Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح R01DE026677 و R01DE031477 (إلى Y.S.K.) ، وصندوق بدء التشغيل UTHSCSA (Y.S.K.) ، وجائزة Rising STAR من نظام جامعة تكساس (Y.S.K.).

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة هنا وفقا لبروتوكول معتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو.
ملاحظة: بمجرد البدء ، يجب إكمال جراحة الحيوانات (الخطوة 1) والتصوير (الخطوة 2) بطريقة مستمرة. قد يتم إجراء تحليل ا?...

<ol>
	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

الألم المستمر موجود في مجموعة واسعة من الاضطرابات ، مما يضعف و / أو يقلل من نوعية الحياة لحوالي 8٪ من الناس29. تكتشف الخلايا العصبية الحسية الأولية المنبهات الضارة على الجلد ، وتساهم اللدونة في الألم المستمر8. في حين يمكن دراسة الخلايا العصبية في زراعة الخلايا والن?...

الخلايا العصبية الحسية الأولية تعصب الجلد مباشرة وتحمل المعلومات الحسية الجسدية مرة أخرى إلى الجهاز العصبي المركزي 1,2. العقد الجذرية الظهرية (DRGs) هي مجموعات جسم الخلية من 10000-15000 خلية عصبية حسية أولية 3,4. تقدم الخلايا العصبية DRG أحجاما متنوعة ومستويات الميالين وأنماط التعبير الجيني والمستقبلات. تشمل الخلايا العصبية ذات القطر الأصغر الخلايا العصبية المستشعرة للألم وتستجيب الخلايا العصبية ذات القطر الأكبر عادة للمنبهات الميكانيكية غير المؤلمة 5,6. يمكن للاضطرابات في الخلايا العصبية الحسية الأولية مثل الإصابة والالتهابات المزمنة واعتلالات الأعصاب الطرفية توعية هذه الخلايا العصبية بمحفزات مختلفة والمساهمة في الألم المزمن والألم الخيفي وفرط الحساسيةللألم 7,8. لذلك ، فإن دراسة الخلايا العصبية DRG مهمة في فهم كل من الإحساس الجسدي بشكل عام والعديد من اضطرابات الألم والحكة.
تعد الخلايا العصبية التي تطلق في الجسم الحي ضرورية للإحساس الجسدي ، ولكن حتى وقت قريب ، كانت أدوات دراسة العقد السليمة في الجسم الحي تقتصر على أعداد صغيرة نسبيا من الخلايا9. نصف هنا طريقة قوية لدراسة جهود الفعالية أو أنشطة الخلايا العصبية على مستوى السكان في الجسم الحي كمجموعة. تستخدم الطريقة التصوير على أساس ديناميكيات السيتوبلازمCa 2+. تعد مؤشرات الفلورسنت الحساسة Ca 2+ وكلاء جيدين لقياس النشاط الخلوي بسبب التركيز المنخفض عادة للسيتوبلازم Ca2+. سمحت هذه المؤشرات بالمراقبة المتزامنة لمئات إلى عدة آلاف من الخلايا العصبية الحسية الأولية في الفئران9،10،11،12،13،14،15،16 والجرذان 17. يمكن استخدام طريقة التصوير في الجسم الحي Ca2+ الموصوفة في هذه الدراسة لمراقبة استجابات مستوى السكان مباشرة للمحفزات الميكانيكية والباردة والحرارية والكيميائية.
يتم التعبير عن بروتين الغشاء المرتبط بالفوسفوينوسيتيد ، Pirt بمستويات عالية في جميع الخلايا العصبية الحسية الأولية تقريبا (>95٪)18,19 ويمكن استخدامه لدفع التعبير عن مستشعر Ca 2+ ، GCaMP3 ، لمراقبة نشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي20. في هذا البروتوكول ، يتم وصف التقنيات لإجراء جراحة DRG في الجسم الحي ، وتصوير Ca2+ ، والتحليل في الجانب الأيمن من أسفل الظهر 5 (L5) DRG للفئران Pirt-GCaMP314 باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (LSM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

