete lentamente os 100 microlitros de mRNA-LNP ou PBS. Seis horas após a injeção, prepare uma solução estoque de 15 miligramas por mililitro de sal de potássio D-Luciferina em PBS estéril. No software de imagem para o sistema de imagem in vivo, ou IVIS, selecione a caixa ao lado de luminescência antes de pressionar inicializar para preparar o instrumento para aquisição de dados.Em seguida, administrar 200 microlitros de D-Luciferina por via intraperitoneal aos camundongos previamente tratados e aguardar 10 minutos enquanto o sinal da luciferase se estabiliza antes de anestesiar os camundongos. Transfira os camundongos anestesiados para os cones nasais dentro do sistema de imagem in vivo, garantindo que eles estejam de costas com o abdômen exposto, antes de fechar a porta da câmara. No software de imagem, certifique-se de que o campo de visão correto está selecionado e defina o tempo de exposição como automático, clique no botão adquirir no software para obter imagens de bioluminescência.A eficiência de encapsulação do mRNA-LNPs foi determinada em 92,3% usando o ensaio de fluorescência modificado e a equação mostrada aqui. Bioluminescência crescente foi observada após o tratamento de 5.000 células HepG2 com doses crescentes de mRNA-LNP. A expressão de Luciferase foi facilmente detectada na dose mais baixa deste estudo, de cinco nanogramas por poço.Um forte sinal de bioluminescência foi observado no abdome superior dos camundongos tratados com LNPs formulados. Regiões de interesse foram desenhadas ao redor dos sinais hepáticos para calcular o fluxo luminescente total. O fluxo luminescente total foi de aproximadamente cinco vezes 10 até o 9º.Mantenha sempre a relação lipídio/peso de ácido nucleico ionizável ao formular LNPs. Cada volume da fase orgânica deve conter lipídio ionizável correspondente ao RNAm em três volumes da fase aquosa.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Bioengenharia

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantificação da função global diastólica por análise baseada em Modelagem cinemática de transmitral fluxo através do formalismo de enchimento parametrizada diastólica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analisando falta de homogeneidade de mistura em um dispositivo micro, pela técnica Microscale Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

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Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

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Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

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Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

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Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

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