Name: investigating the protective effects of platycodin d on non-alcoholic fatty liver disease in a palmitic acid-induced in vitro model
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00
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Este trabalho é apoiado por subsídios da Comissão de Ciência e Tecnologia de Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 e jbky20210029) e da China Postdoctoral Science Foundation (No. 2021MD703919).

As células AML-12 (uma linhagem normal de hepatócitos de camundongos) são usadas para os estudos baseados em células. As células são obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Pré-tratamento das células AML-12 para modelagem da DHGNA in vitro
<ol><li>Manter as células em meios de cultura celular normais (DMEM mais F12 de Ham's [1:1] contendo 0,005 mg/mL de insulina, 5 ng/mL de selênio, 0,005 mg/mL de transferrina, 40 ng/...

Estudos têm destacado o fato de que a DHGNA é uma síndrome clinicopatológica, que varia de esteatose hepática a EHNA, que pode evoluir para cirrose e câncer hepático51. Uma dieta rica em gordura e um estilo de vida inativo são fatores de risco típicos para DHGNA. Tanto terapias não medicamentosas quanto terapias medicamentosas para o tratamento da DHGNA têm sido pesquisadas51,52,53. Entretanto,...

Platycodon grandiflorus (PG), que é a raiz seca de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., é usado na medicina tradicional chinesa (MTC). É produzido principalmente nas regiões nordeste, norte, leste, central e sudoeste da China1. Os componentes do PG incluem saponinas triterpenóides, polissacarídeos, flavonoides, polifenóis, polietilenoglicóis, óleos voláteis e minerais2. PG tem uma longa história de ser usado como um alimento e um fitoterápico na Ásia. Tradicionalmente, esta erva foi usada para fazer medicina contra doenças pulmonares. A farmacologia moderna também fornece evidências da eficácia do PG para o tratamento de outras doenças. Estudos têm demonstrado que o PG tem um efeito terapêutico em uma variedade de modelos de lesão hepática induzida por drogas. A suplementação dietética de extratos de PG ou platicodina pode amenizar a obesidade induzida por dieta hiperlipídica e suas doenças metabólicas relacionadas 3,4,5. Polissacarídeos de PG podem ser utilizados no tratamento da lesão hepática aguda causada por LPS/D-GalN em camundongos6. Além disso, as saponinas das raízes do PG melhoram a esteatohepatite não alcoólica induzida por dieta hiperlipética (EHNA)7. Além disso, a platicodina D (PD), um dos mais importantes componentes terapêuticos do PG, pode aumentar a expressão do receptor de lipoproteína de baixa densidade e a captação de lipoproteína de baixa densidade em células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2)8. Além disso, a DP também pode induzir apoptose e inibir a adesão, migração e invasãoem células HepG29,10. Assim, neste estudo, células AML-12 de hepatoma de camundongo são utilizadas para a construção de modelos in vitro e para aprofundar o estudo dos efeitos farmacológicos e mecanismos subjacentes da DP nesse modelo.
O termo doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) refere-se a um grupo de doenças hepáticas que inclui esteatose simples, EHNA, cirrose e carcinomahepatocelular11. Embora a patogênese da DHGNA seja incompletamente compreendida, desde a teoria clássica dos "dois acertos" até a atual teoria dos "múltiplos acertos", a resistência à insulina é considerada central na patogênese da DHGNA12,13,14. Estudos têm demonstrado que a resistência à insulina nos hepatócitos poderia levar ao aumento dos ácidos graxos livres, que formam triglicerídeos que se depositam no fígado e causam gordurinhas no fígado15,16. O acúmulo de gordura pode levar à lipotoxicidade, disfunção mitocondrial induzida por estresse oxidativo, estresse do retículo endoplasmático e liberação de citocinas inflamatórias, resultando na patogênese e progressão da DHGNA17,18. Além disso, a autofagia também desempenha um papel na patogênese da DHGNA, pois está envolvida na regulação da sensibilidade celular à insulina, do metabolismo lipídico celular, da lesão dos hepatócitos e da imunidade inata 19,20,21.
