Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants R01DE026677 und R01DE031477 (an Y.S.K.), UTHSCSA Startup Fund (Y.S.K.) und einen Rising STAR Award der University of Texas System (Y.S.K.) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt wurde.
HINWEIS: Einmal begonnen, müssen die Tierchirurgie (Schritt 1) und die Bildgebung (Schritt 2) kontinuierlich abgeschlossen werden. Die Datenanalyse (Schritt 3) kann zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden.
1. Operation und Sich...

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	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

Anhaltende Schmerzen treten bei einer Vielzahl von Erkrankungen auf und beeinträchtigen und/oder verringern die Lebensqualität von etwa 8 % der Menschen29. Primäre sensorische Neuronen erkennen schädliche Reize auf der Haut, und ihre Plastizität trägt zu anhaltenden Schmerzen bei8. Während Neuronen in Zellkulturen und Explantaten untersucht werden können, werden sie dadurch aus ihrem normalen physiologischen Kontext entfernt. Die chirurgische Exposition des DRG, gef...

Primäre sensorische Neuronen innervieren direkt die Haut und leiten somatosensorische Informationen zurück an das zentrale Nervensystem 1,2. Dorsale Wurzelganglien (DRGs) sind Zellkörpercluster von 10.000-15.000 primären sensorischen Neuronen 3,4. DRG-Neuronen weisen unterschiedliche Größe, Myelinisierungsgrade sowie Gen- und Rezeptorexpressionsmuster auf. Neuronen mit kleinerem Durchmesser umfassen schmerzempfindliche Neuronen, und Neuronen mit größerem Durchmesser reagieren typischerweise auf nicht-schmerzhafte mechanische Reize 5,6. Störungen in den primären sensorischen Neuronen wie Verletzungen, chronische Entzündungen und periphere Neuropathien können diese Neuronen für verschiedene Reize sensibilisieren und zu chronischen Schmerzen, Allodynie und Schmerzüberempfindlichkeit beitragen 7,8. Daher ist die Untersuchung von DRG-Neuronen wichtig, um sowohl die Somatosensibilität im Allgemeinen als auch viele Schmerz- und Juckreizerkrankungen zu verstehen.
Neuronen, die in vivo feuern, sind für die Somatosensibilität unerlässlich, aber bis vor kurzem waren Werkzeuge zur Untersuchung intakter Ganglien in vivo auf eine relativ kleine Anzahl von Zellen beschränkt 9. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige Methode, um die Aktionspotentiale oder Aktivitäten von Neuronen auf Populationsebene in vivo als Ensemble zu untersuchen. Die Methode verwendet Bildgebung, die auf der zytoplasmatischen Ca2+-Dynamik basiert. Die Ca 2+ empfindlichen Fluoreszenzindikatoren sind aufgrund der normalerweise niedrigen Konzentration von zytoplasmatischem Ca2+ gute Proxies für die Messung der zellulären Aktivität. Diese Indikatoren ermöglichten die gleichzeitige Überwachung von Hunderten bis mehreren Tausend primären sensorischen Neuronen bei Mäusen 9,10,11,12,13,14,15,16 und Ratten 17. Die in dieser Studie beschriebene Methode der In-vivo-Ca2+-Bildgebung kann verwendet werden, um Reaktionen auf Populationsebene auf mechanische, kalte, thermische und chemische Reize direkt zu beobachten.
Das Phosphoinositid-bindende Membranprotein Pirt wird in fast allen (>95%) primären sensorischen Neuronen in hohen Konzentrationen exprimiert18,19 und kann verwendet werden, um die Expression desCa2+-Sensors GCaMP3 zu steuern, um die Neuronenaktivität in vivozu überwachen 20. In diesem Protokoll werden Techniken zur Durchführung von In-vivo-DRG-Operationen, Ca2+-Bildgebung und Analyse im DRG der rechten Lendenwirbelsäule 5 (L5) von Pirt-GCaMP3-Mäusen14 unter Verwendung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) beschrieben.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
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</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

