Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grants R01DE026677 e R01DE031477 (a Y.S.K.), dal fondo di avvio UTHSCSA (Y.S.K.) e da un Rising STAR Award del sistema dell'Università del Texas (Y.S.K.).

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Texas Health Science Center di San Antonio.
NOTA: Una volta iniziato, la chirurgia animale (fase 1) e l'imaging (fase 2) devono essere completati in modo continuo. L'analisi dei dati (fase 3) può essere eseguita successivamente.
1. Chirurgia e fissaggio dell'animale per l'imaging DRG L5 del lato ...

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	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

Il dolore persistente è presente in una vasta gamma di disturbi, debilitanti e / o riducendo la qualità della vita per circa l'8% delle persone29. I neuroni sensoriali primari rilevano stimoli nocivi sulla pelle e la loro plasticità contribuisce al dolore persistente8. Mentre i neuroni possono essere studiati in coltura cellulare ed espianti, così facendo li rimuove dal loro normale contesto fisiologico. L'esposizione chirurgica del DRG, seguita dall'imaging Pirt-GCaMP3...

I neuroni sensoriali primari innervano direttamente la pelle e trasportano le informazioni somatosensoriali al sistema nervoso centrale 1,2. I gangli delle radici dorsali (DRG) sono gruppi di corpi cellulari di 10.000-15.000 neuroni sensoriali primari 3,4. I neuroni DRG presentano diverse dimensioni, livelli di mielinizzazione e modelli di espressione genica e recettoriale. I neuroni di diametro più piccolo includono neuroni sensibili al dolore e neuroni di diametro maggiore rispondono tipicamente a stimoli meccanici non dolorosi 5,6. Disturbi nei neuroni sensoriali primari come lesioni, infiammazione cronica e neuropatie periferiche possono sensibilizzare questi neuroni a vari stimoli e contribuire al dolore cronico, allodinia e ipersensibilità al dolore 7,8. Pertanto, lo studio dei neuroni DRG è importante per comprendere sia la somatosensazione in generale che molti disturbi del dolore e del prurito.
I neuroni che sparano in vivo sono essenziali per la somatosensazione, ma fino a poco tempo fa, gli strumenti per studiare i gangli intatti in vivo erano limitati a un numero relativamente piccolo di cellule 9. Qui, descriviamo un potente metodo per studiare i potenziali d'azione o le attività dei neuroni a livello di popolazione in vivo come insieme. Il metodo utilizza l'imaging basato sulla dinamica citoplasmatica di Ca2+. Gli indicatori fluorescenti sensibili al Ca 2+ sono buoni proxy per misurare l'attività cellulare a causa della concentrazione normalmente bassa di Ca2+ citoplasmatico. Questi indicatori hanno permesso il monitoraggio simultaneo di centinaia o diverse migliaia di neuroni sensoriali primari nei topi 9,10,11,12,13,14,15,16 e nei ratti 17. Il metodo di imaging in vivo Ca2+ descritto in questo studio può essere utilizzato per osservare direttamente le risposte a livello di popolazione a stimoli meccanici, freddi, termici e chimici.
La proteina di membrana legante i fosfoinositidi, Pirt è espressa ad alti livelli in quasi tutti i neuroni sensoriali primari (>95%)18,19 e può essere utilizzata per guidare l'espressione del sensore Ca 2+, GCaMP3, per monitorare l'attività neuronale in vivo20. In questo protocollo, vengono descritte le tecniche per eseguire interventi chirurgici DRG in vivo, imaging Ca2+ e analisi nel DRG lombare 5 (L5) destro di topi Pirt-GCaMP314 utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (LSM).

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
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in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

L'imaging di Ca 2+ può essere utilizzato come proxy per l'attività cellulare, compresi i potenziali d'azione e vari meccanismi di segnalazione che coinvolgono l'ingresso di Ca 2+ nel citoplasma o il rilascio di riserve intracellulari di Ca 2+. L'imaging Ca2+ basato su Pirt-GCaMP3 dei neuroni sensoriali primari del ganglio della radice dorsale (DRG) nei topi offre il vantaggio della misurazione simultanea di un gran numero di cellule. È possibile monitorare fino a 1.800 neuroni, consentendo di studiare le reti neuronali e i processi somatosensoriali come un insieme nel loro normale contesto fisiologico a livello di popolazione in vivo. Il gran numero di neuroni monitorati consente di rilevare modelli di attività che sarebbero difficili da rilevare utilizzando altri metodi. Gli stimoli possono essere applicati alla zampa posteriore del topo, consentendo di studiare gli effetti diretti degli stimoli sull'insieme dei neuroni DRG. Il numero di neuroni che producono transitori Ca 2+ e l'ampiezza dei transitori Ca2+ indicano sensibilità a specifiche modalità sensoriali. Il diametro dei neuroni fornisce prove di tipi di fibre attivate (meccano non nocivo vs fibre del dolore nocivo, fibre Aβ, Aδ e C). I neuroni che esprimono recettori specifici possono essere geneticamente marcati con td-Tomato e specifiche ricombinasi Cre insieme a Pirt-GCaMP. Pertanto, l'imaging Pirt-GCaMP3 Ca2+ di DRG fornisce un potente strumento e modello per l'analisi di specifiche modalità sensoriali e sottotipi di neuroni che agiscono come un insieme a livello di popolazione per studiare dolore, prurito, tatto e altri segnali somatosensoriali.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figura 4: Immagini rappresentative dei gangli della radice dorsale L5 dei topi Pirt-GCaMP3. (A,D) Vengono mostrate scansioni ad alta risoluzione a fotogramma singolo dei gangli della radice dorsale L5 dei topi Pirt-GCaMP3. (B,E) . Proiezioni di intensità media di 15 fotogrammi di gangli Pirt-GCaMP3...

