Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所の助成金R01DE026677およびR01DE031477(Y.S.K.)、UTHSCSA startup fund(Y.S.K.)、およびテキサス大学システム(Y.S.K.)からのライジングスター賞によってサポートされました。

ここに記載されているすべての手順は、サンアントニオのテキサス大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実行されました。
注意: 開始したら、動物の手術(ステップ1)とイメージング(ステップ2)を継続的に完了する必要があります。データ解析(ステップ3)は、後で行ってもよい。
1.手術と?...

<ol>
	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

持続的な痛みはさまざまな障害に存在し、約8%の人々の生活の質を衰弱および/または低下させます29。一次感覚ニューロンは皮膚の有害な刺激を検出し、その可塑性は持続的な痛みに寄与します8。ニューロンは細胞培養や外植片で研究することができますが、そうすることで通常の生理学的状況からニューロンが取り除かれます。DRGの外科的曝露とそれに?...

一次感覚ニューロンは皮膚を直接神経支配し、体性感覚情報を中枢神経系に運び戻します1,2。背根神経節(DRG)は、10,000〜15,000個の一次感覚ニューロンの細胞体クラスターです3,4。DRGニューロンは、多様なサイズ、髄鞘形成レベル、および遺伝子および受容体発現パターンを提示します。より小さい直径のニューロンは、疼痛感知ニューロンを含み、より大きな直径のニューロンは、典型的には、非疼痛の機械的刺激に応答する5、6。傷害、慢性炎症、末梢神経障害などの一次感覚ニューロンの障害は、これらのニューロンをさまざまな刺激に感作し、慢性疼痛、異痛症、および疼痛過敏症に寄与する可能性があります7,8。したがって、DRGニューロンの研究は、一般的な体性感覚と多くの痛みやかゆみの障害の両方を理解する上で重要です。
生体内で発火するニューロンは体性感覚に不可欠であるが、最近まで、生体内で無傷の神経節を研究するためのツールは比較的少数の細胞に限られていた9。ここでは、生体内の集団レベルでニューロンの活動電位または活動をアンサンブルとして研究するための強力な方法について説明します。この方法は、細胞質Ca2+ダイナミクスに基づくイメージングを採用しています。Ca2+高感度蛍光指示薬は、通常は低濃度の細胞質Ca2+のため、細胞活性を測定するための優れたプロキシです。これらの指標は、マウス9、10、11、12、13、14、15、16およびラット17における数百〜数千の一次感覚ニューロンの同時モニタリングを可能にした。この研究に記載されているin vivo Ca2+イメージングの方法は、機械的、低温、熱的、および化学的刺激に対する集団レベルの応答を直接観察するために使用できます。
ホスホイノシチド結合膜タンパク質であるPirtは、ほぼすべての(>95%)一次感覚ニューロン18,19で高レベルで発現しており、Ca2+センサーGCaMP3の発現を駆動して、in vivoでニューロンの活動をモニターするために使用できます20。このプロトコールでは、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM)を用いて、インビボDRG手術、Ca2+画像化、およびPirt−GCaMP3マウス14の右側腰椎5(L5)DRGにおける分析を行うための技術が記載されている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

Ca2+イメージングは、活動電位および細胞質へのCa2+侵入または細胞内Ca2+貯蔵の放出を含む様々なシグナル伝達機構を含む細胞活動の代理として使用することができる。マウスの背根神経節(DRG)の一次感覚ニューロンのPirt-GCaMP3ベースのCa2+イメージングは、多数の細胞を同時に測定できるという利点を提供します。最大1,800個のニューロンをモニターできるため、ニューロンネットワークと体性感覚プロセスを、in vivoの集団レベルで通常の生理学的状況でアンサンブルとして研究できます。監視されるニューロンの数が多いため、他の方法では検出が困難な活動パターンを検出できます。刺激をマウスの後足に適用することができ、DRGニューロンアンサンブルに対する刺激の直接的な影響を研究することができます。Ca2+トランジェントを生成するニューロンの数とCa2+トランジェントの振幅は、特定の感覚様式に対する感受性を示しています。ニューロンの直径は、活性線維の種類(非侵害性メカノ線維と有害な疼痛線維、Aβ、Aδ、およびC線維)の証拠を提供します。特定の受容体を発現するニューロンは、Pirt-GCaMPと一緒にtd-Tomatoおよび特定のCreリコンビナーゼで遺伝的に標識することができます。したがって、DRGのPirt-GCaMP3 Ca2+イメージングは、痛み、かゆみ、触覚、およびその他の体性感覚信号を研究するための集団レベルでアンサンブルとして機能する特定の感覚モダリティおよびニューロンサブタイプの分析のための強力なツールとモデルを提供します。

