Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions R01DE026677 et R01DE031477 des National Institutes of Health (à Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) et un prix Rising STAR du système de l’Université du Texas (Y.S.K.).

Toutes les procédures décrites ici ont été effectuées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio.
NOTE: Une fois commencé, la chirurgie animale (étape 1) et l’imagerie (étape 2) doivent être complétées de manière continue. L’analyse des données (étape 3) peut être effectuée ultérieurement.
1. Chir...

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	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

La douleur persistante est présente dans un large éventail de troubles, débilitante et/ou réduisant la qualité de vie d’environ 8% des personnes29. Les neurones sensoriels primaires détectent les stimuli nocifs sur la peau, et leur plasticité contribue à la persistance de la douleur8. Bien que les neurones puissent être étudiés en culture cellulaire et explants, cela les éloigne de leur contexte physiologique normal. L’exposition chirurgicale du DRG, suivie ...

Les neurones sensoriels primaires innervent directement la peau et ramènent l’information somatosensorielle au système nerveux central 1,2. Les ganglions radiculaires dorsaux (DRG) sont des amas cellulaires de 10 000 à 15 000 neurones sensoriels primaires 3,4. Les neurones DRG présentent divers modèles d’expression de taille, de myélinisation et de gènes et de récepteurs. Les neurones de plus petit diamètre comprennent les neurones sensibles à la douleur et les neurones de plus grand diamètre répondent généralement à des stimuli mécaniques non douloureux 5,6. Les troubles des neurones sensoriels primaires tels que les blessures, l’inflammation chronique et les neuropathies périphériques peuvent sensibiliser ces neurones à divers stimuli et contribuer à la douleur chronique, à l’allodynie et à l’hypersensibilité à la douleur 7,8. Par conséquent, l’étude des neurones DRG est importante pour comprendre à la fois la somatosensation en général et de nombreux troubles de la douleur et des démangeaisons.
Les neurones qui tirent in vivo sont essentiels à la somatosensation, mais jusqu’à récemment, les outils permettant d’étudier in vivo les ganglions intacts étaient limités à un nombre relativement restreint de cellules9. Ici, nous décrivons une méthode puissante pour étudier les potentiels d’action ou les activités des neurones au niveau de la population in vivo en tant qu’ensemble. La méthode utilise l’imagerie basée sur la dynamique cytoplasmique Ca2+. Les indicateurs fluorescents sensibles au Ca 2+ sont de bons indicateurs pour mesurer l’activité cellulaire en raison de la concentration normalement faible de Ca2+ cytoplasmique. Ces indicateurs ont permis de surveiller simultanément des centaines à plusieurs milliers de neurones sensoriels primaires chez les souris 9,10,11,12,13,14,15,16 et les rats17. La méthode d’imagerie Ca2+ in vivo décrite dans cette étude peut être utilisée pour observer directement les réponses au niveau de la population aux stimuli mécaniques, froids, thermiques et chimiques.
La protéine membranaire liant le phosphoinositide, Pirt, est exprimée à des niveaux élevés dans presque tous les neurones sensoriels primaires (>95%)18,19 et peut être utilisée pour piloter l’expression du capteur Ca 2+, GCaMP3, pour surveiller l’activité des neurones in vivo20. Dans ce protocole, des techniques sont décrites pour effectuer une chirurgie DRG in vivo, une imagerie Ca2+ et une analyse dans le DRG lombaire 5 (L5) droit de souris Pirt-GCaMP314 à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (LSM).

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
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in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

L’imagerie Ca 2+ peut être utilisée comme proxy de l’activité cellulaire, y compris les potentiels d’action et divers mécanismes de signalisation impliquant l’entrée de Ca 2+ dans le cytoplasme ou la libération de réserves intracellulaires de Ca2+. L’imagerie Ca2+ basée sur Pirt-GCaMP3 des neurones sensoriels primaires du ganglion de la racine dorsale (DRG) chez la souris offre l’avantage de mesurer simultanément un grand nombre de cellules. Jusqu’à 1 800 neurones peuvent être surveillés, ce qui permet d’étudier les réseaux neuronaux et les processus somatosensoriels en tant qu’ensemble dans leur contexte physiologique normal au niveau de la population in vivo. Le grand nombre de neurones surveillés permet de détecter des schémas d’activité qui seraient difficiles à détecter en utilisant d’autres méthodes. Les stimuli peuvent être appliqués à la patte postérieure de la souris, ce qui permet d’étudier les effets directs des stimuli sur l’ensemble neuronal DRG. Le nombre de neurones produisant des transitoires Ca 2+ ainsi que l’amplitude des transitoires Ca2+ indiquent une sensibilité à des modalités sensorielles spécifiques. Le diamètre des neurones fournit des preuves de types de fibres activées (mécano non nocif vs fibres nocives de la douleur, fibres Aβ, Aδ et C). Les neurones exprimant des récepteurs spécifiques peuvent être marqués génétiquement avec la tomate td-tomate et des recombinases Cre spécifiques avec Pirt-GCaMP. Par conséquent, l’imagerie Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG fournit un outil et un modèle puissants pour l’analyse de modalités sensorielles spécifiques et de sous-types de neurones agissant comme un ensemble au niveau de la population pour étudier la douleur, les démangeaisons, le toucher et d’autres signaux somatosensoriels.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figure 4 : Images représentatives des ganglions de la racine dorsale L5 de souris Pirt-GCaMP3. (A,D) Des scans haute résolution à image unique des ganglions de la racine dorsale L5 de souris Pirt-GCaMP3 sont montrés. (B, E) . Projections d’intensité moyenne de 15 images de ganglions DRG de Pi...

