Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01DE026677 ו- R01DE031477 (ל- Y.S.K.), קרן הסטארט-אפ UTHSCSA (Y.S.K.), ופרס כוכב עולה מאוניברסיטת טקסס (Y.S.K).

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו.
הערה: לאחר תחילת הניתוח, יש להשלים ניתוח בעלי חיים (שלב 1) והדמיה (שלב 2) באופן רציף. ניתוח נתונים (שלב 3) עשוי להתבצע מאוחר ?...

<ol>
	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

כאב מתמשך קיים במגוון רחב של הפרעות, מתיש ו / או מוריד את איכות החיים של כ -8% מהאנשים29. נוירונים חושיים ראשוניים מזהים גירויים מזיקים על העור, והפלסטיות שלהם תורמת לכאב מתמשך8. בעוד שניתן לחקור תאי עצב בתרביות תאים ובצמחים, פעולה זו מוציאה אותם מההקשר הפיזיולוגי הרג...

נוירונים חושיים ראשוניים מעצבבים ישירות את העור ונושאים מידע סומטוסנסורי חזרה למערכת העצבים המרכזית 1,2. גרעיני שורש דורסלי (DRGs) הם צבירי גוף תאים של 10,000-15,000 נוירונים חושיים ראשוניים 3,4. נוירוני DRG מציגים גדלים שונים, רמות מיאלינציה ודפוסי ביטוי גנים וקולטנים. נוירונים בקוטר קטן יותר כוללים נוירונים קולטי כאב ותאי עצב בקוטר גדול יותר מגיבים בדרך כלל לגירויים מכניים לא כואבים 5,6. הפרעות בנוירונים החושיים הראשוניים כגון פציעה, דלקת כרונית ונוירופתיות היקפיות יכולות לגרום לרגישות נוירונים אלה לגירויים שונים ולתרום לכאב כרוני, אלודיניה ורגישות יתר לכאב 7,8. לכן, המחקר של נוירוני DRG חשוב להבנת הסומטוסנסציה באופן כללי והפרעות כאב וגירוד רבות.
תאי עצב היורים in vivo חיוניים לסומטוסנסציה, אך עד לאחרונה, כלים לחקר גרעינים שלמים in vivo היו מוגבלים למספר קטן יחסית של תאים9. במאמר זה אנו מתארים שיטה רבת עוצמה לחקר פוטנציאלי הפעולה או הפעילויות של תאי עצב ברמת האוכלוסייה in vivo כמכלול. השיטה משתמשת בדימות המבוסס על דינמיקה ציטופלזמית Ca2+. המדדים הפלואורסצנטיים הרגישים Ca 2+ הם פרוקסי טוב למדידת הפעילות התאית בשל הריכוז הנמוך בדרך כלל של Ca2+ ציטופלזמי. אינדיקטורים אלה אפשרו ניטור סימולטני של מאות עד כמה אלפי נוירונים חושיים ראשוניים בעכברים 9,10,11,12,13,14,15,16 ובחולדות 17. השיטה של הדמיה in vivo Ca2+ המתוארת במחקר זה יכולה לשמש לצפייה ישירה בתגובות ברמת האוכלוסייה לגירויים מכניים, קרים, תרמיים וכימיים.
חלבון הממברנה קושר הפוספואינוזיטיד Pirt מבוטא ברמות גבוהות כמעט בכל (>95%) נוירוני החישה הראשוניים18,19 וניתן להשתמש בו כדי להניע את הביטוי של חיישן Ca 2+, GCaMP3, כדי לנטר את פעילות הנוירונים in vivo20. בפרוטוקול זה, מתוארות טכניקות לביצוע ניתוח DRG in vivo, הדמיה Ca2+ וניתוח בצד ימין מותני 5 (L5) DRG של עכברי Pirt-GCaMP314 באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (LSM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