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> 図4:Pirt-GCaMP3マウスのL5後根神経節の代表的な画像。 (A,D)Pirt-GCaMP3マウスのL5後根神経節の単一フレーム高解像度スキャンが示されている。(B,E).刺激がない場合の、パネルAおよびパネルDからのそれぞれ15フレームのPirt-GCaMP3 L5 D...

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In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

このプロトコルは、後根神経節(DRG)の外科的曝露とそれに続くGCaMP3(遺伝的にコードされたCa2+ インジケーター;緑色蛍光タンパク質-カルモジュリン-M13タンパク質 3)Pirt-GCaMP3マウスを用いて、同側後肢に様々な刺激を加えながら神経細胞集合体をCa2+ イメージングした。

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

この方法を使用して監視されるニューロンの数は、古い方法または他の方法では不可能であろうニューロンネットワークデータの収集を可能にする。この技術の主な利点は、後足に加えられた刺激に直接反応して、一度に約2, 000の一次感覚ニューロンを監視できることです。この手順は、末梢性異痛症および疼痛過敏症の治療的介入の研究に特に適しています。この方法は、三叉神経節または膝状神経節の研究に適合させることができ、またはサイクリックAMPなどの電圧または細胞シグナル伝達分子用の遺伝的にコードされたセンサーとともに使用することができます。この手術を行うには練習が必要です。1匹の動物で最大6つの背側根神経節で練習できます。手順のデモンストレーションは私自身であり、ジョン・シャノンハウスとルーベン・ゴメス氏の支援を受けます。まず、マウスを加熱パッドの上に置いて体温を摂氏37度に維持します。マウスの骨盤骨を感じて腰椎の肥大を見つけます。次に、腰椎肥大の領域より上でマウスの背中を剃ります。ハサミを使用して、腰椎の拡大の上に3面の長方形の切開を行い、鉗子で皮膚を折り畳みます。13ミリメートルのスプリング解剖はさみを使用して、脊椎の右側に3〜4ミリメートルの切開を行います。はさみを使用して皮膚と筋肉を側面に切り戻し、背骨を露出させます。次に、8ミリメートルのはさみを使用して、筋肉と結合組織を切り取り、右側のL5 DRGの横突起をきれいにします。綿またはゲルフォームを使用して血液を吸収することにより、出血を最小限に抑えるようにしてください。DRGに触れないように注意しながら、フリードマン-ピアソンロンジャーまたは強力な細かい鉗子を使用して右側のL5横突起を切り開きます。次に、マウスと加熱パッドをカスタムステージに移動します。ステージテープを使用して、動物と加熱パッドを所定の位置に固定します。動物の鼻をノーズコーンに入れて、イソフルランを継続的に麻酔します。右後足をステージから離れた位置に突き出して固定し、刺激を簡単に適用できるようにします。L5 DRGの吻側と尾側の椎骨または骨盤骨の皮膚にステージクランプで脊椎を所定の位置に固定します。クランプとステージを調整して、DRGの表面をできるだけ水平にします。次に、ステージを顕微鏡の下に置き、対物レンズが下げたときにDRGの真上8ミリメートルになるようにします。直腸体温計を挿入します。電力線を加熱パッドと直腸温度計に接続します。ノーズコーンをイソフルランガスラインに接続します。10x 0.4 DIC対物レンズとイメージング用の関連ソフトウェアを備えた正立共焦点顕微鏡を使用します。