Die Ca 2+-Bildgebung kann als Proxy für die zelluläre Aktivität verwendet werden, einschließlich Aktionspotentialen und verschiedener Signalmechanismen, die den Eintritt von Ca 2+ in das Zytoplasma oder die Freisetzung intrazellulärer Ca 2+-Speicher beinhalten. Die Pirt-GCaMP3-basierte Ca2+ Bildgebung von primären sensorischen Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) in Mäusen bietet den Vorteil der gleichzeitigen Messung einer großen Anzahl von Zellen. Bis zu 1.800 Neuronen können überwacht werden, so dass neuronale Netzwerke und somatosensorische Prozesse als Ensemble in ihrem normalen physiologischen Kontext auf Populationsebene in vivo untersucht werden können. Die große Anzahl der überwachten Neuronen ermöglicht die Erkennung von Aktivitätsmustern, die mit anderen Methoden nur schwer zu erkennen wären. Stimuli können auf die Hinterpfote der Maus angewendet werden, so dass die direkten Auswirkungen von Stimuli auf das DRG-Neuronenensemble untersucht werden können. Die Anzahl der Neuronen, die Ca 2+-Transienten produzieren, sowie die Amplitude der Ca2+-Transienten weisen auf eine Sensitivität gegenüber bestimmten sensorischen Modalitäten hin. Der Durchmesser der Neuronen gibt Aufschluss über aktivierte Fasertypen (nicht-schädliche Mechano- vs. schädliche Schmerzfasern, Aβ-, Aδ- und C-Fasern). Neurone, die spezifische Rezeptoren exprimieren, können genetisch mit td-Tomato und spezifischen Cre-Rekombinasen zusammen mit Pirt-GCaMP markiert werden. Daher bietet die Pirt-GCaMP3 Ca2+ Bildgebung von DRG ein leistungsfähiges Werkzeug und Modell für die Analyse spezifischer sensorischer Modalitäten und Neuronensubtypen, die als Ensemble auf Populationsebene fungieren, um Schmerz, Juckreiz, Berührung und andere somatosensorische Signale zu untersuchen.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Bilder von L5 dorsalen Wurzelganglien von Pirt-GCaMP3 Mäusen. (A,D) Hochauflösende Einzelbildscans von L5 dorsalen Wurzelganglien von Pirt-GCaMP3 Mäusen werden gezeigt. (B,E) . Durchschnittliche Intensitätsprojektionen von 15 Bildern von Pirt-GCaMP3 L5 DRG-Ganglien a...

