Name: investigating the protective effects of platycodin d on non-alcoholic fatty liver disease in a palmitic acid-induced in vitro model
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model at JoVE.com

Questo lavoro è supportato da sovvenzioni della Commissione per la scienza e la tecnologia di Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 e jbky20210029) e della China Postdoctoral Science Foundation (n. 2021MD703919).

Le cellule AML-12 (una normale linea cellulare di epatociti di topo) sono utilizzate per gli studi basati sulle cellule. Le celle sono ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Pretrattamento delle cellule AML-12 per modellare la NAFLD in vitro
<ol><li>Mantenere le cellule in normali terreni di coltura cellulare (DMEM più F12 [1:1] di prosciutto contenente 0,005 mg/ml di insulina, 5 ng/mL di selenio, 0,005 mg/mL di transfe...

Gli studi hanno evidenziato il fatto che la NAFLD è una sindrome clinicopatologica, che va dal fegato grasso alla NASH, che può progredire verso la cirrosi e il cancro al fegato51. Una dieta ricca di grassi e uno stile di vita inattivo sono fattori di rischio tipici per la NAFLD. Sono state studiate sia terapie non farmacologiche che terapie farmacologiche per il trattamento della NAFLD51,52,53. Tuttavi...

Platycodon grandiflorus (PG), che è la radice essiccata di Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., è usato nella medicina tradizionale cinese (MTC). Viene prodotto principalmente nelle regioni nord-est, nord, est, centro e sud-ovest della Cina1. I componenti PG includono saponine triterpenoidi, polisaccaridi, flavonoidi, polifenoli, glicoli polietilenico, oli volatili e minerali2. PG ha una lunga storia di essere usato come alimento e una medicina a base di erbe in Asia. Tradizionalmente, questa erba è stata usata per fare medicina contro le malattie polmonari. La farmacologia moderna fornisce anche prove dell'efficacia della PG per il trattamento di altre malattie. Gli studi hanno dimostrato che PG ha un effetto terapeutico su una varietà di modelli di danno epatico indotti da farmaci. L'integrazione alimentare di estratti di PG o platycodin può migliorare l'obesità indotta dalla dieta ricca di grassi e le sue malattie metaboliche correlate 3,4,5. I polisaccaridi da PG possono essere utilizzati per il trattamento del danno epatico acuto causato da LPS/D-GalN nei topi6. Inoltre, le saponine dalle radici di PG migliorano la steatoepatite non alcolica (NASH) indotta dalla dieta ricca di grassi7. Inoltre, la platycodin D (PD), uno dei componenti terapeutici più importanti della PG, può migliorare l'espressione del recettore delle lipoproteine a bassa densità e l'assorbimento delle lipoproteine a bassa densità nelle cellule del carcinoma epatocellulare umano (HepG2)8. Inoltre, il PD può anche indurre apoptosi e inibire l'adesione, la migrazione e l'invasione nelle cellule HepG2 9,10. Pertanto, in questo studio, le cellule AML-12 dell'epatoma di topo vengono utilizzate per la costruzione di modelli in vitro e per studiare ulteriormente gli effetti farmacologici e i meccanismi sottostanti del PD in questo modello.
Il termine steatosi epatica non alcolica (NAFLD) si riferisce a un gruppo di malattie del fegato che include steatosi semplice, NASH, cirrosi e carcinoma epatocellulare11. Sebbene la patogenesi della NAFLD non sia completamente compresa, dalla classica teoria "two-hit" all'attuale teoria "multiple-hit", la resistenza all'insulina è considerata centrale nella patogenesi della NAFLD12,13,14. Gli studi hanno dimostrato che la resistenza all'insulina negli epatociti potrebbe portare ad un aumento degli acidi grassi liberi, che formano trigliceridi che si depositano nel fegato e causano il fegato a diventare grasso15,16. L'accumulo di grasso può portare a lipotossicità, disfunzione mitocondriale indotta da stress ossidativo, stress del reticolo endoplasmatico e rilascio di citochine infiammatorie, con conseguente patogenesi e progressione della NAFLD17,18. Inoltre, l'autofagia svolge anche un ruolo nella patogenesi della NAFLD, in quanto è coinvolta nella regolazione della sensibilità cellulare all'insulina, del metabolismo lipidico cellulare, del danno degli epatociti e dell'immunità innata 19,20,21.
