Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01DE026677 en R01DE031477 (aan Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.), en een Rising STAR Award van het University of Texas system (Y.S.K.).

Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Texas Health Science Center in San Antonio.
OPMERKING: Eenmaal gestart, moeten dierchirurgie (stap 1) en beeldvorming (stap 2) op een continue manier worden voltooid. Data-analyse (stap 3) kan later worden uitgevoerd.
1. Chirurgie en het beveiligen van het dier voor de rechterkant L5...

<ol>
	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

Aanhoudende pijn is aanwezig in een breed scala van aandoeningen, slopende en / of het verminderen van de kwaliteit van leven voor ongeveer 8% van de mensen29. Primaire sensorische neuronen detecteren schadelijke stimuli op de huid en hun plasticiteit draagt bij aan aanhoudende pijn8. Hoewel neuronen kunnen worden bestudeerd in celkweek en explantaten, verwijdert dit ze uit hun normale fysiologische context. Chirurgische blootstelling van de DRG, gevolgd door Pirt-GCaMP3 Ca...

Primaire sensorische neuronen innerveren direct de huid en dragen somatosensorische informatie terug naar het centrale zenuwstelsel 1,2. Dorsale wortelganglia (DRG's) zijn cellichaamclusters van 10.000-15.000 primaire sensorische neuronen 3,4. DRG-neuronen vertonen verschillende grootte, myelinisatieniveaus en gen- en receptorexpressiepatronen. Neuronen met een kleinere diameter omvatten pijngevoelige neuronen en neuronen met een grotere diameter reageren meestal op niet-pijnlijke mechanische stimuli 5,6. Stoornissen in de primaire sensorische neuronen zoals letsel, chronische ontsteking en perifere neuropathieën kunnen deze neuronen gevoelig maken voor verschillende stimuli en bijdragen aan chronische pijn, allodynie en pijnovergevoeligheid 7,8. Daarom is de studie van DRG-neuronen belangrijk bij het begrijpen van zowel somatosensatie in het algemeen als veel pijn- en jeukaandoeningen.
Neuronen die in vivo vuren zijn essentieel voor somatosensatie, maar tot voor kort waren hulpmiddelen om intacte ganglia in vivo te bestuderen beperkt tot relatief kleine aantallen cellen 9. Hier beschrijven we een krachtige methode voor het bestuderen van de actiepotentialen of activiteiten van neuronen op populatieniveau in vivo als een ensemble. De methode maakt gebruik van beeldvorming op basis van cytoplasmatische Ca2+ dynamica. De Ca 2+ gevoelige fluorescerende indicatoren zijn goede proxy's voor het meten van cellulaire activiteit vanwege de normaal lage concentratie cytoplasmatisch Ca2+. Deze indicatoren hebben gelijktijdige monitoring van honderden tot enkele duizenden primaire sensorische neuronen mogelijk gemaakt bij muizen 9,10,11,12,13,14,15,16 en ratten 17. De methode van in vivo Ca2+ beeldvorming die in deze studie wordt beschreven, kan worden gebruikt om reacties op populatieniveau op mechanische, koude, thermische en chemische stimuli direct te observeren.
Het fosfoinositide-bindende membraaneiwit Pirt komt op hoge niveaus tot expressie in bijna alle (>95%) primaire sensorische neuronen18,19 en kan worden gebruikt om de expressie van de Ca 2+ sensor, GCaMP3, aan te sturen om neuronactiviteit in vivo20 te monitoren. In dit protocol worden technieken beschreven voor het uitvoeren van in vivo DRG-chirurgie, Ca2+ beeldvorming en analyse in de rechter lumbale 5 (L5) DRG van Pirt-GCaMP3-muizen14 met behulp van confocale laserscanmicroscopie (LSM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

