Name: investigating the protective effects of platycodin d on non-alcoholic fatty liver disease in a palmitic acid-induced in vitro model
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00
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Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 y jbky20210029) y la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (No. 2021MD703919).

Las células AML-12 (una línea celular normal de hepatocitos de ratón) se utilizan para los estudios basados en células. Las células se obtienen de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).
1. Pretratamiento de las células AML-12 para modelar NAFLD in vitro
<ol><li>Mantener las células en medios de cultivo celular normales (DMEM más F12 [1:1] de Ham que contiene 0,005 mg/ml de insulina, 5 ng/ml de selenio, 0,005 mg/ml de transferrina, ...

Estudios han destacado el hecho de que NAFLD es un síndrome clínico-patológico, que va desde el hígado graso hasta NASH, que puede progresar a cirrosis y cáncer de hígado51. Una dieta alta en grasas y un estilo de vida inactivo son factores de riesgo típicos para NAFLD. Tanto las terapias no farmacológicas como las terapias farmacológicas para el tratamiento de NAFLD se han investigado51,52,53. S...

Platycodon grandiflorus (PG), que es la raíz seca de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., se utiliza en la medicina tradicional china (MTC). Se produce principalmente en las regiones noreste, norte, este, centro y suroeste de China1. Los componentes PG incluyen saponinas triterpenoides, polisacáridos, flavonoides, polifenoles, polietilenglicoles, aceites volátiles y minerales2. PG tiene una larga historia de ser utilizado como un alimento y una medicina herbal en Asia. Tradicionalmente, esta hierba se usaba para hacer medicamentos contra las enfermedades pulmonares. La farmacología moderna también proporciona evidencia de la eficacia de PG para tratar otras enfermedades. Los estudios han demostrado que PG tiene un efecto terapéutico en una variedad de modelos de lesión hepática inducida por fármacos. La suplementación dietética de extractos de PG o platycodin puede mejorar la obesidad inducida por la dieta alta en grasas y sus enfermedades metabólicas relacionadas 3,4,5. Los polisacáridos de PG se pueden utilizar para el tratamiento de la lesión hepática aguda causada por LPS / D-GalN en ratones6. Además, las saponinas de las raíces de PG mejoran la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta alta en grasas (EHNA)7. Además, la platycodin D (PD), uno de los componentes terapéuticos más importantes de PG, puede mejorar la expresión del receptor de lipoproteínas de baja densidad y la captación de lipoproteínas de baja densidad en células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2)8. Además, la EP también puede inducir apoptosis e inhibir la adhesión, migración e invasión en las células HepG2 9,10. Por lo tanto, en este estudio, las células de ratón de hepatoma AML-12 se utilizan para la construcción de modelos in vitro y para estudiar más a fondo los efectos farmacológicos y los mecanismos subyacentes de la EP en este modelo.
El término enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) se refiere a un grupo de enfermedades hepáticas que incluye esteatosis simple, NASH, cirrosis y carcinoma hepatocelular11. Aunque la patogénesis de NAFLD no se comprende completamente, desde la teoría clásica de "dos golpes" hasta la teoría actual de "múltiples golpes", la resistencia a la insulina se considera central en la patogénesis de NAFLD12,13,14. Los estudios han demostrado que la resistencia a la insulina en los hepatocitos podría conducir a un aumento de los ácidos grasos libres, que forman triglicéridos que se depositan en el hígado y hacen que el hígado se vuelva graso15,16. La acumulación de grasa puede conducir a lipotoxicidad, disfunción mitocondrial inducida por estrés oxidativo, estrés del retículo endoplásmico y liberación de citoquinas inflamatorias, lo que resulta en la patogénesis y progresión de NAFLD17,18. Además, la autofagia también juega un papel en la patogénesis de NAFLD, ya que está involucrada en la regulación de la sensibilidad celular a la insulina, el metabolismo lipídico celular, la lesión de hepatocitos y la inmunidad innata 19,20,21.
Se han establecido una variedad de modelos animales y modelos celulares para proporcionar una base para explorar la patogénesis y los posibles objetivos terapéuticos de NAFLD22,23. Sin embargo, los modelos de un solo animal no pueden imitar completamente todos los procesos patológicos de NAFLD24. Las diferencias individuales entre los animales conducen a diferentes características patológicas. El uso de líneas celulares hepáticas o hepatocitos primarios en estudios in vitro de NAFLD garantiza la máxima consistencia en las condiciones experimentales. La desregulación del metabolismo lipídico hepático puede conducir a niveles más altos de acumulación de gotitas lipídicas de hepatocitos en NAFLD25. Los ácidos grasos libres como el ácido oleico y el aceite de palma han sido