يمكن استخدام تصوير Ca 2+ كوكيل للنشاط الخلوي ، بما في ذلك إمكانات الفعل وآليات الإشارات المختلفة التي تتضمن دخول Ca 2+ إلى السيتوبلازم أو إطلاق مخازن Ca2+ داخل الخلايا. يوفر تصوير Ca2+ القائم على Pirt-GCaMP3 للخلايا العصبية الحسية الأولية لعقدة الجذر الظهرية (DRG) في الفئران ميزة القياس المتزامن لعدد كبير من الخلايا. يمكن مراقبة ما يصل إلى 1800 خلية عصبية ، مما يسمح بدراسة الشبكات العصبية والعمليات الحسية الجسدية كمجموعة في سياقها الفسيولوجي الطبيعي على مستوى السكان في الجسم الحي. يسمح العدد الكبير من الخلايا العصبية التي تتم مراقبتها باكتشاف أنماط النشاط التي يصعب اكتشافها باستخدام طرق أخرى. يمكن تطبيق المحفزات على مؤخرة الفأر ، مما يسمح بدراسة التأثيرات المباشرة للمنبهات على مجموعة الخلايا العصبية DRG. يشير عدد الخلايا العصبية التي تنتج عابرات Ca 2+ بالإضافة إلى سعة العابرين Ca2+ إلى الحساسية لطرائق حسية محددة. يوفر قطر الخلايا العصبية دليلا على أنواع الألياف المنشطة (الميكانيكي غير الضار مقابل ألياف الألم الضارة ، ألياف Aβ و Aδ و C). يمكن تسمية الخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات محددة وراثيا باستخدام td-Tomato و Cre recombinases المحددة مع Pirt-GCaMP. لذلك ، يوفر تصوير Pirt-GCaMP3 Ca2+ ل DRG أداة ونموذجا قويا لتحليل طرائق حسية محددة وأنواع فرعية من الخلايا العصبية تعمل كمجموعة على المستوى السكاني لدراسة الألم والحكة واللمس والإشارات الحسية الجسدية الأخرى.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> الشكل 4: صور تمثيلية للعقد الجذرية الظهرية L5 لفئران Pirt-GCaMP3. (أ ، د) يتم عرض عمليات مسح عالية الدقة أحادية الإطار لعقد الجذر الظهرية L5 لفئران Pirt-GCaMP3. (ب، ه) . متوسط إسقاطات...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

يصف هذا البروتوكول التعرض الجراحي لعقدة الجذر الظهري (DRG) متبوعا ب GCaMP3 (مؤشر Ca2+ المشفر وراثيا; بروتين الفلورسنت الأخضر - كالمودولين - M13 بروتين 3) تصوير Ca2+ للمجموعات العصبية باستخدام الفئران Pirt-GCaMP3 أثناء تطبيق مجموعة متنوعة من المحفزات على المخلب الخلفي المماثل.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للمجموعات العصبية في شبكات الخلايا العصبية الحسية الأولية في العقد الجذرية الظهرية السليمة

