Name: testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing at JoVE.com

M.J.M. agradece el apoyo de un Premio al Nuevo Innovador del Director de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) de los Estados Unidos (DP2 TR002776), un Premio a la Carrera del Fondo Burroughs Wellcome en la Interfaz Científica (CASI), un premio a la Carrera de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (CBET-2145491) y fondos adicionales de los Institutos Nacionales de la Salud (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 y NIDDK R01 DK123049).

NOTA: Mantenga siempre las condiciones libres de ARNasa cuando formule ARNm-LNP limpiando las superficies y el equipo con un descontaminante de superficie para ARNasas y ADN. Utilice únicamente puntas y reactivos sin RNasa.
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Pensilvania y un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad ...

<ol>
	<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+organ+targeting+(SORT)+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing.">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li><li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis.">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).</li><li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+patisiran,+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis.">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li><li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device.">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery:+Applications+in+cancer+immunotherapy.">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li><li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides.">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li><li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening.">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li><li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3.">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver.">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li><li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids.">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).</li><li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA.">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983 (2020).</li><li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA.">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li><li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+(LNPs)+designed+for+oligonucleotide+delivery.">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals.">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).</li><li>Granot, Y., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+right+message:+Challenges+and+opportunities+in+lipid+nanoparticles-mediated+modified+mRNA+therapeutics-An+innate+immune+system+standpoint.">Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint.</a> Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+containing+constrained+phospholipids+deliver+mRNA+to+liver+immune+cells+in+vivo+without+targeting+ligands.">Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).</li><li>Patel, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells.">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li><li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis.">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li><li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-like+materials+for+low-dose,+in+vivo+gene+silencing.">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering.">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li><li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy.">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li><li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core.">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li><li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells.">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li><li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice.">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications.">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li><li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes.">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+CRISPR/Cas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing.">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency.">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I.">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).</li><li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey.">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li><li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes.">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).</li><li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system.">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).</li><li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy.">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li><li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery.">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs.">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li><li>Tomb&#225;cz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CD4++T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4++cell-homing+mRNA-LNPs.">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation.">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li><li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells.">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li></ol>

Con este flujo de trabajo, se puede formular y probar una variedad de ARNm-LNP para determinar su eficiencia in vitro e in vivo. Los lípidos y excipientes ionizables pueden intercambiarse y combinarse en diferentes proporciones molares y diferentes proporciones de lípidos ionizables a peso de ARNm para producir ARNm-LNP con diferentes propiedades fisicoquímicas22. Aquí, formulamos C12-200 ARNm-LNP con una relación molar de 35/16/46,5/2,5 (lípido ionizable: lípido auxiliar:...