utilizados en el modelo in vitro para imitar la EHGNA causada por una dieta alta en grasas26,27. La línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se utiliza a menudo en la construcción de modelos de NAFLD in vitro, pero, como línea celular tumoral, el metabolismo de las células HepG2 es significativamente diferente del de las células hepáticas en condiciones fisiológicas normales28. Por lo tanto, el uso de hepatocitos primarios o hepatocitos primarios de ratón para construir el modelo in vitro de NAFLD para la detección de fármacos es más ventajoso que el uso de líneas celulares tumorales. Al comparar el examen sinérgico de los efectos de los fármacos y las dianas terapéuticas tanto en modelos animales como en modelos de hepatocitos in vitro, parece que el uso de hepatocitos de ratón para construir el modelo de hígado graso no alcohólico in vitro tiene un mejor potencial de aplicación.
Los ácidos grasos libres que entran en el hígado se oxidan para producir energía o se almacenan como triglicéridos. Significativamente, los ácidos grasos libres tienen cierta lipotoxicidad y pueden inducir disfunción celular y apoptosis12. El ácido palmítico (AP) es el ácido graso saturado más abundante en el plasma humano29. Cuando las células en el tejido no adiposo están expuestas a altas concentraciones de PA durante mucho tiempo, esto estimula la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y causa estrés oxidativo, acumulación de lípidos e incluso apoptosis30. Por lo tanto, muchos investigadores utilizan PA como inductor para estimular las células hepáticas para producir ROS y, así, construir el modelo de enfermedad del hígado graso in vitro y evaluar los efectos protectores de ciertas sustancias activas en las células31,32,33,34. Este estudio introduce un protocolo para investigar los efectos protectores de la EP en un modelo celular de NAFLD inducida por PA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% BSA Blocking Buffer</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AML12 (alpha mouse liver 12) cell line</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>AML12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beyo ECL&#160;Plus</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0018S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-safety cabinet</td>
			<td>Esco Micro Pte Ltd, Singapore</td>
			<td>AC2-5S1 A2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture CO2 Incubator</td>
			<td>Esco Micro Pte Ltd, Singapore</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>ST125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone, Tauranga, New Zealand</td>
			<td>SH30406.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>8.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ABclonal, Wuhan, China</td>
			<td>AS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100&#215;</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>C0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP LC3&#946; Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>SC-376404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>M8650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted Microscope IX53</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>IX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic Acid</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl&#160;fluoride</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>ST506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution</td>
			<td>Hyclone,&#160;Logan,&#160;UT,&#160;USA</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platycodin D</td>
			<td>Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>CSA: 58479-68-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail for general use, 100x</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Marker</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>PR1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Oxygen Species Assay Kit</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>CA1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA&#160;Lysis&#160;Buffer</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0013E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0012AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime, Shanghai, China</td>
			<td>P0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Centrifuge</td>
			<td>Sigma, Germany</td>
			<td>3K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQSTM1/p62 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>SC-28359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 PRO&#160;&#160;</td>
			<td>Tecan Austria GmbH, Austria</td>
			<td>1510002987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WB Transfer Buffer,10x</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>D1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin Mouse mAb</td>
			<td>ABclonal, Wuhan, China</td>
			<td>AC004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the protective effects of platycodin d on non-alcoholic fatty liver disease in a palmitic acid-induced in vitro model