הדמיית Ca 2+ יכולה לשמש כפרוקסי לפעילות תאית, כולל פוטנציאלי פעולה ומנגנוני איתות שונים הכוללים כניסה של Ca 2+ לציטופלסמה או שחרור מאגרי Ca 2+ תוך תאיים. הדמיית Ca2+ מבוססת Pirt-GCaMP3 של נוירונים חושיים ראשוניים של גנגליון השורש הגבי (DRG) בעכברים מציעה את היתרון של מדידה בו זמנית של מספר רב של תאים. ניתן לנטר עד 1,800 תאי עצב, מה שמאפשר לרשתות עצביות ולתהליכים סומטוסנסוריים להיחקר כמכלול בהקשר הפיזיולוגי הרגיל שלהם ברמת האוכלוסייה in vivo. המספר הגדול של תאי עצב המנוטרים מאפשר זיהוי של דפוסי פעילות שיהיה מאתגר לזהות באמצעות שיטות אחרות. גירויים יכולים להיות מיושמים על כף העכבר האחורית, המאפשר את ההשפעות הישירות של גירויים על הרכב נוירונים DRG להילמד. מספר תאי העצב המייצרים Ca 2+ transients כמו גם המשרעת של Ca2+ transients מצביע על רגישות לאופני חוש ספציפיים. קוטר תאי העצב מספק עדות לסוגי סיבים פעילים (מכנו לא מזיק לעומת סיבי כאב מזיקים, סיבי Aβ, Aδ ו-C). נוירונים המבטאים קולטנים ספציפיים יכולים להיות מסומנים גנטית עם td-Tomato ורקומבינזות Cre ספציפיות יחד עם Pirt-GCaMP. לכן, הדמיית Pirt-GCaMP3 Ca2+ של DRG מספקת כלי רב עוצמה ומודל לניתוח של אופני חישה ספציפיים ותת-סוגים של נוירונים הפועלים כאנסמבל ברמת האוכלוסייה לחקר כאב, גירוד, מגע ואותות סומטוסנסורים אחרים.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> איור 4: תמונות מייצגות של גרעיני שורש גבי L5 של עכברי Pirt-GCaMP3. (A,D) מוצגות סריקות ברזולוציה גבוהה במסגרת אחת של גרעיני שורש גבי L5 של עכברי Pirt-GCaMP3. (ב,ה) . תחזיות עוצמה ממוצעת...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