Una varietà di modelli animali e modelli cellulari sono stati stabiliti per fornire una base per esplorare la patogenesi e potenziali bersagli terapeutici di NAFLD22,23. Tuttavia, i singoli modelli animali non possono imitare completamente tutti i processi patologici della NAFLD24. Le differenze individuali tra gli animali portano a diverse caratteristiche patologiche. L'utilizzo di linee cellulari epatiche o epatociti primari in studi in vitro di NAFLD garantisce la massima coerenza nelle condizioni sperimentali. La disregolazione del metabolismo lipidico epatico può portare a livelli più elevati di accumulo di goccioline lipidiche epatocitarie nella NAFLD25. Gli acidi grassi liberi come l'acido oleico e l'olio di palma sono stati utilizzati nel modello in vitro per imitare la NAFLD causata da una dieta ricca di grassi26,27. La linea cellulare di epatoblastoma umano HepG2 è spesso utilizzata nella costruzione di modelli NAFLD in vitro, ma, come linea cellulare tumorale, il metabolismo delle cellule HepG2 è significativamente diverso da quello delle cellule epatiche in normali condizioni fisiologiche28. Pertanto, l'utilizzo di epatociti primari o epatociti primari di topo per costruire il modello NAFLD in vitro per lo screening farmacologico è più vantaggioso rispetto all'utilizzo di linee cellulari tumorali. Confrontando l'esame sinergico degli effetti dei farmaci e dei bersagli terapeutici sia in modelli animali che in modelli di epatociti in vitro, sembra che l'utilizzo di epatociti murini per costruire il modello NAFLD in vitro abbia un migliore potenziale applicativo.
Gli acidi grassi liberi che entrano nel fegato vengono ossidati per produrre energia o immagazzinati come trigliceridi. Significativamente, gli acidi grassi liberi hanno una certa lipotossicità e possono indurre disfunzione cellulare e apoptosi12. L'acido palmitico (PA) è l'acido grasso saturo più abbondante nel plasma umano29. Quando le cellule nel tessuto non adiposo sono esposte ad alte concentrazioni di PA per lungo tempo, questo stimola la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e provoca stress ossidativo, accumulo lipidico e persino apoptosi30. Pertanto, molti ricercatori usano la PA come induttore per stimolare le cellule del fegato a produrre ROS e, quindi, costruire il modello di steatosi epatica in vitro e valutare gli effetti protettivi di alcuni principi attivi sulle cellule31,32,33,34. Questo studio introduce un protocollo per studiare gli effetti protettivi del PD su un modello cellulare di NAFLD indotto da PA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% BSA Blocking Buffer</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AML12 (alpha mouse liver 12) cell line</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>AML12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beyo ECL&#160;Plus</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0018S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-safety cabinet</td>
			<td>Esco Micro Pte Ltd, Singapore</td>
			<td>AC2-5S1 A2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture CO2 Incubator</td>
			<td>Esco Micro Pte Ltd, Singapore</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>ST125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>SH30406.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ABclonal, Wuhan, China</td>
			<td>AS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100&#215;</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>C0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP LC3&#946; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>SC-376404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>M8650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted Microscope IX53</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>IX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic Acid</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl&#160;fluoride</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>ST506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platycodin D</td>
			<td>Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>CSA: 58479-68-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail for general use, 100x</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>PR1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Oxygen Species Assay Kit</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>CA1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA&#160;Lysis&#160;Buffer</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0013E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0012AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Centrifuge</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>3K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQSTM1/p62 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>SC-28359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 PRO&#160;&#160;</td>
			<td>Tecan Austria GmbH, Austria</td>
			<td>1510002987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WB Transfer Buffer,10x</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>D1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin Mouse mAb</td>
			<td>ABclonal, Wuhan, China</td>
			<td>AC004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the protective effects of platycodin d on non-alcoholic fatty liver disease in a palmitic acid-induced in vitro model