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

يسمح عدد الخلايا العصبية التي تتم مراقبتها باستخدام هذه الطريقة بجمع بيانات شبكة الخلايا العصبية التي سيكون من المستحيل استخدامها باستخدام طرق قديمة أو غيرها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على مراقبة ما يقرب من 2،000 خلية عصبية حسية أولية في وقت واحد ، والاستجابة مباشرة للمنبهات المطبقة على المخلب الخلفي. هذا الإجراء مناسب بشكل خاص لدراسة التدخلات العلاجية للألم المحيطي وفرط الحساسية للألم.يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة العقد مثلثة التوائم أو الجنينية أو استخدامها مع أجهزة استشعار مشفرة وراثيا لجزيئات إشارات الجهد أو الخلية ، مثل AMP الدوري. يتطلب إجراء هذه الجراحة ممارسة. يمكنك التدرب على ما يصل إلى ستة عقد جذر ظهرية على واحد.سيكون عرض الإجراء ، بمساعدة جون شانونهاوس والسيد روبن جوميز. للبدء ، ضع الماوس على وسادة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. حدد موقع تضخم أسفل الظهر عن طريق الشعور بعظم الحوض للفأر.ثم احلق الجزء الخلفي من الماوس فوق منطقة تكبير أسفل الظهر. باستخدام المقص ، قم بعمل شق مستطيل من ثلاثة جوانب فوق تضخم أسفل الظهر ، وقم بطي الجلد بعيدا بالملقط. استخدم مقص تشريح الزنبرك 13 ملم لعمل شقوق من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات على الجانب الأيمن من العمود الفقري.استخدم المقص لقطع الجلد والعضلات إلى الجانبين لكشف العمود الفقري. ثم ، باستخدام مقص ثمانية ملليمترات ، قم بقطع العضلات والأنسجة الضامة لتنظيف العملية المستعرضة للجانب الأيمن L5 DRG. حاول تقليل النزيف باستخدام القطن أو الجلفوم لامتصاص الدم.قم بقص العملية المستعرضة L5 على الجانب الأيمن باستخدام rongeurs Friedman-Pearson أو ملقط ناعم قوي ، مع الحرص على عدم لمس DRG. بعد ذلك ، حرك الماوس ولوحة التدفئة إلى المسرح المخصص. استخدم شريط المسرح لتثبيت الحيوان ووسادة التدفئة في مكانها.ضع أنف الحيوان في مخروط الأنف لتخدير الأيزوفلوران المستمر. قم بتأمين المخلب الخلفي الأيمن الذي يبرز إلى موضع خارج المسرح لسهولة تطبيق المحفزات. قم بتثبيت العمود الفقري في مكانه باستخدام مشابك المرحلة على الجلد على الفقرات أو عظم الحوض فقط منقاري وذيلي إلى L5 DRG.اضبط المشابك والمرحلة لجعل سطح DRG مستويا قدر الإمكان. ثم ضع المرحلة أسفل المجهر بحيث يكون الهدف مباشرة ثمانية ملليمترات فوق DRG عند خفضه. أدخل مقياس حرارة المستقيم.قم بتوصيل خطوط الكهرباء بوسادة التدفئة ومقياس حرارة المستقيم. قم بتوصيل مخروط الأنف بخطوط غاز الأيزوفلوران. استخدم مجهرا متحد البؤر مستقيما مع هدف 10x 0.4 DIC والبرامج المرتبطة به للتصوير.استخدم إعدادات مرشح FITC الخضراء للإثارة عند 495 نانومتر ، والانبعاثات عند 519 نانومتر ، والطول الموجي للكشف بين 500 إلى 580 نانومتر. تحت المجهر ، ابحث عن سطح DRG. اضبط المشابك على المسرح بحيث يكون سطح DRG مستويا قدر الإمكان ويتم تصور أقصى مساحة للسطح في المستوى البؤري.مراقبة الحيوان طوال العملية للحفاظ على التخدير isoflurane دون جرعة زائدة. لتحميل بروتوكول المسح السريع للمجهر ، استخدم الإعدادات النموذجية لحجم voxel 2.496 × 2.496 × 16 ميكرون ، 512 × 512 بكسل ، 10 شريحة بصرية Z-stack ، وحدة Airy واحدة ل 32 ميكرومتر ، 1٪ طاقة ليزر 488 نانومتر وخمسة ملي وات ، وقت البكسل 1.52 ميكروثانية ، وقت الخط 0.91 مللي ثانية ، وقت الإطار 465 مللي ثانية ، سرعة مسح LSM ثمانية ، المسح ثنائي الاتجاه ، كاشف PMT يكسب 650 فولت ، والكسب الرقمي واحد. قم بإجراء مسح قصير من ثماني دورات ل DRG بالنقر فوق بدء التجربة ضمن علامة التبويب الاستحواذ.قم بإنشاء فيلم عن طريق إجراء عرض متعامد لعمليات المسح الضوئي بمعدل مسح ضوئي واحد لكل إطار بمرور الوقت. تحقق يدويا من وضوح الصورة وعناصر التصوير ، مثل موجات السطوع التي تعبر DRG. اضبط موضع المشبك وسمك المقطع البصري ، وكرر هذه الخطوة حتى يتم تحقيق فيلم واضح وعالي الجودة.