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In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Die Anzahl der Neuronen, die mit dieser Methode überwacht werden, ermöglicht die Erfassung von Neuronennetzwerkdaten, die mit älteren oder anderen Methoden nicht möglich wären. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, fast 2.000 primäre sensorische Neuronen gleichzeitig zu überwachen und direkt auf Reize zu reagieren, die auf die Hinterpfote angewendet werden. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut, um therapeutische Interventionen bei peripherer Allodynie und Schmerzüberempfindlichkeit zu untersuchen.Diese Methode kann für die Untersuchung von Trigeminus- oder Genikulatganglien angepasst oder mit genetisch kodierten Sensoren für Spannungs- oder Zellsignalmoleküle, wie z. B. zyklisches AMP, verwendet werden. Es braucht Übung, um diese Operation durchzuführen. Sie können an bis zu sechs dorsalen Wurzelganglien an einem einzigen Tier üben.Die Prozedur wird von mir selbst demonstriert, mit Unterstützung von John Shannonhouse und Mr. Ruben Gomez. Legen Sie die Maus zunächst auf ein beheiztes Pad, um die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten. Lokalisieren Sie die Vergrößerung der Lendenwirbelsäule, indem Sie den Beckenknochen der Maus abtasten.Rasieren Sie dann den Mausrücken über dem Bereich der Lendenvergrößerung. Machen Sie mit einer Schere einen dreiseitigen rechteckigen Schnitt über der Lendenwirbelvergrößerung und falten Sie die Haut mit einer Pinzette weg. Machen Sie mit der 13-Millimeter-Federdissektionsschere drei bis vier Millimeter Schnitte auf der rechten Seite der Wirbelsäule.Verwenden Sie eine Schere, um die Haut und die Muskeln zu den Seiten zurückzuschneiden, um die Wirbelsäule freizulegen. Schneiden Sie dann mit einer Acht-Millimeter-Schere den Muskel und das Bindegewebe ab, um den Querfortsatz des rechtsseitigen L5-DRG zu reinigen. Versuchen Sie, Blutungen zu minimieren, indem Sie Baumwolle oder Gelschaum verwenden, um das Blut aufzunehmen.Schneiden Sie den rechten L5-Querfortsatz mit Friedman-Pearson-Rongeuren oder einer starken feinen Pinzette auf und achten Sie darauf, das DRG nicht zu berühren. Bewegen Sie als Nächstes die Maus und das Heizkissen auf die benutzerdefinierte Bühne. Verwenden Sie Bühnenklebeband, um das Tier und das Heizkissen an Ort und Stelle zu befestigen.Legen Sie die Nase des Tieres in den Nasenkegel für eine kontinuierliche Isofluran-Anästhesie. Fixieren Sie die rechte Hinterpfote, die aus einer Position außerhalb der Bühne herausragt, um die Reize leicht anwenden zu können. Fixieren Sie die Wirbelsäule mit den Tischklemmen über der Haut an den Wirbeln oder dem Beckenknochen direkt rostral und kaudal zum L5 DRG.Stellen Sie die Klemmen und den Tisch so ein, dass die Oberfläche des DRG so eben wie möglich wird. Platzieren Sie dann den Tisch so unter dem Mikroskop, dass sich das Objektiv beim Absenken direkt acht Millimeter über dem DRG befindet. Setzen Sie das Rektalthermometer ein.Schließen Sie die Stromleitungen an das Heizkissen und das Rektalthermometer an. Verbinden Sie den Nasenkonus mit den Isoflurangasleitungen. Verwenden Sie ein aufrechtes konfokales Mikroskop mit einem 10x 0,4 DIC-Objektiv und der zugehörigen Software für die Bildgebung.Verwenden Sie die grünen FITC-Filtereinstellungen für Anregung bei 495 Nanometern, Emission bei 519 Nanometern und Detektionswellenlänge zwischen 500 und 580 Nanometern. Suchen Sie unter dem Mikroskop die Oberfläche des DRG. Stellen Sie die Klemmen auf dem Tisch so ein, dass die DRG-Oberfläche so eben wie möglich ist und die maximale Oberfläche in der Fokusebene visualisiert wird.Überwachen Sie das Tier während des gesamten Eingriffs, um die Isofluran-Anästhesie ohne Überdosierung aufrechtzuerhalten. Um das Mikroskop-Schnellscanning-Protokoll zu laden, verwenden Sie die typischen Einstellungen der Voxelgröße 2,496 x 2,496 x 16 Mikrometer, 512 x 512 Pixel, 10 optische Schichten Z-Stapel, eine Airy-Einheit für 32 Mikrometer, 1 % Laserleistung von 488 Nanometern und fünf Milliwatt, Pixelzeit 1,52 Mikrosekunden, Zeilenzeit 0,91 Millisekunden, Bildzeit 465 Millisekunden, LSM-Scangeschwindigkeit von acht, bidirektionale Abtastung, PMT-Detektorverstärkung 650 Volt und digitale Verstärkung von eins. Führen Sie einen kurzen Scan des DRG mit acht Zyklen durch, indem Sie auf der Registerkarte "Erfassung" auf "Experiment starten" klicken.Erstellen Sie einen Film, indem Sie eine orthogonale Projektion von Scans mit einem Scan pro Frame im Zeitverlauf erstellen. Überprüfen Sie manuell die Bildschärfe und Bildartefakte, wie