Ca2+ beeldvorming kan worden gebruikt als een proxy voor cellulaire activiteit, inclusief actiepotentialen en verschillende signaleringsmechanismen waarbij Ca 2+ het cytoplasma binnendringt of intracellulaire Ca2+ winkels vrijkomt. Pirt-GCaMP3-gebaseerde Ca2+ beeldvorming van primaire sensorische neuronen van het dorsale wortelganglion (DRG) bij muizen biedt het voordeel van gelijktijdige meting van een groot aantal cellen. Tot 1.800 neuronen kunnen worden gemonitord, waardoor neuronale netwerken en somatosensorische processen als een ensemble in hun normale fysiologische context op populatieniveau in vivo kunnen worden bestudeerd. Het grote aantal bewaakte neuronen maakt de detectie mogelijk van activiteitspatronen die moeilijk te detecteren zouden zijn met behulp van andere methoden. Stimuli kunnen worden toegepast op de achterpoot van de muis, waardoor de directe effecten van stimuli op het DRG-neuronensemble kunnen worden bestudeerd. Het aantal neuronen dat Ca 2+ transiënten produceert en de amplitude van Ca2+ transiënten duidt op gevoeligheid voor specifieke sensorische modaliteiten. De diameter van neuronen levert bewijs van geactiveerde vezeltypen (niet-schadelijke mechano versus schadelijke pijnvezels, Aβ-, Aδ- en C-vezels). Neuronen die specifieke receptoren tot expressie brengen, kunnen genetisch worden gelabeld met td-Tomaat en specifieke Cre-recombinasen samen met Pirt-GCaMP. Daarom biedt Pirt-GCaMP3 Ca2+ beeldvorming van DRG een krachtig hulpmiddel en model voor de analyse van specifieke sensorische modaliteiten en neuronsubtypen die fungeren als een ensemble op populatieniveau om pijn, jeuk, aanraking en andere somatosensorische signalen te bestuderen.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve beelden van L5 dorsale wortelganglia van Pirt-GCaMP3 muizen. (A,D) Single frame hoge resolutie scans van L5 dorsale wortelganglia van Pirt-GCaMP3 muizen worden getoond. (B,E) . Gemiddelde intensiteitsprojecties van 15 frames Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglia van respectievelijk pa...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Het aantal neuronen dat met deze methode wordt bewaakt, maakt het mogelijk om neuronnetwerkgegevens te verzamelen die onmogelijk zouden zijn met oudere of andere methoden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om bijna 2.000 primaire sensorische neuronen tegelijk te volgen, die direct reageren op stimuli die op de achterpoot worden aangebracht. Deze procedure is vooral geschikt voor het bestuderen van therapeutische interventies voor perifere allodynie en pijnovergevoeligheid.Deze methode kan worden aangepast aan het bestuderen van trigeminus of geniculate ganglia of worden gebruikt met genetisch gecodeerde sensoren voor spannings- of celsignaleringsmoleculen, zoals cyclisch AMP. Het vergt oefening om deze operatie uit te voeren. Je kunt oefenen op maximaal zes dorsale wortelganglia op een enkel dier.Ik zal de procedure zelf demonstreren, met assistentie van John Shannonhouse en Mr.Ruben Gomez. Plaats om te beginnen de muis op een verwarmde pad om de lichaamstemperatuur op 37 graden Celsius te houden. Lokaliseer de lumbale vergroting door het bekkenbot van de muis te voelen.Scheer vervolgens de achterkant van de muis boven het gebied van lumbale vergroting. Maak met een schaar een driezijdige rechthoekige incisie boven de lumbale vergroting en vouw de huid weg met een tang. Gebruik de veerdissectieschaar van 13 millimeter om incisies van drie tot vier millimeter aan de rechterkant van de wervelkolom te maken.Gebruik een schaar om de huid en spieren naar de zijkanten terug te knippen om de wervelkolom bloot te leggen. Knip vervolgens met een schaar van acht millimeter de spier en het bindweefsel weg om het dwarsproces van de rechterkant L5 DRG schoon te maken. Probeer bloedingen te minimaliseren door katoen of gelschuim te gebruiken om het bloed te absorberen.Knip het L5-dwarsproces aan de rechterkant open met Friedman-Pearson-rongeurs of een sterke fijne tang, waarbij u voorzichtig bent om de DRG niet aan te raken. Verplaats vervolgens de muis en het verwarmingskussen naar het aangepaste werkgebied. Gebruik podiumtape om het dier en het verwarmingskussen op hun plaats te houden.Plaats de neus van het dier in de neuskegel voor continue isofluraananesthesie. Bevestig de rechter achterpoot die uitsteekt in een positie buiten het podium voor eenvoudige toepassing van de stimuli. Bevestig de wervelkolom op zijn plaats met de podiumklemmen over de huid op de wervels of het bekkenbot net rostral en caudaal naar de L5 DRG.Pas de klemmen en het podium aan om het oppervlak van de DRG zo waterpas mogelijk te maken. Plaats vervolgens het podium onder de microscoop, zodat het objectief direct acht millimeter boven de DRG ligt wanneer het wordt neergelaten. Plaats de rectale thermometer.Sluit de hoogspanningslijnen aan op het verwarmingskussen en de rectale thermometer. Sluit de neuskegel aan op de isofluraangasleidingen. Gebruik een rechtopstaande confocale microscoop met een 10x 0,4 DIC objectief en de bijbehorende software voor beeldvorming.Gebruik de groene FITC-filterinstellingen van excitatie op 495 nanometer, emissie op 519 nanometer en detectiegolflengte tussen 500 en 580 nanometer. Zoek onder de microscoop het oppervlak van de DRG. Pas de klemmen op het podium aan zodat het DRG-oppervlak zo vlak mogelijk is en het maximale oppervlak wordt gevisualiseerd in