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In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

Ce protocole décrit l’exposition chirurgicale du ganglion radiculaire dorsal (DRG) suivi de GCaMP3 (indicateur Ca2+ codé génétiquement; Protéine fluorescente verte-calmoduline-protéine M13 3) Imagerie Ca2+ des ensembles neuronaux à l’aide de souris Pirt-GCaMP3 tout en appliquant une variété de stimuli à la patte postérieure ipsilatérale.

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Le nombre de neurones surveillés à l’aide de cette méthode permet la collecte de données de réseau de neurones qui serait impossible avec des méthodes plus anciennes ou autres. Le principal avantage de cette technique est la capacité de surveiller près de 2 000 neurones sensoriels primaires à la fois, répondant directement aux stimuli appliqués à la patte postérieure. Cette procédure est particulièrement bien adaptée à l’étude des interventions thérapeutiques pour l’allodynie périphérique et l’hypersensibilité à la douleur.Cette méthode peut être adaptée à l’étude des ganglions du trijumeau ou géniculés ou utilisée avec des capteurs génétiquement codés pour les molécules de signalisation de tension ou cellulaire, telles que l’AMP cyclique. Il faut de la pratique pour effectuer cette chirurgie. Vous pouvez pratiquer jusqu’à six ganglions de la racine dorsale sur un seul animal.La démonstration de la procédure sera moi-même, avec l’aide de John Shannonhouse et de M. Ruben Gomez. Pour commencer, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 degrés Celsius. Localisez l’élargissement lombaire en palpant l’os pelvien de la souris.Ensuite, rasez le dos de la souris au-dessus de la zone d’élargissement lombaire. À l’aide de ciseaux, faites une incision rectangulaire à trois côtés au-dessus de l’élargissement lombaire et pliez la peau avec une pince. Utilisez les ciseaux à dissection à ressort de 13 millimètres pour faire des incisions de trois à quatre millimètres sur le côté droit de la colonne vertébrale.Utilisez des ciseaux pour couper la peau et les muscles sur les côtés afin d’exposer la colonne vertébrale. Ensuite, à l’aide de ciseaux de huit millimètres, coupez le muscle et le tissu conjonctif pour nettoyer le processus transversal du côté droit L5 DRG. Essayez de minimiser les saignements en utilisant du coton ou du Gelfoam pour absorber le sang.Coupez le processus transversal L5 du côté droit à l’aide de rongeurs Friedman-Pearson ou de pinces fines fortes, en prenant soin de ne pas toucher le DRG. Ensuite, déplacez la souris et le coussin chauffant sur la scène personnalisée. Utilisez du ruban adhésif pour fixer l’animal et le coussin chauffant en place.Placez le nez de l’animal dans le cône nasal pour une anesthésie continue à l’isoflurane. Fixez la patte postérieure droite en dehors de la scène pour faciliter l’application des stimuli. Fixez la colonne vertébrale en place avec les pinces de scène sur la peau sur les vertèbres ou l’os pelvien juste rostral et caudale au L5 DRG.Ajustez les pinces et la platine pour rendre la surface du DRG aussi plane que possible. Ensuite, placez la platine sous le microscope de sorte que l’objectif soit directement huit millimètres au-dessus du DRG lorsqu’il est abaissé. Insérez le thermomètre rectal.Connectez les lignes électriques au coussin chauffant et au thermomètre rectal. Connectez le cône de nez aux conduites de gaz isoflurane. Utilisez un microscope confocal vertical avec un objectif DIC 10x 0,4 et le logiciel associé pour l’imagerie.Utilisez les paramètres du filtre FITC vert d’excitation à 495 nanomètres, d’émission à 519 nanomètres et de longueur d’onde de détection comprise entre 500 et 580 nanomètres. Au microscope, retrouvez la surface du DRG. Ajustez les pinces sur la scène afin que la surface DRG soit aussi plane que possible et que la surface maximale soit visualisée dans le plan focal.Surveillez l’animal tout au long de la procédure pour maintenir l’anesthésie à l’isoflurane sans surdosage. Pour charger le protocole de balayage rapide du microscope, utilisez les paramètres typiques de taille voxel 2.496 par 2.496 par 16 microns, 512 x 512 pixels, 10 Z-stack de tranche optique, une unité Airy pour 32 micromètres, 1% de puissance laser de 488 nanomètres et cinq milliwatts, temps de pixel 1,52 microseconde, temps de ligne 0,91 millisecondes, temps d’image 465 millisecondes, vitesse de balayage LSM de huit, balayage bidirectionnel, gain du détecteur PMT 650 volts et gain numérique d’un. Faites une courte analyse en huit cycles du DRG en cliquant sur Démarrer l’expérience sous l’onglet Acquisition.Créez un film en effectuant une projection orthogonale des numérisations à un balayage par image au fil du temps. Vérifiez manuellement la clarté de l’image et les artefacts d’imagerie, tels que les ondes de luminosité traversant le DRG. Ajustez la position de la pince et l’épaisseur de la section optique, puis répétez cette étape jusqu’à ce qu’un film clair et de haute qualité soit obtenu.Ensuite, chargez le protocole de balayage haute résolution du microscope en utilisant les paramètres typiques de taille de voxel 1,248 par 1,248 par 14 microns, 1024 par 1024 pixels, six tranches optiques Z-stack, unité 1,2 Airy ou 39 micromètres, 5% de puissance laser de 488 nanomètres et 25 milliwatts, temps de pixel 2,06 microsecondes, temps de ligne 4,95 millisecondes, temps d’image 5,06 secondes, vitesse de numérisation LSM de six, balayage bidirectionnel, gain du détecteur PMT à 650 volts et gain numérique d’un. Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience sous l’onglet Acquisition pour créer une image haute résolution du DRG. Chargez le protocole de balayage rapide du microscope et enregistrez l’activité spontanée dans le DRG pendant 80 cycles.Générez un film de projection orthogonal et vérifiez que l’image est de qualité suffisante pour l’analyse. Pour appliquer des stimuli, réglez le microscope pour effectuer 15 à 20 scans. Attendez que les analyses soient terminées de une à cinq pour produire la ligne de base.Appliquez le stimulus pendant les scans six à 10. Attendez au moins cinq minutes après chaque stimulus avant d’appliquer le suivant pour éviter la désensibilisation. Pour une presse mécanique, tenez la pince de l’algomètre avec la patte entre les palettes sans toucher la patte.Pincez la patte immédiatement après la fin de l’analyse cinq et arrêtez-la immédiatement après l’analyse 10. Surveillez la force de la presse à l’aide d’un algomètre et assurez-vous qu’elle ne dépasse pas 10 g au-dessus de la force souhaitée. Pour les stimuli thermiques, chauffez un bécher d’eau juste au-dessus de la température désirée.Lorsque l’eau est à la bonne température, appliquez le stimulus immédiatement après le balayage cinq en immergeant la patte dans l’eau. Retirez le bécher immédiatement après le balayage 10. L’exposition chirurgicale L5 DRG suivie d’une microscopie confocale a permis d’imager jusqu’à 1 800 neurones à la fois à l’aide de souris Pirt-GCaMP3.Des neurones sensoriels primaires ont été observés dans un ensemble au niveau de la population pour les transitoires spontanés de calcium en l’absence de stimuli et en réponse à des stimuli dans leur contexte physiologique normal. Des stimuli forts ou une chaleur nocive augmentaient les réponses au calcium. Par rapport au pressage avec 100 g, le pressage avec 300 g a augmenté le nombre de neurones produisant des transitoires de calcium et l’aire delta F par F0 sous la courbe.La chaleur chaude dans une plage de température non nocive de 21 et 45 degrés Celsius a augmenté le nombre de neurones produisant des transitoires de calcium et la zone delta F par F0 sous la courbe. Les températures non nocives ont activé un plus petit nombre de neurones produisant des transitoires par rapport à un stimulus thermique nocif à 57 degrés Celsius. De plus, les neurones de plus petit et moyen diamètre produisaient spontanément du calcium transitoire et sous tous les stimuli, mais les neurones de plus grand diamètre ne produisaient que des transitoires de calcium en réponse au stimulus de pression de 300 g.Le DRG doit être de niveau et d’épaisseur de tranche optique optimale. Il devrait être tel que vous puissiez détecter le nombre maximum de cellules et qu’il n’y ait pas d’ondulation dans le film. Cette technique a été utilisée pour analyser les modalités sensorielles au niveau de la population pour la somatosensation et le goût et pour étudier les neurones adjacents s’activant par paires ou en grappes synchronisées contribuant à la douleur chronique et neuropathique.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

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Imagerie fonctionnelle en calcium développement des réseaux corticaux

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

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En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

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Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

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Une procédure d&#39;implantation de tableaux organisés de microfils pour enregistrements unitaires dans Awake, se comportant Animaux

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

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Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

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Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs

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Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

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Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release Video (Video) | JoVE

Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...