Uma variedade de modelos animais e modelos celulares tem sido estabelecida para fornecer uma base para explorar a patogênese e potenciais alvos terapêuticos da DHGNA22,23. No entanto, modelos animais isolados não conseguem mimetizar completamente todos os processos patológicos da DHGNA24. Diferenças individuais entre os animais levam a diferentes características patológicas. O uso de linhagens celulares hepáticas ou hepatócitos primários em estudos in vitro de DHGNA garante a máxima consistência nas condições experimentais. A desregulação do metabolismo lipídico hepático pode levar a níveis mais elevados de acúmulo de gotículas lipídicas de hepatócitos na DHGNA25. Ácidos graxos livres, como ácido oleico e óleo de palma, têm sido utilizados no modelo in vitro para mimetizar a DHGNA causada por uma dieta hiperlipídica26,27. A linhagem celular HepG2 do hepatoblastoma humano é frequentemente utilizada na construção de modelos de DHGNA in vitro, mas, como linhagem celular tumoral, o metabolismo das células HepG2 é significativamente diferente daquele das células hepáticas em condições fisiológicasnormais28. Portanto, o uso de hepatócitos primários ou hepatócitos primários de camundongos para construir o modelo de DHGNA in vitro para triagem de drogas é mais vantajoso do que o uso de linhagens de células tumorais. Comparando o exame sinérgico dos efeitos de drogas e alvos terapêuticos em modelos animais e modelos de hepatócitos in vitro, parece que o uso de hepatócitos de camundongo para construir o modelo in vitro de DHGNA tem melhor potencial de aplicação.
Os ácidos graxos livres que entram no fígado são oxidados para produzir energia ou armazenados como triglicerídeos. Significativamente, os ácidos graxos livres apresentam certa lipotoxicidade e podem induzir disfunção celular e apoptose12. O ácido palmítico (AP) é o ácido graxo saturado mais abundante no plasma humano29. Quando as células do tecido não adiposo são expostas a altas concentrações de AF por longo tempo, isso estimula a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e causa estresse oxidativo, acúmulo de lipídios e até apoptose30. Portanto, muitos pesquisadores utilizam a AP como indutor para estimular as células hepáticas a produzirem ERO e, assim, construir o modelo de doença hepática gordurosa in vitro e avaliar os efeitos protetores de determinadas substâncias ativas sobre as células31,32,33,34. Este estudo apresenta um protocolo para investigar os efeitos protetores da DP em um modelo celular de DHGNA induzida por AF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% BSA Blocking Buffer</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AML12 (alpha mouse liver 12) cell line</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>AML12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beyo ECL&#160;Plus</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0018S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-safety cabinet</td>
			<td>Esco Micro Pte Ltd, Singapore</td>
			<td>AC2-5S1 A2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture CO2 Incubator</td>
			<td>Esco Micro Pte Ltd, Singapore</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>ST125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>SH30406.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ABclonal, Wuhan, China</td>
			<td>AS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100&#215;</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>C0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP LC3&#946; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>SC-376404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>M8650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted Microscope IX53</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>IX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic Acid</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl&#160;fluoride</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>ST506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platycodin D</td>
			<td>Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>CSA: 58479-68-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail for general use, 100x</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>PR1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Oxygen Species Assay Kit</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>CA1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA&#160;Lysis&#160;Buffer</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0013E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0012AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Centrifuge</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>3K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQSTM1/p62 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>SC-28359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 PRO&#160;&#160;</td>
			<td>Tecan Austria GmbH, Austria</td>
			<td>1510002987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WB Transfer Buffer,10x</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>D1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin Mouse mAb</td>
			<td>ABclonal, Wuhan, China</td>
			<td>AC004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the protective effects of platycodin d on non-alcoholic fatty liver disease in a palmitic acid-induced in vitro model