מספר תאי העצב המנוטרים בשיטה זו מאפשר איסוף נתוני רשת נוירונים שלא היו אפשריים בשיטות ישנות או אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לפקח על כמעט 2, 000 נוירונים חושיים ראשוניים בבת אחת, להגיב ישירות לגירויים החלים על הכף האחורית. הליך זה מתאים במיוחד ללימוד התערבויות טיפוליות עבור אלודיניה היקפית ורגישות יתר לכאב.שיטה זו יכולה להיות מותאמת לחקר גרעינים טריגמינליים או גניקולטים או להשתמש בהם עם חיישנים מקודדים גנטית עבור מולקולות מתח או איתות תאי, כגון AMP מחזורי. נדרש תרגול כדי לבצע ניתוח זה. אתה יכול להתאמן על עד שישה גרעיני שורש גבי על חיה אחת.מי שידגים את ההליך יהיה אני, בעזרתם של ג'ון שאנון ומר רובן גומז. כדי להתחיל, הנח את העכבר על כרית מחוממת כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37 מעלות צלזיוס. אתר את ההגדלה המותנית על ידי הרגשת עצם האגן של העכבר.לאחר מכן, לגלח את גב העכבר מעל האזור של הגדלת מותני. בעזרת מספריים מבצעים חתך מלבני תלת צדדי מעל ההגדלה המותנית, ומקפלים את העור בעזרת מלקחיים. השתמש במספריים לדיסקציה קפיץ של 13 מ"מ כדי לבצע חתכים של שלושה עד ארבעה מילימטרים בצד ימין של עמוד השדרה.השתמש מספריים לחתוך את העור ואת השרירים לצדדים כדי לחשוף את עמוד השדרה. לאחר מכן, באמצעות מספריים שמונה מילימטר, לחתוך את השריר ואת רקמת החיבור כדי לנקות את התהליך הרוחבי של צד ימין L5 DRG. נסה למזער דימום באמצעות כותנה או Gelfoam כדי לספוג את הדם.פתח את התהליך הרוחבי L5 בצד ימין באמצעות רונגיורים פרידמן-פירסון או מלקחיים עדינים חזקים, תוך זהירות לא לגעת DRG. לאחר מכן, העבר את העכבר ואת כרית החימום אל הבמה המותאמת אישית. השתמש בסרט הבמה כדי לאבטח את בעל החיים ואת כרית החימום במקומה.מניחים את אפו של בעל החיים בחרוט האף להרדמה איזופלורנית רציפה. אבטחו את הכף האחורית הימנית הבולטת לעמדה מחוץ לבמה ליישום קל של הגירויים. אבטחו את עמוד השדרה במקומו עם מהדקי הבמה על העור בחוליות או עצם האגן רק רוסטרלית וקאודלית ל- L5 DRG.התאם את המלחציים ואת הבמה כדי להפוך את פני השטח של DRG לרמה ככל האפשר. לאחר מכן, מקם את השלב מתחת למיקרוסקופ כך שהמטרה תהיה ישירות שמונה מילימטרים מעל DRG כאשר מורידים אותו. הכנס את המדחום הרקטלי.חברו את קווי החשמל לכרית החימום ולמדחום פי הטבעת. חבר את חרוט האף לקווי הגז איזופלורן. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם מטרה 10x 0.4 DIC והתוכנה המשויכת להדמיה.השתמש בהגדרות מסנן FITC הירוק של עירור ב 495 ננומטר, פליטה ב 519 ננומטר, ואורך גל גילוי בין 500 ל 580 ננומטר. מתחת למיקרוסקופ, למצוא את פני השטח של DRG. התאם את המהדקים על הבמה כך שמשטח DRG יהיה ברמה ככל האפשר ושטח הפנים המרבי יודגם במישור המוקד.לפקח על החיה לאורך כל ההליך כדי לשמור על הרדמה isoflurane ללא מנת יתר. כדי לטעון את פרוטוקול הסריקה המהירה של המיקרוסקופ, השתמש בהגדרות האופייניות של גודל ווקסל 2.496 על 2.496 על 16 מיקרון, 512 על 512 פיקסלים, 10 פרוסה אופטית Z-stack, יחידה אוורירית אחת עבור 32 מיקרומטר, 1% עוצמת לייזר של 488 ננומטר וחמישה מיליוואט, זמן פיקסל 1.52 מיקרו-שניות, זמן קו 0.91 אלפיות השנייה, זמן פריימים 465 אלפיות השנייה, מהירות סריקת LSM של שמונה, סריקה דו-כיוונית, גלאי PMT רווח של 650 וולט, ורווח דיגיטלי של אחד. בצע סריקה קצרה בת שמונה מחזורים של DRG על ידי לחיצה על התחל ניסוי תחת הכרטיסייה רכישה.צור סרט על-ידי ביצוע הקרנה אורתוגונלית של סריקות בסריקה אחת לכל מסגרת לאורך זמן. בדוק ידנית את בהירות התמונה ואת תוצרי ההדמיה, כגון גלי בהירות החוצים את DRG. התאם את מיקום המהדק ואת עובי המקטע האופטי, וחזור על שלב זה עד לקבלת סרט ברור ואיכותי.