Las nanopartículas lipídicas (LNP) han demostrado ser muy prometedoras en los últimos años en el campo de la terapia génica no viral. En 2018, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) aprobó la primera terapia de ARN de interferencia (ARNi), Onpattro de Alnylam, para el tratamiento de la amiloidosis hereditaria por transtiretina 1,2,3,4. Este fue un importante paso adelante para las nanopartículas lipídicas y las terapias basadas en ARN. Más recientemente, Moderna y Pfizer/BioNTech recibieron la aprobación de la FDA para sus vacunas de ARNm-LNP contra el SARS-CoV-2 4,5. En cada una de estas terapias de ácidos nucleicos basadas en LNP, la LNP sirve para proteger su carga de la degradación por las nucleasas y facilitar una potente administración intracelular 6,7. Si bien las LNP han tenido éxito en las terapias de ARNi y en las aplicaciones de vacunas, también se han explorado las LNP de ARNm para su uso en terapias de reemplazo de proteínas8, así como para la administración conjunta de ARNm Cas9 y ARN guía para la administración del sistema CRISPR-Cas9 para la edición de genes9. Sin embargo, no existe una formulación específica que sea adecuada para todas las aplicaciones, y los cambios sutiles en los parámetros de formulación de LNP pueden afectar en gran medida la potencia y la biodistribución in vivo 8,10,11. Por lo tanto, se deben desarrollar y evaluar ARNm individuales para determinar la formulación óptima para cada terapia basada en LNP.
Los LNP se formulan comúnmente con cuatro componentes lipídicos: un lípido ionizable, un fosfolípido, colesterol y un conjugado de polietilenglicol (PEG) anclado a lípidos (lípido-PEG)11,12,13. La potente administración intracelular facilitada por las LNP depende, en parte, del componente lipídico ionizable12. Este componente es neutro a pH fisiológico, pero se carga positivamente en el ambiente ácido del endosoma11. Se cree que este cambio en la carga iónica es un factor clave que contribuye al escape endosomal12,14,15. Además del lípido ionizable, el componente fosfolípido (lípido auxiliar) mejora la encapsulación de la carga y ayuda en el escape endosomal, el colesterol ofrece estabilidad y mejora la fusión de la membrana, y el lípido-PEG minimiza la agregación y opsonización de LNP en circulación10,11,14,16. Para formular el LNP, estos componentes lipídicos se combinan en una fase orgánica, típicamente etanol, y se mezclan con una fase acuosa que contiene la carga de ácido nucleico. El proceso de formulación de LNP es muy versátil, ya que permite sustituir y combinar fácilmente diferentes componentes en diferentes proporciones molares para formular muchas formulaciones de LNP con multitud de propiedades fisicoquímicas10,17. Sin embargo, al explorar esta gran variedad de LNP, es crucial que cada formulación se evalúe utilizando un procedimiento estandarizado para medir con precisión las diferencias en la caracterización y el rendimiento.
Aquí, se describe el flujo de trabajo completo para la formulación de ARNm-LNP y la evaluación de su rendimiento en células y animales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 M Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL BD Slip Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A52976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-000-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate, 1 Kilogram</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>&#160;631-61-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Citrate dibasic</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-200 Ionizable Lipid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>36699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>L-7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>L2916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel Insulin Syringes - 0.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1484132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep G2 [HEPG2]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30538.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAssemblr Ignite Instrument</td>
			<td>Precision Nanosystems</td>
			<td>NIN0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>Q2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter Lysis 5x Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7601-54-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing the in vitro and in vivo efficiency of mrna-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing

Las nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés) han atraído una amplia atención recientemente con el exitoso desarrollo de las vacunas de ARNm contra la COVID-19 por parte de Moderna y Pfizer/BioNTech. Estas vacunas han demostrado la eficacia de las terapias de ARNm-LNP y han abierto la puerta a futuras aplicaciones clínicas. En los sistemas ARNm-LNP, los LNP sirven como plataformas de administración que protegen la carga de ARNm de la degradación por nucleasas y median su entrega intracelular. Los LNP suelen estar compuestos por cuatro componentes: un lípido ionizable, un fosfolípido, colesterol y un conjugado de polietilenglicol (PEG) anclado a lípidos (lípido-PEG). En este caso, los LNP que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga se formulan mediante la mezcla microfluídica de la fase orgánica que contiene los componentes lipídicos de LNP y la fase acuosa que contiene el ARNm. A continuación, estos ARNm-LNP se prueban in vitro para evaluar su eficacia de transfección en células HepG2 mediante un ensayo bioluminiscente basado en placas. Además, los ARNm-LNP se evalúan in vivo en ratones C57BL/6 después de una inyección intravenosa a través de la vena lateral de la cola. Las imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero se realizan mediante el uso de un sistema de imágenes in vivo . Se muestran resultados representativos de las características de ARNm-LNP, su eficiencia de transfección en células HepG2 y el flujo luminiscente total en ratones C57BL/6.

Los ARNm-LNP se formularon utilizando un instrumento microfluídico que poseía un diámetro hidrodinámico promedio de 76,16 nm y un índice de polidispersidad de 0,098. Se encontró que el pKa de los ARNm-LNPs era de 5,75 al realizar un ensayo TNS18. La eficiencia de encapsulación de estos ARNm-LNP se calculó en un 92,3% utilizando el ensayo de fluorescencia modificada y la ecuación 4.4. La concentración global de ARN que se utilizó para el tratamiento c...