A ocorrência da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) vem aumentando de forma alarmante em todo o mundo. Platycodon grandiflorum é amplamente utilizado como uma etnomedicina tradicional para o tratamento de várias doenças e é um alimento funcional típico que pode ser incorporado na dieta diária. Estudos têm sugerido que a platicodina D (PD), um dos principais ingredientes ativos do Platycodon grandiflorum, tem alta biodisponibilidade e atenua significativamente o progresso da DHGNA, mas o mecanismo subjacente a isso ainda não está claro. Este estudo tem como objetivo investigar in vitro o efeito terapêutico da DP contra a DHGNA. Células AML-12 foram pré-tratadas com ácido palmítico (PA) 300 μM por 24 h para modelo de DHGNA in vitro. Em seguida, as células foram tratadas com DP ou não receberam tratamento de DP por 24 horas. Os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) foram analisados usando a coloração de 2′,7′-dicloro-diidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA), e o potencial de membrana mitocondrial foi determinado pelo método de coloração JC-1. Além disso, os níveis de expressão proteica de LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1 nos lisados celulares foram analisados por western blotting. Descobriu-se que a DP diminuiu significativamente os níveis de ROS e potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado com AP em comparação com o grupo controle. Enquanto isso, a DP aumentou os níveis de LC3-II/LC3-I e diminuiu os níveis de p62/SQSTM1 no grupo tratado com AP em comparação com o grupo controle. Os resultados indicaram que a DP melhorou a DHGNA in vitro , reduzindo o estresse oxidativo e estimulando a autofagia. Este modelo in vitro é uma ferramenta útil para estudar o papel da DP na DHGNA.

ERO intracelular nas células Células AML-12 foram induzidas com 300 μM de PA por 24 h, e um modelo de célula NAFLD foi estabelecido. Posteriormente, as células foram tratadas com DP por 24 horas. As células foram marcadas com uma sonda fluorescente DCFH-DA, e a produção de ROS foi observada em microscópio de fluorescência. Os resultados da coloração DCFH-DA das ERO intracelulares nas células são mostrados na Figura 1. Os resultados mostraram que a DP pode re...

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Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Este protocolo investiga os efeitos protetores da platicodina-D na doença hepática gordurosa não alcoólica em modelo in vitro induzido por ácido palmítico.

Investigando os Efeitos Protetores da Platicodina D na Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Modelo In Vitro Induzido por Ácido Palmítico