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In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca2+ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Il numero di neuroni monitorati utilizzando questo metodo consente la raccolta di dati di rete neuronale che sarebbero impossibili utilizzando metodi più vecchi o altri. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di monitorare quasi 2.000 neuroni sensoriali primari contemporaneamente, rispondendo direttamente agli stimoli applicati alla zampa posteriore. Questa procedura è particolarmente adatta allo studio di interventi terapeutici per l'allodinia periferica e l'ipersensibilità al dolore.Questo metodo può essere adattato allo studio dei gangli trigeminali o genicolati o utilizzato con sensori geneticamente codificati per molecole di segnalazione di tensione o cellule, come l'AMP ciclico. Ci vuole pratica per eseguire questo intervento chirurgico. Puoi esercitarti su un massimo di sei gangli della radice dorsale su un singolo animale.A dimostrare la procedura sarò io, con l'assistenza di John Shannonhouse e Mr.Ruben Gomez. Per iniziare, posizionare il mouse su un pad riscaldato per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius. Individuare l'allargamento lombare sentendo l'osso pelvico del topo.Quindi, radere il dorso del mouse sopra l'area di allargamento lombare. Usando le forbici, fai un'incisione rettangolare su tre lati sopra l'allargamento lombare e piega la pelle con una pinza. Utilizzare le forbici da dissezione a molla da 13 millimetri per fare incisioni da tre a quattro millimetri sul lato destro della colonna vertebrale.Usa le forbici per tagliare la pelle e i muscoli ai lati per esporre la colonna vertebrale. Quindi, usando forbici da otto millimetri, tagliare via il muscolo e il tessuto connettivo per pulire il processo trasversale del lato destro L5 DRG. Cerca di ridurre al minimo il sanguinamento usando cotone o Gelfoam per assorbire il sangue.Tagliare il processo trasversale L5 sul lato destro utilizzando rongeur di Friedman-Pearson o forti pinze sottili, facendo attenzione a non toccare il DRG. Quindi, sposta il mouse e il termoforo sul palco personalizzato. Utilizzare nastro adesivo per fissare l'animale e la piastra elettrica in posizione.Posizionare il naso dell'animale nel cono del naso per l'anestesia continua con isoflurano. Fissare la zampa posteriore destra che sporge in una posizione fuori dal palco per una facile applicazione degli stimoli. Fissare la colonna vertebrale in posizione con i morsetti dello stadio sulla pelle sulle vertebre o l'osso pelvico appena rostrale e caudale al DRG L5.Regolare i morsetti e il palco per rendere la superficie del DRG il più livellata possibile. Quindi, posizionare lo stadio sotto il microscopio in modo che l'obiettivo sia direttamente otto millimetri sopra il DRG quando viene abbassato. Inserire il termometro rettale.Collegare le linee elettriche alla piastra riscaldante e al termometro rettale. Collegare il cono del naso alle tubazioni del gas isoflurano. Utilizzare un microscopio confocale verticale con un obiettivo 10x 0,4 DIC e il software associato per l'imaging.Utilizzare le impostazioni del filtro FITC verde di eccitazione a 495 nanometri, emissione a 519 nanometri e lunghezza d'onda di rilevamento tra 500 e 580 nanometri. Sotto il microscopio, trova la superficie del DRG. Regolare i morsetti sullo stage in modo che la superficie DRG sia il più livellata possibile e la superficie massima venga visualizzata sul piano focale.Monitorare l'animale durante tutta la procedura per mantenere l'anestesia isoflurana senza sovradosaggio. Per caricare il protocollo di scansione rapida del microscopio, utilizzare le impostazioni tipiche di dimensioni voxel 2,496 per 2,496 per 16 micron, 512 per 512 pixel, 10 fette ottiche Z-stack, un'unità Airy per 32 micrometri, 1% potenza laser di 488 nanometri e cinque milliwatt, tempo pixel 1,52 microsecondi, tempo di linea 0,91 millisecondi, tempo di fotogramma 465 millisecondi, velocità di scansione LSM di otto, scansione bidirezionale, guadagno rilevatore PMT 650 volt e guadagno