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Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Aquí, se presenta un protocolo para la formulación de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga. La potencia de estos LNP se probó in vitro en células HepG2 e in vivo en ratones C57BL/6.

Prueba de la eficiencia in vitro e in vivo de nanopartículas lipídicas de ARNm formuladas mediante mezcla microfluídica

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

Este protocolo se puede utilizar para formular nanopartículas lipídicas consistentes que encapsulan MRA. Los parámetros de formulación se pueden ajustar y las diversas nanopartículas lipídicas se pueden evaluar en cuanto a su potencia y biodistribución. Se puede utilizar un protocolo estandarizado para la formulación de nanopartículas lipídicas y pruebas in vitro e in vivo para formular nanopartículas lipídicas consistentes que puedan compararse entre sí.Hay muchos pequeños detalles a tener en cuenta a la hora de formular y evaluar la potencia de las nanopartículas, pero ¿qué detalles se tienen en cuenta? La preparación de la formulación no debería ser difícil. Comience llenando un vaso limpio de cuatro litros con 200 a 300 mililitros de PBS fresco 10X y diluyéndolo a 1X con agua ultrapura.Asegúrese de que el volumen final de PBS esté entre dos y tres litros. Coloque casetes de diálisis de la capacidad adecuada para la nanopartícula lipídica, o formulación de LNP, en el vaso de precipitados de campo. Realice la dilución diez veces mayor de un tampón de ácido cítrico de 100 milimolares utilizando agua ultrapura para crear un tampón de ácido cítrico de 10 milimolares para la dilución de ARNm.A continuación, haga C 12 200 lipídico ionizable, lípidos auxiliares, colesterol y soluciones madre de PEG ancladas a lípidos o PEG lipídicos disolviendo cada lípido en etanol al 100%. Asegúrese de que las soluciones madre se disuelvan por completo calentándolas y mezclándolas a 37 grados centígrados. Combinar los volúmenes calculados de los diferentes componentes lipídicos en un tubo cónico.Diluir los lípidos con etanol al 100% hasta el volumen final de V, que representa el 25% del volumen final de LNP. Calcule la cantidad de ARNm necesaria para la formulación en función de la relación entre el peso de los lípidos ionizables y el ARNm y el volumen total de ARNm-LNP. A continuación, descongele la luciferasa de luciérnaga que codifica el ARNm en hielo.A continuación, diluya el ARNm hasta un volumen final tres veces superior al de la fase orgánica utilizando el tampón de ácido cítrico de 10 milimolares. Rocíe una toallita delicada con un descontaminante de superficie para ARN y ADN, y limpie a fondo el interior del instrumento microfluídico. A continuación, abra un nuevo cartucho microfluídico e insértelo con los canales de entrada hacia abajo y hacia afuera.Coloque dos tubos cónicos estériles de 15 mililitros en el soporte sin tapas. Una vez hecho esto, llene una jeringa de cinco mililitros con la solución de ARNm que contiene ARNm diluido en tampón de ácido cítrico de 10 milimolares. A continuación, llene una jeringa de tres mililitros con la solución lipídica que contiene los lípidos diluidos en etanol al 100%.Asegúrese de eliminar el aire de las jeringas. Luego, sin la aguja, inserte la jeringa de cinco mililitros que contiene la solución de ARNm en la entrada izquierda del cartucho e inserte la jeringa de tres mililitros que contiene la solución lipídica en la entrada derecha del cartucho. Encienda el instrumento microfluídico y seleccione ejecución rápida.Después de seleccionar los tipos de jeringa correctos para las jeringas de cinco y tres mililitros insertadas, ingrese los parámetros para la formulación de LNP en una relación de flujo acuoso a orgánico de tres a uno, antes de presionar el botón de inicio para formular los ARNm-LNP. Cargue los ARNm-LNP recogidos en el tubo cónico derecho en los casetes de diálisis previamente hidratados con una jeringa sin perforar ni tocar la membrana del casete, vuelva a colocar los casetes de diálisis que contienen los ARNm-LNP en el vaso de precipitados que contiene PBS y déjelos dializar durante al menos dos horas. Después de la diálisis, lleve los casetes de diálisis que contienen los ARNm-LNP