Name: investigating the protective effects of platycodin d on non-alcoholic fatty liver disease in a palmitic acid-induced in vitro model
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00
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この研究は、重慶科学技術委員会(cstc2020jxjl-jbky10002、jbky20200026、cstc2021jscx-dxwtBX0013、およびjbky20210029)および中国ポスドク科学基金会(No.2021MD703919)からの助成金によってサポートされています。

AML-12細胞(正常マウス肝細胞株)は、細胞ベースの研究に使用されます。セルは市販の供給源から入手されます( 材料表を参照)。
1. AML-12細胞をin vitroでNAFLDをモデル化するための前処理
<ol><li>正常な細胞培養培地(DMEMとハムのF12 [1:1]0.005 mg/mLインスリン、5 ng/mLセレン、0.005 mg/mLトランスフェリン、40 ng/mLデキサメタゾン、および10%ウシ胎児血?...

研究は、NAFLDが脂肪肝からNASHに至るまでの臨床病理学的症候群であり、肝硬変および肝臓癌に進行する可能性があるという事実を強調しています51。高脂肪食と非アクティブなライフスタイルは、NAFLDの典型的な危険因子です。NAFLD治療のための非薬物療法と薬物療法の両方が研究されています51,52,53。し?...

プラティコドングランディフロラス(PG)、プラティコドングランディフロラス(Jacq)の乾燥根です。A.DC.は、伝統的な漢方薬(TCM)で使用されています。主に中国の北東部、北部、東部、中部、南西部で生産されています1。PG成分としては、トリテルペノイドサポニン、多糖類、フラボノイド、ポリフェノール、ポリエチレングリコール、揮発油、ミネラル2などが挙げられる。PGは、アジアで食品や漢方薬として使用されてきた長い歴史があります。伝統的に、このハーブは肺疾患に対する薬を作るために使用されていました。現代の薬理学はまた、他の疾患を治療するためのPGの有効性の証拠を提供する。研究によると、PGはさまざまな薬物誘発性肝障害モデルに治療効果があることが示されています。PGまたはプラチコジン抽出物の栄養補助食品は、高脂肪食誘発性肥満およびそれに関連する代謝性疾患を改善することができます3,4,5。PG由来の多糖類は、マウスのLPS/D-GalNによって引き起こされる急性肝障害の治療に使用できます6。さらに、PGの根からのサポニンは、高脂肪食誘発性非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を改善します7。さらに、PGの最も重要な治療成分の1つであるプラチコジンD(PD)は、ヒト肝細胞癌(HepG2)細胞における低密度リポタンパク質受容体の発現および低密度リポタンパク質の取り込みを増強することができる8。さらに、PDはまた、アポトーシスを誘導し、HepG2細胞における接着、遊走、および浸潤を阻害することができる9,10。したがって、この研究では、マウス肝癌AML-12細胞を使用してin vitroモデルを構築し、このモデルにおけるPDの薬理学的効果と根底にあるメカニズムをさらに研究します。
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)という用語は、単純性脂肪症、NASH、肝硬変、および肝細胞癌を含む肝疾患のグループを指す11。NAFLDの病因は不完全に理解されていますが、古典的な「ツーヒット」理論から現在の「マルチヒット」理論まで、インスリン抵抗性はNAFLDの病因の中心であると考えられています12,13,14。研究によると、肝細胞のインスリン抵抗性は遊離脂肪酸の増加につながり、肝臓に沈着して肝臓を脂肪にするトリグリセリドを形成します15,16。脂肪の蓄積は、脂肪毒性、酸化ストレス誘発性ミトコンドリア機能障害、小胞体ストレス、および炎症性サイトカイン放出を引き起こし、NAFLDの病因と進行を引き起こす可能性があります17,18。さらに、オートファジーは、細胞のインスリン感受性、細胞脂質代謝、肝細胞損傷、および自然免疫の調節に関与しているため、NAFLDの病因にも役割を果たします19,20,21。
NAFLD22,23の病因および潜在的な治療標的を探索するための基礎を提供するために、様々な動物モデルおよび細胞モデルが確立されている。ただし、単一の動物モデルは、NAFLD24のすべての病理学的プロセスを完全に模倣することはできません。動物間の個人差は異なる病理学的特徴をもたらす。NAFLDのin vitro研究で肝細胞株または初代肝細胞を使用すると、実験条件で最大の一貫性が保証されます。肝脂質代謝調節不全は、NAFLD25における肝細胞脂質液滴蓄積のレベルを高める可能性があります。オレイン酸やパーム油などの遊離脂肪酸は、高脂肪食によって引き起こされるNAFLDを模倣するためにin vitroモデルで使用されています26,27。ヒト肝芽腫細胞株HepG2は、in vitroでのNAFLDモデルの構築によく使用されますが、腫瘍細胞株として、HepG2細胞の代謝は、通常の生理学的条件下での肝細胞の代謝とは大きく異なります28。したがって、初代肝細胞またはマウス初代肝細胞を使用して薬物スクリーニングのためのin vitro NAFLDモデルを構築することは、腫瘍細胞株を使用するよりも有利である。動物モデルとin vitro肝細胞モデルの両方での薬物効果と治療標的の相乗的検討を比較すると、マウス肝細胞を使用してin vitro NAFLDモデルを構築する方が、より良い応用の可能性を秘めているようです。