La incidencia de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) ha aumentado a un ritmo alarmante en todo el mundo. Platycodon grandiflorum es ampliamente utilizado como etnomedicina tradicional para el tratamiento de diversas enfermedades y es un alimento funcional típico que se puede incorporar a la dieta diaria. Los estudios han sugerido que la platycodin D (PD), uno de los principales ingredientes activos de Platycodon grandiflorum, tiene una alta biodisponibilidad y mitiga significativamente el progreso de NAFLD, pero el mecanismo subyacente de esto aún no está claro. Este estudio tiene como objetivo investigar el efecto terapéutico de la EP contra la EHGNA in vitro. Las células de AML-12 se trataron previamente con ácido palmítico (PA) de 300 μM durante 24 h para modelar NAFLD in vitro. Luego, las células fueron tratadas con EP o no recibieron tratamiento con EP durante 24 h. Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) se analizaron mediante tinción de diacetato de 2′,7′-dicloro-dihidrofluoresceína (DCFH-DA), y el potencial de membrana mitocondrial se determinó mediante el método de tinción JC-1. Además, los niveles de expresión proteica de LC3-II/LC3-I y p62/SQSTM1 en los lisados celulares se analizaron mediante western blotting. Se encontró que la EP disminuye significativamente los niveles de ROS y potencial de membrana mitocondrial en el grupo tratado con PA en comparación con el grupo control. Mientras tanto, la DP aumentó los niveles de LC3-II/LC3-I y disminuyó los niveles de p62/SQSTM1 en el grupo tratado con PA en comparación con el grupo control. Los resultados indicaron que la EP mejoró la NAFLD in vitro al reducir el estrés oxidativo y estimular la autofagia. Este modelo in vitro es una herramienta útil para estudiar el papel de la EP en la EHGNA.

ROS intracelular en las células Se indujeron células AML-12 con 300 μM PA durante 24 h, y se estableció un modelo de células NAFLD. Posteriormente, las células fueron tratadas con DP durante 24 h. Las células se marcaron con una sonda fluorescente DCFH-DA, y la producción de ROS se observó bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados de la tinción DCFH-DA de ROS intracelulares en las células se muestran en la Figura 1. Los resultados mostraron que la EP...

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Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Este protocolo investiga los efectos protectores de la platycodin D sobre la enfermedad del hígado graso no alcohólico en un modelo in vitro inducido por ácido palmítico.

Investigación de los efectos protectores de la platycodin D en la enfermedad del hígado graso no alcohólico en un modelo in vitro inducido por ácido palmítico