het brandpuntsvlak.Controleer het dier gedurende de hele procedure om isofluraananesthesie te behouden zonder overdosering. Om het microscoop snelle scanprotocol te laden, gebruikt u de typische instellingen van voxelgrootte 2,496 bij 2,496 bij 16 micron, 512 bij 512 pixels, 10 optische slice Z-stack, één Airy-eenheid voor 32 micrometer, 1% laservermogen van 488 nanometer en vijf milliwatt, pixeltijd 1,52 microseconden, lijntijd 0,91 milliseconden, frametijd 465 milliseconden, LSM-scansnelheid van acht, bidirectioneel scannen, PMT-detectorversterking 650 volt en digitale versterking van één. Maak een korte scan van acht cycli van de DRG door te klikken op Experiment starten onder het tabblad Acquisitie.Maak een film door een orthogonale projectie te maken van scans met één scan per frame in de loop van de tijd. Controleer handmatig op beeldhelderheid en beeldartefacten, zoals helderheidsgolven die de DRG kruisen. Pas de klempositie en de optische sectiedikte aan en herhaal deze stap totdat een heldere film van hoge kwaliteit is bereikt.Laad vervolgens het microscoop hoge resolutie scanprotocol met behulp van de typische instellingen van voxelgrootte 1,248 bij 1,248 bij 14 micron, 1024 bij 1024 pixels, zes optische slice Z-stack, 1,2 luchtige eenheid of 39 micrometer, 5% laservermogen van 488 nanometer en 25 milliwatt, pixeltijd 2,06 microseconden, lijntijd 4,95 milliseconden, frametijd 5,06 seconden, LSM-scansnelheid van zes, bidirectioneel scannen, PMT-detectorversterking bij 650 volt en digitale versterking van één. Klik op de knop Experiment starten onder het tabblad Acquisitie om een afbeelding met hoge resolutie van de DRG te maken. Laad het snelle scanprotocol van de microscoop en registreer spontane activiteit in de DRG gedurende 80 cycli.Genereer een orthogonale projectiefilm en controleer of het beeld van voldoende kwaliteit is voor analyse. Voor het aanbrengen van stimuli stelt u de microscoop in om 15 tot 20 scans uit te voeren. Wacht tot scans één tot vijf zijn voltooid om de basislijn te produceren.Pas de stimulus toe tijdens scans zes tot 10. Wacht ten minste vijf minuten na elke stimulus voordat u de volgende toepast om desensibilisatie te voorkomen. Voor een mechanische pers, houd de pincher van de algometer met de poot tussen de peddels zonder de poot aan te raken.Knijp in de poot die direct na het einde van scan vijf begint en direct na scan 10 stopt. Controleer de perskracht met een algometer en zorg ervoor dat deze niet meer dan 10 g boven de gewenste kracht uitkomt. Verwarm voor thermische prikkels een bekerglas water tot net boven de gewenste temperatuur.Wanneer het water op de juiste temperatuur is, breng je de stimulus direct na scan vijf aan door de poot onder te dompelen in het water. Trek het bekerglas direct na scan 10 weg. Chirurgische blootstelling aan L5 DRG gevolgd door confocale microscopie maakte het mogelijk om tot 1.800 neuronen tegelijk in beeld te brengen met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen.Primaire sensorische neuronen werden waargenomen in een ensemble op populatieniveau voor spontane calciumtransiënten in afwezigheid van stimuli en als reactie op stimuli in hun normale fysiologische context. Sterke stimuli of schadelijke hitte verhoogden de calciumrespons. Vergeleken met persen met 100 g, verhoogde persen met 300 g het aantal neuronen dat calciumtransiënten produceerde en het delta F door F0-gebied onder de curve.Warme warmte in een niet-schadelijk temperatuurbereik van 21 en 45 graden Celsius verhoogde het aantal neuronen dat calciumtransiënten produceerde en het delta F door F0-gebied onder de curve. Niet-schadelijke temperaturen activeerden een kleiner aantal neuronen die transiënten produceerden in vergelijking met een schadelijke hitteprikkel bij 57 graden Celsius. Verder produceerden neuronen met een kleinere en gemiddelde diameter spontaan en onder alle stimuli calciumtransiënt, maar neuronen met een grotere diameter produceerden alleen calciumtransiënten als reactie op de 300 g persprikkel.De DRG moet waterpas en optimale optische plakdikte hebben. Het moet zodanig zijn dat je het maximale aantal cellen kunt detecteren en er geen golvendheid in de film is. Deze techniek is gebruikt voor het analyseren van sensorische modaliteiten op populatieniveau voor somatosensatie en smaak en om aangrenzende neuronen te bestuderen die in paren of in gesynchroniseerde clusters worden geactiveerd die bijdragen aan chronische en neuropathische pijn.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks (Video) | JoVE 

Functionele Beeldvorming Calcium in ontwikkelingslanden Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans (Video) | JoVE 

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration Video (Video) | JoVE

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals Video (Video) | JoVE

Een procedure voor het implanteren van georganiseerde Arrays van microwires voor Single-unit Opnamen in Awake, Gedragen Dieren

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb Video (Video) | JoVE

Ex Vivo Bereidingen van de Intact Vomeronasal en accessoires bulbus olfactorius

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents Video (Video) | JoVE

Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons Video (Video) | JoVE

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release Video (Video) | JoVE

Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...