肝臓に入る遊離脂肪酸は酸化されてエネルギーを生成するか、トリグリセリドとして貯蔵されます。重要なことに、遊離脂肪酸は特定の脂肪毒性を有し、細胞機能障害およびアポトーシスを誘発し得る12。パルミチン酸(PA)は、ヒト血漿中に最も豊富に存在する飽和脂肪酸である29。非脂肪組織の細胞が高濃度のPAに長時間さらされると、これは活性酸素種(ROS)の産生を刺激し、酸化ストレス、脂質蓄積、さらにはアポトーシスを引き起こします30。したがって、多くの研究者は、肝細胞を刺激してROSを産生するための誘導因子としてPAを使用し、したがって、in vitro脂肪肝疾患モデルを構築し、細胞に対する特定の活性物質の保護効果を評価します31、32、33、34。この研究では、PAによって誘導されるNAFLDの細胞モデルに対するPDの保護効果を調査するためのプロトコルを紹介します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% BSA Blocking Buffer</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AML12 (alpha mouse liver 12) cell line</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>AML12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beyo ECL&#160;Plus</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0018S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-safety cabinet</td>
			<td>Esco Micro Pte Ltd, Singapore</td>
			<td>AC2-5S1 A2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture CO2 Incubator</td>
			<td>Esco Micro Pte Ltd, Singapore</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>ST125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>SH30406.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ABclonal, Wuhan, China</td>
			<td>AS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100&#215;</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>C0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP LC3&#946; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>SC-376404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>M8650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted Microscope IX53</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>IX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic Acid</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl&#160;fluoride</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>ST506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platycodin D</td>
			<td>Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>CSA: 58479-68-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail for general use, 100x</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>PR1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Oxygen Species Assay Kit</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>CA1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA&#160;Lysis&#160;Buffer</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0013E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0012AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Centrifuge</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>3K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQSTM1/p62 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>SC-28359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 PRO&#160;&#160;</td>
			<td>Tecan Austria GmbH, Austria</td>
			<td>1510002987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WB Transfer Buffer,10x</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>D1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin Mouse mAb</td>
			<td>ABclonal, Wuhan, China</td>
			<td>AC004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the protective effects of platycodin d on non-alcoholic fatty liver disease in a palmitic acid-induced in vitro model