a un gabinete de bioseguridad estéril y extraiga los ARNm-LNP con una jeringa con una aguja.Filtrar los ARNm-LNP con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros y recogerlos en un tubo cónico estéril. A continuación, coloque 65 microlitros de la solución de ARNm-LNP en un microtubo de 1,5 mililitros para su caracterización. Coloque 5.000 células HepG2 en una placa de pared blanca, fondo transparente, 96 pocillos en 100 microlitros de medio de cultivo celular completo e incube las células durante la noche en una incubadora controlada a 37 grados centígrados que contenga un 5% de dióxido de carbono.Antes del tratamiento de las células con ARNm-LNP, retire el medio completo de los pocillos. A continuación, trate las células con 100 microlitros de ARNm-LNP diluidos en un medio de cultivo celular completo a las dosis deseadas, o 100 microlitros de medio completo antes de una incubación de 24 horas. Después de la incubación, retire el medio de cultivo celular de la placa de 96 pocillos, agregue 20 microlitros de tampón de lisis a cada pocillo seguido de 100 microlitros de los reactivos del ensayo de luciferasa.Proteja la placa de la luz y colóquela en un lector de placas para medir la señal bioluminiscente. Diluir la solución de ARNm-LNP utilizando PBS estéril de modo que haya dos microgramos de ARNm total en 100 microlitros del volumen de inyección de la vena de cola. Llene una jeringa de insulina de calibre 29 con 100 microlitros de ARNm-LNP o 100 microlitros de PBS y elimine las burbujas de la jeringa.Inserte la aguja con el bisel hacia arriba en la vena lateral de la cola del ratón e inyecte lentamente los 100 microlitros de ARNm-LNP o PBS. Seis horas después de la inyección, prepare una solución madre de 15 miligramos por mililitro de sal potásica D-luciferina en PBS estéril. En el software de adquisición de imágenes para el sistema de adquisición de imágenes in vivo, o IVIS, seleccione la casilla junto a luminiscencia antes de pulsar inicializar para preparar el instrumento para la adquisición de datos.A continuación, administre 200 microlitros de D-luciferina por vía intraperitoneal a los ratones previamente tratados y espere 10 minutos mientras la señal de luciferasa se estabiliza antes de anestesiar a los ratones. Transfiera a los ratones anestesiados a los conos de la nariz dentro del sistema de imágenes in vivo, asegurándose de que estén boca arriba con el abdomen expuesto, antes de cerrar la puerta de la cámara. En el software de imágenes, asegúrese de seleccionar el campo de visión correcto y establezca el tiempo de exposición en automático, haga clic en el botón adquirir en el software para obtener imágenes de bioluminiscencia.La eficiencia de encapsulación de los ARNm-LNPs se determinó en un 92,3% utilizando el ensayo de fluorescencia modificado y la ecuación que se muestra aquí. Se observó un aumento de la bioluminiscencia tras el tratamiento de 5.000 células HepG2 con dosis crecientes de ARNm-LNP. La expresión de luciferasa se detectó fácilmente con la dosis más baja de este estudio de cinco nanogramos por pocillo.Se observó una fuerte señal de bioluminiscencia en la parte superior del abdomen de los ratones tratados con LNP formulados. Se dibujaron regiones de interés alrededor de las señales hepáticas para calcular el flujo luminiscente total. El flujo luminiscente total fue de aproximadamente cinco veces 10 a la 9ª.Mantenga siempre la relación entre el peso de los lípidos ionizables y los ácidos nucleicos al formular LNP. Cada volumen de la fase orgánica debe contener lípidos ionizables correspondientes al ARNm en tres volúmenes de la fase acuosa.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

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Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Investigación

Bioingeniería

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

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Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

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La cuantificación de la función diastólica por Global Análisis basado en Modelado cinemático de flujo transmitral mediante el formalismo de llenado diastólico parametrizada

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