digitale di uno. Fai una breve scansione di otto cicli del DRG facendo clic su Avvia esperimento nella scheda Acquisizione.Crea un filmato eseguendo una proiezione ortogonale delle scansioni a una scansione per fotogramma nel tempo. Controlla manualmente la chiarezza dell'immagine e gli artefatti dell'immagine, come le onde di luminosità che attraversano il DRG. Regolare la posizione del morsetto e lo spessore della sezione ottica e ripetere questo passaggio fino a ottenere un filmato chiaro e di alta qualità.Quindi, caricare il protocollo di scansione ad alta risoluzione del microscopio utilizzando le impostazioni tipiche di dimensioni voxel 1.248 per 1.248 per 14 micron, 1024 per 1024 pixel, sei fette ottiche Z-stack, 1.2 unità Airy o 39 micrometri, 5% potenza laser di 488 nanometri e 25 milliwatt, tempo pixel 2.06 microsecondi, tempo di linea 4.95 millisecondi, tempo di fotogramma 5.06 secondi, velocità di scansione LSM di sei, scansione bidirezionale, guadagno del rilevatore PMT a 650 volt e guadagno digitale di uno. Fare clic sul pulsante Avvia esperimento nella scheda Acquisizione per creare un'immagine ad alta risoluzione del DRG. Caricare il protocollo di scansione rapida del microscopio e registrare l'attività spontanea nel DRG per 80 cicli.Generare un filmato di proiezione ortogonale e verificare che l'immagine sia di qualità sufficiente per l'analisi. Per applicare stimoli, impostare il microscopio per eseguire da 15 a 20 scansioni. Attendere il completamento delle scansioni da uno a cinque per produrre la linea di base.Applicare lo stimolo durante le scansioni da sei a 10. Attendere almeno cinque minuti dopo ogni stimolo prima di applicare quello successivo per prevenire la desensibilizzazione. Per una pressa meccanica, tenere il pincher dell'algometro con la zampa tra le pale senza toccare la zampa.Pizzicare la zampa iniziando immediatamente dopo la fine della scansione cinque e fermandosi immediatamente dopo la scansione 10. Monitorare la forza di pressatura con un algometro e assicurarsi che non superi i 10 g oltre la forza desiderata. Per gli stimoli termici, riscaldare un becher d'acqua appena sopra la temperatura desiderata.Quando l'acqua è alla temperatura corretta, applicare lo stimolo immediatamente dopo la scansione cinque immergendo la zampa nell'acqua. Tirare via il becher immediatamente dopo la scansione 10. L'esposizione chirurgica a L5 DRG seguita da microscopia confocale ha permesso di visualizzare fino a 1.800 neuroni contemporaneamente utilizzando topi Pirt-GCaMP3.I neuroni sensoriali primari sono stati osservati in un ensemble a livello di popolazione per transitori spontanei di calcio in assenza di stimoli e in risposta a stimoli nel loro normale contesto fisiologico. Forti stimoli o calore nocivo hanno aumentato le risposte del calcio. Rispetto alla pressatura con 100 g, la pressione con 300 g ha aumentato il numero di neuroni che producono transitori di calcio e l'area delta F di F0 sotto la curva.Il calore caldo in un intervallo di temperatura non nocivo di 21 e 45 gradi Celsius ha aumentato il numero di neuroni che producono transitori di calcio e l'area delta F di F0 sotto la curva. Le temperature non nocive hanno attivato un numero minore di neuroni che producono transitori rispetto a uno stimolo termico nocivo a 57 gradi Celsius. Inoltre, i neuroni di diametro più piccolo e medio producevano calcio transitorio spontaneamente e sotto tutti gli stimoli, ma i neuroni di diametro maggiore producevano solo transitori di calcio in risposta allo stimolo pressante di 300 g.Il DRG deve essere livellato e lo spessore ottimale della fetta ottica. Dovrebbe essere tale da poter rilevare il numero massimo di celle e non c'è ondulazione nel film. Questa tecnica è stata utilizzata per analizzare le modalità sensoriali a livello di popolazione per la somatosensazione e il gusto e per studiare i neuroni adiacenti che si attivano in coppia o in cluster sincronizzati che contribuiscono al dolore cronico e neuropatico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Ricerca

Neuroscienze

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