L'incidenza della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è aumentata a un ritmo allarmante in tutto il mondo. Platycodon grandiflorum è ampiamente usato come etnomedicina tradizionale per il trattamento di varie malattie ed è un tipico alimento funzionale che può essere incorporato nella dieta quotidiana. Gli studi hanno suggerito che il platycodin D (PD), uno dei principali ingredienti attivi di Platycodon grandiflorum, ha un'elevata biodisponibilità e mitiga significativamente il progresso della NAFLD, ma il meccanismo sottostante di questo non è ancora chiaro. Questo studio mira a studiare l'effetto terapeutico del PD contro la NAFLD in vitro. Le cellule AML-12 sono state pretrattate con acido palmitico (PA) da 300 μM per 24 ore per modellare la NAFLD in vitro. Quindi, le cellule sono state trattate con PD o non hanno ricevuto alcun trattamento PD per 24 ore. I livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono stati analizzati utilizzando la colorazione con 2′,7′-dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA) e il potenziale della membrana mitocondriale è stato determinato dal metodo di colorazione JC-1. Inoltre, i livelli di espressione proteica di LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1 nei lisati cellulari sono stati analizzati mediante western blotting. È stato riscontrato che il PD riduce significativamente i livelli di ROS e di potenziale della membrana mitocondriale nel gruppo trattato con PA rispetto al gruppo di controllo. Nel frattempo, il PD ha aumentato i livelli di LC3-II / LC3-I e diminuito i livelli di p62 / SQSTM1 nel gruppo trattato con PA rispetto al gruppo di controllo. I risultati hanno indicato che il PD ha migliorato la NAFLD in vitro riducendo lo stress ossidativo e stimolando l'autofagia. Questo modello in vitro è uno strumento utile per studiare il ruolo del PD nella NAFLD.

ROS intracellulari nelle cellule Le cellule AML-12 sono state indotte con 300 μM PA per 24 ore ed è stato stabilito un modello di cellule NAFLD. Successivamente, le cellule sono state trattate con PD per 24 ore. Le cellule sono state etichettate con una sonda fluorescente DCFH-DA e la produzione di ROS è stata osservata al microscopio a fluorescenza. I risultati della colorazione DCFH-DA dei ROS intracellulari nelle cellule sono mostrati in Figura 1. I risultati hanno ...

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Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Questo protocollo studia gli effetti protettivi della platycodin D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello in vitro indotto dall'acido palmitico.

Studio degli effetti protettivi del platicodina D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello in vitro indotto da acido palmitico