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Este método demuestra el uso de células AML-12 que permitirán la construcción de modelos e investigar los efectos protectores de la platycodin D en NAFLD. La dependencia excesiva del uso de modelos animales aumenta la carga del desarrollo de fármacos terapéuticos. El uso de modelos celulares en la etapa temprana del desarrollo de fármacos NAFLD es más práctico y rentable.Este modelo de MTC puede ayudar a mejorar la comprensión de la función biológica de la platycodin D y ayudar a estudiar el uso de otra MTC para el tratamiento de NAFLD. Comience sembrando un mililitro de células AML-12 por pocillo en placas de 12 pocillos. Luego divida la placa de 12 pocillos en cuatro grupos de tratamiento diferentes y etiquételos como control, tratado con EP, PA tratado y PA más grupo tratado con EP.Agregue un mililitro del medio de cultivo celular normal por pocillo al grupo de control y al grupo tratado con EP. Agregue un mililitro del medio de cultivo celular normal suplementado con 300 micromolares de ácido palmítico al grupo tratado con PA y PA más PD tratado. Después de 24 horas de incubación, retire el medio de cultivo de las células y luego lave las células con un mililitro de medios sin suero dos veces.A continuación, agregue un mililitro de medios de cultivo celular normales suplementados con un vehículo al grupo de control y un mililitro de medios de cultivo celular normales suplementados con un platycodin D micromolar al grupo tratado con EP. Agregue un mililitro de medios de cultivo celular normales suplementados con 300 micromolares de ácido palmítico al grupo tratado con PA y un mililitro de medios de cultivo celular normales suplementados con 300 micromolares de ácido palmítico y un micromolar platycodin D al grupo tratado con PA más DP. Después de tratar las células durante 24 horas, lave las células con un mililitro de 1X PBS por pocillo tres veces.Luego tiñe las células con 100 microlitros de 10 micromolares DCFH-DA por pocillo. Incubar las células en la oscuridad durante 30 minutos. Después de la incubación, lave las células con 1X PBS tres veces y agregue un mililitro de 1X PBS a cada pocillo.Coloque la placa de 12 pocillos en la etapa del microscopio y use un objetivo 20X para observar la morfología de las células con un aumento de 200X. Para medir el potencial de la membrana mitocondrial, lave las células tratadas preparadas anteriormente con un mililitro de 1X PBS por pocillo tres veces. Luego tiñe las células con 100 microlitros de cinco microgramos por mililitro de solución de trabajo JC-1 e incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad.Luego lave las celdas con 1X PBS tres veces y agregue un mililitro de 1X PBS a cada pozo. Coloque la placa de 12 pocillos en la etapa del microscopio y use un objetivo 20X para observar la morfología de las células con un aumento de 200X. Lise las células tratadas y recoja el lisado celular en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Centrifugar los tubos a 12, 000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Luego agregue un tampón de carga de muestra 5X SDS-PAGE al sobrenadante de lisado celular a una relación de volumen de uno a cuatro. A continuación, coloque el gel SDS-PAGE preparado al 12% con 12 pocillos en el tanque de electroforesis y agregue 1X SDS hasta el tampón de muestra diluido con agua ultrapura al límite de altura recomendado.Después de la electroforesis SDS-PAGE, llevar a cabo la electrotransferencia de las proteínas a una membrana de PVDF de 0,45 micras. Incubar la membrana en cinco mililitros de los anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo. Use anticuerpos específicos para LC-III, p62 y beta-actina.Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego incubar la membrana de PVDF con anticuerpo secundario LGG HRP anti-ratón de conejo diluido de uno a 10, 000 en tampón de bloqueo. Incubar la membrana a temperatura ambiente protegida de la luz durante dos horas.Después de la incubación, coloque la membrana de PVDF en una envoltura de plástico. Agregue una cantidad adecuada de solución de trabajo ECL e incube durante dos minutos. A continuación, retire la solución de trabajo ECL y exponga la membrana de PVDF en el sistema de imágenes para el desarrollo de imágenes.La tinción DCFH-DA mostró que la platycodin D podría reducir significativamente el nivel de ROS intracelular en las células ALM-12, lo que indica que este tratamiento puede reducir el estrés oxidativo celular. Además, la fluorescencia verde que representa los monómeros JC-1 o las mitocondrias despolarizadas fue mayor en las células tratadas con ácido palmítico que en las células no tratadas, mientras que la fluorescencia roja que representa los dímeros JC-1 o las mitocondrias polarizadas fue menor en las células tratadas con ácido palmítico que en las células no tratadas, lo que indica la despolarización MMP inducida por ácido palmítico. Además, en comparación con el grupo modelo, la proporción de monómeros JC-1 a dímeros disminuyó en el grupo de tratamiento con platycodin D, lo que indica que podría mejorar la MMP inducida por ácido palmítico.Los niveles de expresión proteica de las proteínas LC-III y p62 relacionadas con la autofagia se investigaron mediante western blotting. La proporción de LC-32 a LC-31 disminuyó significativamente y el nivel de expresión de proteínas de p62 aumentó después de ser tratado con ácido palmítico. Por otro lado, la platycodin D redujo significativamente el nivel de expresión de proteínas de p62 y aumentó la proporción de LC-32 a LC-31, lo que indica la restauración del flujo autofágico inducido por el ácido palmítico.Si el valor de fluorescencia de las células en el grupo de control negativo es relativamente alto, las concentraciones de trabajo de las sondas fluorescentes se pueden ajustar según sea necesario.

Research

JoVE Journal

Medicine

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

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Investigación

Medicina

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