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の発生は、世界中で驚くべき速度で増加しています。 プラティコドングランディフロラム は、さまざまな病気の治療のための伝統的な民族医学として広く使用されており、毎日の食事に組み込むことができる典型的な機能性食品です。研究によると、プラ ティコドングランディフロラムの主要な有効成分の1つであるプラチコジンD(PD)は、バイオアベイラビリティが高く、NAFLDの進行を大幅に緩和することが示唆されていますが、その根本的なメカニズムはまだ不明です。この研究は、 インビトロでのNAFLDに対するPDの治療効果を調査することを目的としています。AML-12細胞を300μMパルミチン酸(PA)で24時間前処理し、 in vitroでNAFLDをモデル化した。次いで、細胞をPDで処理するか、または24時間PD処理を受けなかった。活性酸素種(ROS)を2',7'-ジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテート(DCFH-DA)染色を用いて分析し、ミトコンドリア膜電位をJC-1染色法により決定した。さらに、細胞ライセート中のLC3-II/LC3-Iおよびp62/SQSTM1のタンパク質発現レベルをウェスタンブロッティングにより解析した。PDは、対照群と比較して、PA治療群におけるROSおよびミトコンドリア膜電位レベルを有意に低下させることがわかった。一方、PDは、対照群と比較して、PA治療群でLC3-II / LC3-Iレベルを上昇させ、p62 / SQSTM1レベルを低下させました。結果は、PDが酸化ストレスを軽減し、オートファジーを刺激することによってin vitro でNAFLDを改善することを示しました。この インビトロ モデルは、NAFLDにおけるPDの役割を研究するための有用なツールです。

細胞内の細胞内ROS AML-12細胞を300 μM PAで24時間誘導し、NAFLD細胞モデルを確立しました。続いて、細胞をPDで24時間処理した。細胞をDCFH-DA蛍光プローブで標識し、ROS産生を蛍光顕微鏡下で観察した。細胞内の細胞内ROSのDCFH-DA染色の結果を 図1に示す。結果は、PDが300μMのPA(P < 0.01)でインキュベートされた細胞の細胞内ROSのレベルを大幅に低下させるこ?...

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Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

