Name: testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing at JoVE.com

M.J.M. выражает признательность за поддержку со стороны премии директора Национального института здравоохранения США (NIH) «Новый новатор» (DP2 TR002776), премии Burroughs Wellcome Fund Career Award в Scientific Interface (CASI), премии CAREER Национального научного фонда США (CBET-2145491) и дополнительного финансирования от Национальных институтов здравоохранения (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 и NIDDK R01 DK123049).

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда поддерживайте условия, свободные от РНКазы при составлении мРНК-LNP, протирая поверхности и оборудование дезинфицирующим средством для РНКаз и ДНК. Используйте только наконечники и реагенты, не содержащие РНКазы.
Все процедуры с животными проводились ?...

<ol>
	<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+organ+targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing.">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis.">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).</li><li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+patisiran,+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis.">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li><li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device.">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery:+Applications+in+cancer+immunotherapy.">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li><li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides.">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li><li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening.">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li><li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3.">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver.">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li><li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids.">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).</li><li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA.">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983 (2020).</li><li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA.">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li><li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+(LNPs)+designed+for+oligonucleotide+delivery.">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals.">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).</li><li>Granot, Y., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+right+message:+Challenges+and+opportunities+in+lipid+nanoparticles-mediated+modified+mRNA+therapeutics-An+innate+immune+system+standpoint.">Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint.</a> Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+containing+constrained+phospholipids+deliver+mRNA+to+liver+immune+cells+in+vivo+without+targeting+ligands.">Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).</li><li>Patel, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells.">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li><li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis.">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li><li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-like+materials+for+low-dose,+in+vivo+gene+silencing.">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering.">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li><li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy.">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li><li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core.">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells.">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li><li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice.">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications.">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li><li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes.">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+CRISPR/Cas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing.">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency.">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I.">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).</li><li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey.">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li><li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes.">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).</li><li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system.">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).</li><li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy.">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li><li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery.">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Tomb&#225;cz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CD4++T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4++cell-homing+mRNA-LNPs.">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation.">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li><li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells.">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li></ol>

С помощью этого рабочего процесса можно сформулировать и протестировать различные мРНК-ЛЯП на предмет их эффективности in vitro и in vivo. Ионизируемые липиды и вспомогательные вещества могут быть заменены и комбинированы при различных молярных соотношениях и различном массовом с...

Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последние годы продемонстрировали большие перспективы в области невирусной генной терапии. В 2018 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первый в мире препарат для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза 1,2,3,4 на основе РНК-интерференции (РНК-интерференции) Onpattro от Alnylam. Это был важный шаг вперед для липидных наночастиц и терапии на основе РНК. Совсем недавно компании Moderna и Pfizer/BioNTech получили одобрение FDA на свои вакцины мРНК-LNP против SARS-CoV-2 4,5. В каждой из этих терапий на основе ЛЯП нуклеиновых кислот ЛЯП служит для защиты груза от деградации нуклеазами и облегчения мощной внутриклеточной доставки 6,7. В то время как LNP успешно применяются в РНК-интерференционной терапии и применении вакцин, мРНК-LNP также были исследованы для использования в белковозаместительной терапии8, а также для совместной доставки мРНК Cas9 и направляющей РНК для доставки системы CRISPR-Cas9 для редактирования генов9. Тем не менее, не существует какой-то одной конкретной формулы, которая хорошо подходила бы для всех применений, и незначительные изменения в параметрах рецептуры LNP могут сильно повлиять на эффективность и биораспределение in vivo 8,10,11. Таким образом, для определения оптимальной рецептуры для каждой терапии на основе ЛНЧ необходимо разработать и оценить отдельные мРНК-ЛНЧ.
В состав LNP обычно входят четыре липидных компонента: ионизируемый липид, фосфолипид, холестерин и липидно-закрепленный конъюгат полиэтиленгликоля (ПЭГ) (липид-ПЭГ)11,12,13. Мощная внутриклеточная доставка, обеспечиваемая ЛНЧ, частично зависит от ионизируемого липидного компонента12. Этот компонент нейтрален при физиологическом рН, но становится положительно заряженным в кислой среде эндосомы11. Считается, что это изменение ионного заряда является ключевым фактором эндосомального побега12,14,15. В дополнение к ионизируемому липиду, фосфолипидный компонент (липид-хелпер) улучшает инкапсуляцию груза и способствует эндосомальному побегу, холестерин обеспечивает стабильность и усиливает слияние мембран, а липид-ПЭГ сводит к минимуму агрегацию и опсонизацию LNP в кровотоке10,11,14,16. Для создания LNP эти липидные компоненты объединяются в органическую фазу, как правило, этанол, и смешиваются с водной фазой, содержащей груз нуклеиновых кислот. Процесс разработки LNP очень универсален в том смысле, что он позволяет легко заменять и комбинировать различные компоненты при различных молярных соотношениях для создания множества рецептур LNP с множеством физико-химических свойств10,17. Тем не менее, при изучении этого огромного разнообразия LNP крайне важно, чтобы каждая рецептура оценивалась с использованием стандартизированной процедуры для точного измерения различий в характеристиках и эксплуатационных характеристиках.
В этой статье описывается полный рабочий процесс по составлению мРНК-ЛНЧ и оценке их эффективности в клетках и на животных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 M Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Slip Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A52976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate, 1 Kilogram</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>&#160;631-61-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Citrate dibasic</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-200 Ionizable Lipid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>36699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>L-7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L2916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel Insulin Syringes - 0.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1484132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep G2 [HEPG2]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Instrument</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>Q2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter Lysis 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7601-54-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing

Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последнее время привлекли широкое внимание в связи с успешной разработкой мРНК-вакцин против COVID-19 компаниями Moderna и Pfizer/BioNTech. Эти вакцины продемонстрировали эффективность терапии на основе мРНК-ЛЯП и открыли двери для будущих клинических применений. В системах мРНК-ЛЯП ЛЯП служат платформами доставки, которые защищают груз мРНК от деградации нуклеазами и опосредуют их внутриклеточную доставку. LNP обычно состоят из четырех компонентов: ионизируемого липида, фосфолипида, холестерина и конъюгата полиэтиленгликоля (ПЭГ) с липидной привязкой (липид-ПЭГ). Здесь ЛЯП, инкапсулирующие мРНК, кодирующую люциферазу светлячка, образуются путем микрофлюидного смешивания органической фазы, содержащей липидные компоненты LNP, и водной фазы, содержащей мРНК. Затем эти мРНК-ЛНЧ тестируются in vitro для оценки эффективности их трансфекции в клетках HepG2 с помощью анализа на основе биолюминесцентной пластины. Кроме того, мРНК-LNP оценивают in vivo у мышей C57BL/6 после внутривенной инъекции через боковую хвостовую вену. Биолюминесцентная визуализация всего тела выполняется с помощью системы визуализации in vivo . Приведены репрезентативные результаты для характеристик мРНК-ЛЯП, эффективности их трансфекции в клетках HepG2 и общего люминесцентного потока у мышей линии C57BL/6.

мРНК-ЛЯП были созданы с помощью микрофлюидного прибора, обладающего средним гидродинамическим диаметром 76,16 нм и индексом полидисперсности 0,098. При проведении анализа TNS18 было установлено, что p K a мРНК-LNP составляет 5,75. Эффективность инкапсуляции этих мРНК-ЛЯП бы...

Watch this Scientific Journal Video about Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing at JoVE.com

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Представлен протокол разработки липидных наночастиц (ЛНЧ), инкапсулирующих мРНК, кодирующую люциферазу светлячка. Эти LNP были протестированы на их активность in vitro в клетках HepG2 и in vivo на мышах C57BL/6.