לאחר מכן, טען את פרוטוקול הסריקה ברזולוציה גבוהה במיקרוסקופ באמצעות ההגדרות האופייניות של גודל ווקסל 1.248 על 1.248 על 14 מיקרון, 1024 על 1024 פיקסלים, שש פרוסות אופטיות Z-stack, 1.2 יחידה אוורירית או 39 מיקרומטר, 5% עוצמת לייזר של 488 ננומטר ו 25 מילי וואט, זמן פיקסל 2.06 מיקרו-שניות, זמן קו 4.95 אלפיות השנייה, זמן מסגרת 5.06 שניות, מהירות סריקת LSM של שש, סריקה דו-כיוונית, רווח גלאי PMT ב-650 וולט ורווח דיגיטלי של אחד. לחץ על התחל ניסוי כפתור תחת הכרטיסייה רכישה כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה של DRG. טען את פרוטוקול הסריקה המהירה של המיקרוסקופ, ורשום פעילות ספונטנית ב- DRG במשך 80 מחזורים.צור סרט הקרנה אורתוגונלי וודא שהתמונה באיכות מספקת לניתוח. להחלת גירויים, הגדר את המיקרוסקופ לביצוע 15 עד 20 סריקות. המתן להשלמת סריקות אחת עד חמש כדי להפיק את קו הבסיס.החל את הגירוי במהלך סריקות שש עד 10. המתן לפחות חמש דקות לאחר כל גירוי לפני החלת הגירוי הבא כדי למנוע דה-סנסיטיזציה. ללחיצה מכנית, החזיקו את הפינצ'ר של האלגומטר עם הכף בין המשוטים מבלי לגעת בכפה.צבוט את הכף מיד לאחר סיום סריקה חמש ועצור מיד לאחר סריקה 10. עקוב אחר כוח הלחיצה באמצעות אלגומטר, וודא שהוא אינו עולה על 10 גרם מעל הכוח הרצוי. לגירויים תרמיים, חממו מים בדיוק מעל הטמפרטורה הרצויה.כאשר המים נמצאים בטמפרטורה הנכונה, יש להפעיל את הגירוי מיד לאחר הסריקה החמישית על ידי טבילת הכף במים. משכו את הכד מיד לאחר סריקה 10. חשיפה כירורגית L5 DRG ואחריה מיקרוסקופ קונפוקלי אפשרה עד 1, 800 נוירונים להיות הדמיה בבת אחת באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3.נוירונים חושיים ראשוניים נצפו באנסמבל ברמת האוכלוסייה עבור מעברי סידן ספונטניים בהיעדר גירויים ובתגובה לגירויים בהקשר הפיזיולוגי הרגיל שלהם. גירויים חזקים או חום מזיק הגבירו את תגובות הסידן. בהשוואה ללחיצה עם 100 גרם, לחיצה עם 300 גרם הגדילה את מספר תאי העצב המייצרים מעבר סידן ואת אזור הדלתא F על ידי F0 מתחת לעקומה.חום חם בטווח טמפרטורות לא מזיק של 21 ו -45 מעלות צלזיוס הגדיל את מספר תאי העצב המייצרים מעברי סידן ואת אזור הדלתא F על ידי F0 מתחת לעקומה. טמפרטורות לא מזיקות הפעילו מספר קטן יותר של תאי עצב המייצרים חולפים בהשוואה לגירוי חום מזיק בטמפרטורה של 57 מעלות צלזיוס. יתר על כן, נוירונים בקוטר קטן ובינוני ייצרו סידן חולף באופן ספונטני ומתחת לכל הגירויים, אך נוירונים בקוטר גדול יותר ייצרו רק סידן חולף בתגובה לגירוי העיתונות של 300 גרם.ה- DRG צריך להיות מפולס ועובי פרוסה אופטי אופטימלי. זה צריך להיות כזה שאתה יכול לזהות את המספר המרבי של תאים ואין waviness בסרט. טכניקה זו שימשה לניתוח שיטות חושיות ברמת האוכלוסייה עבור סומטוסנסציה וטעם ולחקר תאי עצב סמוכים הפועלים בזוגות או בצבירים מסונכרנים התורמים לכאב כרוני ונוירופתי.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks Video (Video) | JoVE

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans Video (Video) | JoVE

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration Video (Video) | JoVE

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals Video (Video) | JoVE

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb Video (Video) | JoVE

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents Video (Video) | JoVE

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons Video (Video) | JoVE

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release Video (Video) | JoVE

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...