بعد ذلك ، قم بتحميل بروتوكول المسح الضوئي عالي الدقة للمجهر باستخدام الإعدادات النموذجية لحجم voxel 1.248 × 1.248 × 14 ميكرون ، 1024 × 1024 بكسل ، ست شرائح بصرية Z-stack ، وحدة تهوية 1.2 أو 39 ميكرومتر ، 5٪ طاقة ليزر 488 نانومتر و 25 ملي واط ، وقت البكسل 2.06 ميكروثانية ، وقت الخط 4.95 مللي ثانية ، وقت الإطار 5.06 ثانية ، سرعة مسح LSM ستة ، المسح ثنائي الاتجاه ، كسب كاشف PMT عند 650 فولت ، والكسب الرقمي واحد. انقر فوق الزر "بدء التجربة" ضمن علامة التبويب "الاستحواذ" لعمل صورة عالية الدقة ل DRG. قم بتحميل بروتوكول المسح السريع للمجهر ، وسجل النشاط التلقائي في DRG لمدة 80 دورة.قم بإنشاء فيلم إسقاط متعامد ، وتحقق من أن الصورة ذات جودة كافية للتحليل. لتطبيق المحفزات ، اضبط المجهر لإجراء 15 إلى 20 عملية مسح. انتظر حتى تكتمل عمليات الفحص من واحد إلى خمسة لإنتاج خط الأساس.ضع التحفيز أثناء عمليات المسح من ستة إلى 10. انتظر خمس دقائق على الأقل بعد كل مثير قبل تطبيق التحفيز التالي لمنع إزالة الحساسية. للضغط الميكانيكي ، أمسك قرصة algometer بمخلب بين المجاذيف دون لمس المخلب.اضغط على المخلب بدءا من نهاية الفحص الخامس مباشرة وتوقف فورا بعد الفحص 10. راقب قوة الضغط باستخدام مقياس algmeter ، وتأكد من أنها لا تتجاوز 10 جم فوق القوة المطلوبة. بالنسبة للمحفزات الحرارية ، سخني كوبا من الماء إلى أعلى بقليل من درجة الحرارة المطلوبة.عندما يكون الماء في درجة الحرارة الصحيحة ، قم بتطبيق التحفيز مباشرة بعد المسح الخامس عن طريق غمر المخلب في الماء. اسحب الدورق بعيدا فورا بعد الفحص 10. سمح التعرض الجراحي ل L5 DRG متبوعا بالفحص المجهري متحد البؤر بتصوير ما يصل إلى 1،800 خلية عصبية في وقت واحد باستخدام الفئران Pirt-GCaMP3.لوحظت الخلايا العصبية الحسية الأولية في مجموعة على مستوى السكان لعابرات الكالسيوم العفوية في غياب المنبهات واستجابة للمنبهات في سياقها الفسيولوجي الطبيعي. زادت المحفزات القوية أو الحرارة الضارة من استجابات الكالسيوم. مقارنة بالضغط ب 100 جم ، أدى الضغط ب 300 جم إلى زيادة عدد الخلايا العصبية التي تنتج عابرات الكالسيوم ومنطقة دلتا F بواسطة F0 تحت المنحنى.زادت الحرارة الدافئة في نطاق درجة حرارة غير ضارة من 21 و 45 درجة مئوية من عدد الخلايا العصبية التي تنتج عابرات الكالسيوم ومنطقة دلتا F بواسطة F0 تحت المنحنى. أدت درجات الحرارة غير الضارة إلى تنشيط عدد أقل من الخلايا العصبية التي تنتج عابرات مقارنة بمحفز حراري ضار عند 57 درجة مئوية. علاوة على ذلك ، أنتجت الخلايا العصبية ذات القطر الأصغر والمتوسط الكالسيوم العابر تلقائيا وتحت جميع المحفزات ، لكن الخلايا العصبية ذات القطر الأكبر أنتجت فقط عابرات الكالسيوم استجابة لمحفز الضغط 300 جم.يجب أن يكون DRG مستويا وسمك شريحة بصرية مثالي. يجب أن يكون بحيث يمكنك اكتشاف الحد الأقصى لعدد الخلايا وليس هناك تموج في الفيلم. تم استخدام هذه التقنية لتحليل الطرائق الحسية على المستوى السكاني للإحساس الجسدي والذوق ولدراسة الخلايا العصبية المجاورة التي تنشط في أزواج أو في مجموعات متزامنة تساهم في الألم المزمن والاعتلال العصبي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks (Video) | JoVE 

أسلوب التصوير الكالسيوم في تطوير شبكات القشرية

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans Video (Video) | JoVE

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration Video (Video) | JoVE

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals Video (Video) | JoVE

إجراء لغرس صالحة المنظمة من Microwires للتسجيلات واحدة وحدة في استيقظ، تتصرف الحيوانات

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb Video (Video) | JoVE

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents Video (Video) | JoVE

البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

الظهرية جذر حقن العقدة وظهري الجذر سحق إصابة نموذجا لالحسية أكسون التجديد

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons Video (Video) | JoVE

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release Video (Video) | JoVE

عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة الإفراج عن ناقل عصبي

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

في تصوير الكالسيوم فيفو خلايا الشعر الخط الجانبي في الزرد اليرقات

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...