Тестирование эффективности in vitro и in vivo мРНК-липидных наночастиц, полученных путем микрофлюидного смешивания

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

Этот протокол может быть использован для создания консистентных липидных наночастиц, инкапсулирующих МРА. Параметры рецептуры могут быть настроены, а различные липидные наночастицы могут быть оценены с точки зрения их эффективности и биораспределения. Стандартизированный протокол для разработки состава липидных наночастиц и тестирования in vitro и in vivo может быть использован для создания согласованных липидных наночастиц, которые можно сравнивать друг с другом.Существует множество мелких деталей, которые следует иметь в виду при составлении и оценке потенции наночастиц, но какие именно детали были учтены? Приготовление состава не должно быть сложным. Начните с наполнения чистого четырехлитрового стакана 200-300 миллилитрами свежего 10-кратного PBS и разбавьте его до 1-кратного значения сверхчистой водой.Убедитесь, что окончательный объем PBS составляет от двух до трех литров. Поместите диализные кассеты соответствующей емкости для липидной наночастицы, или состава LNP, в полевой стакан. Сделайте десятикратное разведение 100-миллимолярного буферного запаса лимонной кислоты с использованием сверхчистой воды, чтобы создать 10-миллимольный буфер лимонной кислоты для разведения мРНК.Затем приготовьте C 12 200 ионизируемые липидные, хелперные липиды, холестериновые и липидные закрепленные растворы ПЭГ или липидные ПЭГ, растворив каждый липид в 100% этаноле. Обеспечьте полное растворение исходных растворов, нагревая и смешивая их при температуре 37 градусов Цельсия. Объедините рассчитанные объемы различных липидных компонентов в конической пробирке.Разбавьте липиды 100%-ным этанолом до конечного объема V, который составляет 25% от конечного объема LNP. Рассчитайте количество мРНК, необходимое для составления рецептуры, исходя из весового соотношения ионизируемых липидов и мРНК и общего объема мРНК-ЛЯП. Затем разморозьте люциферазу светлячка, кодирующую мРНК, на льду.Затем разбавляют мРНК до конечного объема, в три раза превышающего органическую фазу, используя 10-миллимольный буфер лимонной кислоты. Распылите на деликатную салфетку обеззараживающее поверхностное средство для РНК и ДНК и тщательно протрите внутреннюю часть микрофлюидного инструмента. Затем откройте новый микрофлюидный картридж и вставьте его впускными каналами вниз и в сторону.Расположите две стерильные конические пробирки объемом 15 миллилитров на держателе при снятых крышках. После этого наполните шприц объемом пять миллилитров раствором мРНК, содержащим мРНК, разведенным в 10-миллимолярном буфере лимонной кислоты. Затем наполните трехмиллилитровый шприц липидным раствором, содержащим липиды, разведенные в 100% этаноле.Убедитесь, что из шприцев удален воздух. Затем без иглы вставьте пятимиллилитровый шприц, содержащий раствор мРНК, в левое входное отверстие картриджа, а трехмиллилитровый шприц, содержащий липидный раствор, в правое отверстие картриджа. Включите микрофлюидный прибор и выберите быстрый запуск.После выбора правильных типов шприцев для вставленных шприцев объемом пять и три миллилитра введите параметры для состава LNP в соотношении водной и органической потоков три к одному, прежде чем нажать кнопку запуска для формулы мРНК-LNP. Загрузите мРНК-ЛЯП, собранные в правую коническую пробирку, в предварительно гидратированные диализные кассеты с помощью шприца, не прокалывая и не прикасаясь к мембране кассеты, поместите диализные кассеты, содержащие мРНК-ЛЯП, обратно в стакан с PBS и дайте им диализироваться в течение не менее двух часов. После диализа диализные кассеты, содержащие мРНК-ЛЯП, поместить в стерильный шкаф биобезопасности и удалить мРНК-ЛЯП с помощью шприца с иглой.Стерильную фильтрацию мРНК-ЛЯП с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм и сбор их в стерильную коническую пробирку. Затем поместите 65 микролитров раствора мРНК-ЛЯП в микропробирку объемом 1,5 миллилитра для характеризации. Планшет 5 000 клеток HepG2 в белой стенке, прозрачное дно, 96-луночное планшет в 100 микролитрах полной питательной среды клеток и инкубируют клетки в течение ночи в контролируемом инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, содержащей 5% углекислого газа.