このプロトコルは、パルミチン酸誘発 インビトロ モデルにおける非アルコール性脂肪肝疾患に対するプラチコジンDの保護効果を調査します。

パルミチン酸誘発 In vitro モデルにおける非アルコール性脂肪性肝疾患に対するプラチコジンDの保護効果の調査

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

この方法は、モデルの構築とNAFLDに対するプラチコジンDの保護効果の調査を可能にするAML-12細胞の使用を示しています。動物モデルの使用に過度に依存すると、治療薬開発の負担が増大します。NAFLD医薬品開発の初期段階で細胞モデルを使用することは、より実用的で費用効果が高い。このTCMモデルは、プラチコジンDの生物学的機能の理解を深め、NAFLDの治療のための他のTCMの使用を研究するのに役立つ可能性があります。まず、1ウェルあたり1ミリリットルのAML-12細胞を12ウェルプレートに播種します。次に、12ウェルプレートを4つの異なる治療群に分け、それらをコントロール、PD処理、PA処理、およびPAプラスPD処理群としてラベル付けします。ウェルあたり1ミリリットルの正常細胞培養培地をコントロールおよびPD処理群に加えます。300マイクロモルのパルミチン酸を添加した1ミリリットルの正常細胞培養培地をPA処理群およびPAプラスPD処理群に加える。24時間のインキュベーション後、細胞の培養液を取り除き、1ミリリットルの無血清培地で細胞を2回洗浄します。次に、コントロール群にビヒクルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを、PD処理群に1マイクロモルのプラチコジンDを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを添加する。PA処理群にパルミチン酸300マイクロモルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを、PA添加PD処理群にパルミチン酸300マイクロモルおよびプラチコジンD1マイクロモルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを添加する。細胞を24時間処理した後、ウェルあたり1ミリリットルの1X PBSで細胞を3回洗浄します。次いで、ウェル当たり100マイクロリットルの10マイクロモルDCFH-DAで細胞を染色する。細胞を暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を1X PBSで3回洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの1X PBSを加えます。12ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、20倍の対物レンズを使用して、200倍の倍率で細胞の形態を観察します。ミトコンドリア膜電位を測定するには、以前に調製した処理細胞をウェルあたり1ミリリットルの1X PBSで3回洗浄します。次に、1ミリリットルあたり5マイクログラムの100マイクロリットルのJC-1作業溶液で細胞を染色し、暗所で摂氏37度で30分間細胞をインキュベートします。次に、細胞を1X PBSで3回洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの1X PBSを加えます。12ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、20倍の対物レンズを使用して、200倍の倍率で細胞の形態を観察します。処理した細胞を溶解し、細胞溶解液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。チューブを12, 000 Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。次に、5X SDS-PAGEサンプルローディングバッファーを細胞ライセート上清に1対4の容量比で加えます。次に、調製した12%SDS-PAGEゲルを12ウェルで電気泳動槽に入れ、超純水で希釈した1X SDSアップサンプルバッファーを推奨高さ限界まで加えます。SDS-PAGE電気泳動後、0.45ミクロンのPVDFメンブレンへのタンパク質の電気転写を実行します。ブロッキングバッファーで希釈した5ミリリットルの一次抗体でメンブレンをインキュベートします。LC-III、p62、およびベータアクチンに特異的な抗体を使用してください。摂氏4度で一晩インキュベートします。次いで、PVDF膜をブロッキングバッファー中で1〜10,000に希釈したウサギ抗マウスLGG HRP二次抗体と共にインキュベートする。メンブレンを光から保護された室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、PVDFメンブレンをラップの上に置きます。適量のECL作業溶液を加え、2分間インキュベートします。次に、ECL作業溶液を取り出し、画像現像のためにイメージングシステムでPVDF膜を露出させます。DCFH-DA染色は、プラチコジンDがALM-12細胞の細胞内ROSレベルを有意に低下させる可能性があることを示し、この処理が細胞の酸化ストレスを軽減できることを示しています。また,JC-1モノマーまたは脱分極ミトコンドリアを表す緑色蛍光はパルミチン酸処理細胞の方が未処理細胞よりも高く,JC-1二量体または偏光ミトコンドリアを表す赤色蛍光はパルミチン酸処理細胞の方が未処理細胞よりも低く,パルミチン酸誘導MMP脱分極を示した。また、プラチコジンD処理群では、モデル群と比較して、JC-1モノマーの二量体に対する比率が減少し、パルミチン酸誘導MMPを改善できることが示された。オートファジー関連タンパク質LC-IIIおよびp62のタンパク質発現レベルをウェスタンブロッティングにより調べた。LC-32とLC-31の比率は有意に減少し、p62のタンパク質発現量はパルミチン酸で処理した後に増加した。一方、プラチコジンDはp62のタンパク質発現量を有意に低下させ、LC-32とLC-31の比率を増加させ、パルミチン酸によって誘導されるオートファジーフラックスの回復を示しました。陰性対照群の細胞の蛍光値が比較的高い場合は、必要に応じて蛍光プローブの使用濃度を調整することができる。

Research

JoVE Journal

Medicine

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

マウスにおけるタキサンの薬物動態学的および薬力学的分析のための頸動脈煎茶

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Quick Phenotypic Neurological Scoring System for Evaluating Disease Progression in the SOD1-G93A Mouse Model of ALS

ALSのSOD1-G93Aマウスモデルにおける疾患進行を評価するためのクイック表現型の神経学的スコアリングシステム

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

ラットにおけるジメチルニトロソアミン誘発性肝線維症モデル

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

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In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

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プラズマ凝固体内大動物モデルの肝臓組織の評価

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) の解像度を評価するためにマウスで存続可能肝生検の手順の定款

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

冠動脈血管新生のインビトロモデル

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...