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Questo metodo dimostra l'uso di cellule AML-12 che consentiranno la costruzione del modello e lo studio degli effetti protettivi della platycodin D sulla NAFLD. L'eccessiva dipendenza dall'uso di modelli animali aumenta l'onere dello sviluppo di farmaci terapeutici. L'utilizzo di modelli cellulari nella fase iniziale dello sviluppo di farmaci NAFLD è più pratico ed economico.Questo modello TCM può aiutare a migliorare la comprensione della funzione biologica della platycodin D e aiutare a studiare l'uso di altri TCM per il trattamento della NAFLD. Inizia seminando un millilitro di cellule AML-12 per pozzetto in piastre da 12 pozzetti. Quindi dividere la piastra a 12 pozzetti in quattro diversi gruppi di trattamento ed etichettarli come gruppo trattato con controllo, trattato PD, trattato PA e gruppo trattato PA più PD.Aggiungere un millilitro del normale terreno di coltura cellulare per pozzetto al gruppo di controllo e al gruppo trattato con PD. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con acido palmitico micromolare 300 al gruppo trattato con PA e PA più PD. Dopo 24 ore di incubazione, rimuovere il terreno di coltura delle cellule e quindi lavare le cellule con un millilitro di terreno senza siero due volte.Successivamente, aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con un veicolo al gruppo di controllo e un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con un platycodin D micromolare al gruppo trattato con PD. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con acido palmitico micromolare 300 al gruppo trattato con PA e un millilitro di terreno di coltura cellulare normale integrato con acido palmitico micromolare 300 e un platycodin D micromolare al gruppo trattato PA più PD. Dopo aver trattato le cellule per 24 ore, lavare le cellule con un millilitro di 1X PBS per pozzetto tre volte.Quindi colorare le cellule con 100 microlitri di 10 micromolari DCFH-DA per pozzetto. Incubare le cellule al buio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 1X PBS tre volte e aggiungere un millilitro di 1X PBS a ciascun pozzetto.Posizionare la piastra a 12 pozzetti sul palco del microscopio e utilizzare un obiettivo 20X per osservare la morfologia delle cellule con un ingrandimento di 200X. Per misurare il potenziale della membrana mitocondriale, lavare le cellule trattate preparate in precedenza con un millilitro di 1X PBS per pozzetto tre volte. Quindi colorare le cellule con 100 microlitri di cinque microgrammi per millilitro di soluzione di lavoro JC-1 e incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio.Quindi lavare le celle con 1X PBS tre volte e aggiungere un millilitro di 1X PBS a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 12 pozzetti sul palco del microscopio e utilizzare un obiettivo 20X per osservare la morfologia delle cellule con un ingrandimento di 200X. Lisare le cellule trattate e raccogliere il lisato cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Centrifugare i tubi a 12.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere 5X SDS-PAGE sample loading buffer al surnatante di lisato cellulare con un rapporto di volume da uno a quattro. Quindi, posizionare il gel 12% SDS-PAGE preparato con 12 pozzetti nel serbatoio di elettroforesi e aggiungere 1X SDS fino tampone campione diluito con acqua ultrapura al limite di altezza raccomandato.Dopo l'elettroforesi SDS-PAGE, effettuare l'elettrotrasferimento delle proteine su una membrana PVDF da 0,45 micron. Incubare la membrana in cinque millilitri degli anticorpi primari diluiti nel tampone bloccante. Utilizzare anticorpi specifici per LC-III, p62 e beta-actina.Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi incubare la membrana PVDF con anticorpo secondario LGG HRP anti-topo coniglio diluito da uno a 10.000 in tampone bloccante. Incubare la membrana a temperatura ambiente al riparo dalla luce per due ore.Dopo l'incubazione, posizionare la membrana PVDF su un involucro di plastica. Aggiungere una quantità appropriata di soluzione di lavoro ECL e incubare per due minuti. Quindi rimuovere la soluzione di lavoro ECL ed esporre la membrana PVDF nel sistema di imaging per lo sviluppo dell'immagine.La colorazione DCFH-DA ha mostrato che la platycodin D potrebbe ridurre significativamente il livello di ROS intracellulare nelle cellule ALM-12, indicando che questo trattamento può ridurre lo stress ossidativo cellulare. Inoltre, la fluorescenza verde che rappresenta i monomeri JC-1 o i mitocondri depolarizzati era più alta nelle cellule trattate con acido palmitico rispetto alle cellule non trattate, mentre la fluorescenza rossa che rappresentava i dimeri JC-1 o i mitocondri polarizzati era inferiore nelle cellule trattate con acido palmitico rispetto alle cellule non trattate, indicando la depolarizzazione MMP indotta dall'acido palmitico. Inoltre, rispetto al gruppo modello, il rapporto tra monomeri JC-1 e dimeri è diminuito nel gruppo di trattamento con platycodin D, indicando che potrebbe migliorare l'MMP indotto dall'acido palmitico.I livelli di espressione proteica delle proteine LC-III e p62 correlate all'autofagia sono stati studiati mediante western blotting. Il rapporto tra LC-32 e LC-31 è diminuito significativamente e il livello di espressione proteica di p62 è aumentato dopo essere stato trattato con acido palmitico. D'altra parte, la platycodin D ha ridotto significativamente il livello di espressione proteica di p62 e aumentato il rapporto tra LC-32 e LC-31, indicando il ripristino del flusso autofagico indotto dall'acido palmitico.Se il valore di fluorescenza delle cellule nel gruppo di controllo negativo è relativamente alto, le concentrazioni di lavoro delle sonde fluorescenti possono essere regolate secondo necessità.

Research

JoVE Journal

Medicine

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

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