Перед обработкой клеток мРНК-ЛЯП удалить из лунок всю среду. Затем обрабатывают клетки либо 100 микролитрами мРНК-ЛНЧ, разведенными в полной питательной среде клеток в желаемых дозах, либо 100 микролитрами полной среды перед 24-часовой инкубацией. После инкубации извлеките питательную среду из 96-луночного планшета, добавьте в каждую лунку 20 микролитров лизисного буфера, а затем 100 микролитров реагентов для анализа люциферазы.Защитите планшет от света и поместите планшет в считыватель пластин для измерения биолюминесцентного сигнала. Раствор мРНК-ЛЯП разбавляют стерильным PBS так, чтобы в 100 микролитрах объема инъекции в хвостовую вену присутствовало два микрограмма общей мРНК. Наполните инсулиновый шприц 29-го калибра 100 микролитрами мРНК-LNP или 100 микролитрами PBS и удалите из шприца все пузырьки.Введите иглу скосом вверх в боковую хвостовую вену мыши и медленно введите 100 микролитров мРНК-ЛНП или ПБС. Через шесть часов после инъекции приготовьте 15 миллиграмм на миллилитр бульонного раствора калийной соли D-люциферина в стерильном ПБС. В программном обеспечении для обработки изображений для системы визуализации in vivo (IVIS) установите флажок рядом с люминесценцией перед нажатием кнопки «Инициализировать», чтобы подготовить прибор к сбору данных.Затем вводят 200 микролитров D-люциферина в брюшину мышам, ранее обработанным и ждите 10 минут, пока сигнал люциферазы стабилизируется, прежде чем обезболивать мышей. Перенесите мышей под наркозом в носовые конусы внутри системы визуализации in vivo, убедившись, что они лежат на спине с обнаженным животом, прежде чем закрыть дверцу камеры. В программном обеспечении для обработки изображений убедитесь, что выбрано правильное поле зрения, и установите время экспозиции на авто, нажмите кнопку получения в программном обеспечении, чтобы получить биолюминесцентные изображения.Эффективность инкапсуляции мРНК-ЛЯП была определена как 92,3% с использованием модифицированного флуоресцентного анализа и уравнения, показанных здесь. Повышение биолюминесценции наблюдалось при обработке 5 000 клеток HepG2 возрастающими дозами мРНК-ЛЯП. Экспрессия люциферазы была легко обнаружена при самой низкой дозе в пять нанограммов на лунку.Сильный сигнал биолюминесценции наблюдался в верхней части брюшной полости мышей, получавших ЛНЧ. Вокруг печеночных сигналов были нарисованы интересующие области для расчета общего люминесцентного потока. Суммарный люминесцентный поток был примерно в пять раз по 10 к 9-му.Всегда соблюдайте массовое соотношение ионизируемых липидов и нуклеиновых кислот при составлении LNP. Каждый объем органической фазы должен содержать ионизируемый липид, соответствующий мРНК в трех объемах водной фазы.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Вирусный наночастиц для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображения опухоли

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Определение транспортных Оценить ксенобиотиков и наноматериалы через плаценту помощью<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Плацентарной перфузии модели

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Количественная оценка глобальной диастолической функции по кинематическая Моделирование на основе анализа трансмитрального кровотока через Заполнение формализма Параметризованный диастолической

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Анализируя смешивания неоднородности в микрожидкостных устройств по Микромасштабные шлирен техники

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Слой за слоем Коллаген осаждения в микрофлюидных Устройства для стабилизации Microtissue

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Получение металлических наночастиц импульсной лазерной абляцией в жидкостях: инструмент для изучения антибактериальных свойств наночастиц

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Жесткая встраивание фиксированной и витражи, в целом, миллиметр масштаб образцов для секции Бесплатные 3D гистологии, Микро Компьютерная томография

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...