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Este método demonstra o uso de células AML-12 que permitirão a construção de modelos e a investigação dos efeitos protetores da platicodina D sobre a DHGNA. A dependência excessiva do uso de modelos animais aumenta a carga do desenvolvimento de medicamentos terapêuticos. O uso de modelos celulares no estágio inicial do desenvolvimento de fármacos para DHGNA é mais prático e custo-efetivo.Este modelo de MTC pode ajudar a melhorar a compreensão da função biológica da platicodina D e ajudar a estudar o uso de outros MTC para o tratamento da DHGNA. Comece semeando um mililitro de células AML-12 por poço em placas de 12 poços. Em seguida, divida a placa de 12 poços em quatro grupos de tratamento diferentes e rotule-os como grupo controle, tratado com DP, tratado com PA e tratado com PA mais DP.Adicionar um mililitro do meio de cultura celular normal por poço ao grupo controle e ao grupo tratado com DP. Adicionar um mililitro do meio de cultura celular normal suplementado com ácido palmítico 300 micromolares ao grupo tratado com PA e PA mais DP. Após 24 horas de incubação, retirar o meio de cultura das células e, em seguida, lavar as células com um mililitro de meio livre de soro duas vezes.Em seguida, adicionar um mililitro de meio de cultura celular normal suplementado com um veículo para o grupo controle e um mililitro de meio de cultura celular normal suplementado com um micromolar platicodina D para o grupo tratado com DP. Adicionar um mililitro de meio de cultura celular normal suplementado com 300 micromolares de ácido palmítico ao grupo tratado com PA e um mililitro de meio de cultura celular normal suplementado com 300 micromolares de ácido palmítico e um micromolar platicodina D ao grupo tratado com PA mais DP. Depois de tratar as células por 24 horas, lave as células com um mililitro de 1X PBS por poço três vezes.Em seguida, corar as células com 100 microlitros de 10 micromolares DCFH-DA por poço. Incubar as células no escuro por 30 minutos. Após a incubação, lave as células com 1X PBS três vezes e adicione um mililitro de 1X PBS a cada poço.Coloque a placa de 12 poços no palco do microscópio e use uma objetiva de 20X para observar a morfologia das células em aumento de 200X. Para medir o potencial de membrana mitocondrial, lave as células tratadas preparadas anteriormente com um mililitro de 1X PBS por poço três vezes. Em seguida, core as células com 100 microlitros de cinco microgramas por mililitro de solução de trabalho JC-1 e incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro.Em seguida, lave as células com 1X PBS três vezes e adicione um mililitro de 1X PBS a cada poço. Coloque a placa de 12 poços no palco do microscópio e use uma objetiva de 20X para observar a morfologia das células em aumento de 200X. Lise as células tratadas e colete o lisado celular em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar os tubos a 12.000 G durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 5X SDS-PAGE buffer de carregamento de amostra ao sobrenadante de lisado celular em uma proporção de volume de um para quatro. Em seguida, coloque o gel preparado a 12% SDS-PAGE com 12 poços no tanque de eletroforese e adicione 1X SDS até o tampão de amostra diluído com água ultrapura até o limite de altura recomendado.Após eletroforese em SDS-PAGE, realizar a eletrotransferência das proteínas para uma membrana de PVDF de 0,45 mícron. Incubar a membrana em cinco mililitros dos anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio. Use anticorpos específicos para LC-III, p62 e beta-actina.Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, incubar a membrana de PVDF com o anticorpo secundário LGG HRP de coelho anti-camundongo diluído de um a 10.000 em tampão de bloqueio. Incubar a membrana à temperatura ambiente protegida da luz durante duas horas.Após a incubação, coloque a membrana de PVDF sobre um filme plástico. Adicione uma quantidade adequada de solução de trabalho ECL e incube por dois minutos. Em seguida, remova a solução de trabalho ECL e exponha a membrana PVDF no sistema de imagem para o desenvolvimento da imagem.A coloração DCFH-DA mostrou que a platicodina D pode reduzir significativamente o nível de ROS intracelular nas células ALM-12, indicando que este tratamento pode reduzir o estresse oxidativo celular. Além disso, a fluorescência verde representando monômeros JC-1 ou mitocôndrias despolarizadas foi maior nas células tratadas com ácido palmítico do que nas células não tratadas, enquanto a fluorescência vermelha representando os dímeros JC-1 ou mitocôndrias polarizadas foi menor nas células tratadas com ácido palmítico do que nas células não tratadas, indicando despolarização de MMP induzida pelo ácido palmítico. Além disso, em comparação com o grupo modelo, a proporção de monômeros JC-1 para dímeros diminuiu no grupo de tratamento platicodina D, indicando que poderia melhorar a MMP induzida pelo ácido palmítico.Os níveis de expressão proteica das proteínas LC-III e p62 relacionadas à autofagia foram investigados por western blotting. A relação de CL-32 para LC-31 diminuiu significativamente e o nível de expressão proteica de p62 aumentou após o tratamento com ácido palmítico. Por outro lado, a platicodina D reduziu significativamente o nível de expressão proteica de p62 e aumentou a relação LC-32 para LC-31, indicando restauração do fluxo autofágico induzido pelo ácido palmítico.Se o valor de fluorescência das células do grupo controle negativo for relativamente alto, as concentrações de trabalho das sondas fluorescentes podem ser ajustadas conforme necessário.

Research

JoVE Journal

Medicine

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