z. B. Helligkeitswellen, die das DRG durchqueren. Passen Sie die Klemmposition und die Dicke des optischen Schnitts an und wiederholen Sie diesen Schritt, bis ein klares, qualitativ hochwertiges Video erzielt wird.Laden Sie dann das hochauflösende Scanprotokoll des Mikroskops mit den typischen Einstellungen der Voxelgröße 1,248 x 1,248 x 14 Mikrometer, 1024 x 1024 Pixel, Z-Stapel mit sechs optischen Schichten, 1,2 Airy-Einheit oder 39 Mikrometer, 5% Laserleistung von 488 Nanometern und 25 Milliwatt, Pixelzeit 2,06 Mikrosekunden, Zeilenzeit 4,95 Millisekunden, Bildzeit 5,06 Sekunden, LSM-Scangeschwindigkeit von sechs, bidirektionale Abtastung, PMT-Detektorverstärkung bei 650 Volt und digitale Verstärkung von eins. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten auf der Registerkarte Erfassung, um ein hochauflösendes Bild des DRG zu erstellen. Laden Sie das Schnellscanning-Protokoll des Mikroskops und zeichnen Sie die spontane Aktivität im DRG für 80 Zyklen auf.Generieren Sie einen orthogonalen Projektionsfilm, und überprüfen Sie, ob das Bild eine ausreichende Qualität für die Analyse aufweist. Stellen Sie das Mikroskop für die Anwendung von Reizen auf 15 bis 20 Scans ein. Warten Sie, bis die Scans eins bis fünf abgeschlossen sind, um die Baseline zu erstellen.Wenden Sie den Stimulus während der Scans sechs bis 10 an. Warten Sie nach jedem Stimulus mindestens fünf Minuten, bevor Sie den nächsten anwenden, um eine Desensibilisierung zu vermeiden. Halten Sie für eine mechanische Presse die Zange des Algometers mit der Pfote zwischen den Paddeln, ohne die Pfote zu berühren.Kneifen Sie die Pfote zusammen, beginnend unmittelbar nach dem Ende des fünften Scans und stoppen Sie unmittelbar nach dem 10. Scan. Überwachen Sie die Presskraft mit einem Algometer und stellen Sie sicher, dass sie 10 g über der gewünschten Kraft nicht überschreitet. Für thermische Reize erhitzen Sie ein Becherglas Wasser auf knapp über die gewünschte Temperatur.Wenn das Wasser die richtige Temperatur hat, wenden Sie den Stimulus sofort nach dem fünften Scan an, indem Sie die Pfote in das Wasser tauchen. Ziehen Sie das Becherglas sofort nach Scan 10 ab. Die chirurgische L5-DRG-Exposition mit anschließender konfokaler Mikroskopie ermöglichte es, bis zu 1.800 Neuronen gleichzeitig mit Pirt-GCaMP3-Mäusen abzubilden.Primäre sensorische Neurone wurden in einem Ensemble auf Populationsebene für spontane Kalziumtransienten in Abwesenheit von Reizen und als Reaktion auf Reize in ihrem normalen physiologischen Kontext beobachtet. Starke Reize oder schädliche Hitze verstärkten die Kalziumreaktionen. Im Vergleich zum Pressen mit 100 g erhöhte das Pressen mit 300 g die Anzahl der Neuronen, die Kalziumtransienten produzieren, und den delta F durch F0-Bereich unter der Kurve.Warme Wärme in einem nicht-schädlichen Temperaturbereich von 21 und 45 Grad Celsius erhöhte die Anzahl der Neuronen, die Kalzium-Transienten produzieren, und den delta F durch F0-Bereich unter der Kurve. Nicht-schädliche Temperaturen aktivierten eine geringere Anzahl von Neuronen, die Transienten produzierten, als ein schädlicher Wärmereiz bei 57 Grad Celsius. Darüber hinaus produzierten Neuronen mit kleinerem und mittlerem Durchmesser spontan und unter allen Reizen Kalziumtransienten, während Neuronen mit größerem Durchmesser Kalziumtransienten nur als Reaktion auf den 300-g-Pressreiz produzierten.Das DRG sollte eben sein und eine optimale optische Schichtdicke aufweisen. Es sollte so sein, dass Sie die maximale Anzahl von Zellen erkennen können und es keine Welligkeit im Film gibt. Diese Technik wurde verwendet, um sensorische Modalitäten auf Populationsebene für Somatosensibilität und Geschmack zu analysieren und benachbarte Neuronen zu untersuchen, die paarweise oder in synchronisierten Clustern aktiviert werden und zu chronischen und neuropathischen Schmerzen beitragen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks Video (Video) | JoVE

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans Video (Video) | JoVE

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

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Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

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Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb Video (Video) | JoVE

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents Video (Video) | JoVE

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons Video (Video) | JoVE

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

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Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...