495ナノメートルの励起、519ナノメートルの発光、および500〜580ナノメートルの検出波長の緑色のFITCフィルター設定を使用します。顕微鏡下で、DRGの表面を見つけます。ステージのクランプを調整して、DRGサーフェスが可能な限り水平になり、最大表面積が焦点面で視覚化されるようにします。過剰摂取せずにイソフルラン麻酔を維持するために、手順全体を通して動物を監視します。.顕微鏡高速スキャンプロトコルをロードするには、ボクセルサイズ2.496 x 2.496 x 16ミクロン、512 x 512ピクセル、10光学スライスZスタック、32マイクロメートル用の1つのエアリーユニット、488ナノメートルと5ミリワットの1%レーザー出力、ピクセル時間1.52マイクロ秒、ライン時間0.91ミリ秒、フレーム時間465ミリ秒、LSMスキャン速度8、 双方向スキャン、PMT検出器ゲイン650ボルト、デジタルゲイン1。「取得」タブの「実験の開始」をクリックして、DRGの短い8サイクル・スキャンを実行します。時間の経過に伴うフレームごとに 1 回のスキャンでスキャンの直交投影を作成して、ムービーを作成します。画像の鮮明さや、DRGを横切る明るさの波などのイメージングアーティファクトを手動で確認します。クランプ位置と光学セクションの厚さを調整し、クリアで高品質のムービーが得られるまでこの手順を繰り返します。次に、ボクセルサイズ1.248 x 1.248 x 14ミクロン、1024 x 1024ピクセル、6つの光学スライスZスタック、1.2エアリーユニットまたは39マイクロメートル、488ナノメートルおよび25ミリワットの5%レーザー出力、ピクセル時間2.06マイクロ秒、ライン時間4.95ミリ秒、フレーム時間5.06秒、LSMスキャン速度6の典型的な設定を使用して、顕微鏡高解像度スキャンプロトコルをロードします。 双方向スキャン、650ボルトのPMT検出器ゲイン、および1のデジタルゲイン。「取得」タブの下にある「実験の開始」ボタンをクリックして、DRGの高解像度イメージを作成します。顕微鏡ラピッドスキャンプロトコルをロードし、DRGの自発的な活動を80サイクル記録します。直交投影ムービーを生成し、画像が解析に十分な品質であることを確認します。刺激を加えるには、顕微鏡を15〜20スキャンするように設定します。スキャンが 1 から 5 完了するのを待って、ベースラインを生成します。スキャン6〜10の間に刺激を適用します。各刺激の後に少なくとも5分間待ってから、次の刺激を適用して脱感作を防ぎます。機械的なプレスの場合は、足に触れずにパドルの間に足を置いてアルゴメーターのピンチャーを持ちます。スキャン5の終了直後に開始し、スキャン10の直後に停止する足をつまみます。アルゴメーターでプレス力を監視し、希望の力を超えて10gを超えないようにしてください。熱刺激の場合は、ビーカーを希望の温度のすぐ上に加熱します。水が正しい温度になったら、足を水に浸してスキャン5の直後に刺激を加えます。スキャン10の直後にビーカーを引き離します。外科的L5 DRG曝露とそれに続く共焦点顕微鏡検査により、Pirt-GCaMP3マウスを使用して一度に最大1, 800個のニューロンを画像化することができた。一次感覚ニューロンは、刺激がない場合、および通常の生理学的状況で刺激に応答して、自発的なカルシウム過渡現象の集団レベルでアンサンブルで観察されました。強い刺激または有害な熱はカルシウム反応を増加させた。100 gで押す場合と比較して、300 gで押すと、カルシウム過渡現象を生成するニューロンの数が増加し、曲線の下のデルタFによってF0の領域が増加しました。摂氏21度から45度の非有害な温度範囲での温熱は、カルシウム過渡現象を生成するニューロンの数と曲線の下のデルタF×F0領域を増加させました。非有害温度は、摂氏57度の有害な熱刺激と比較して、過渡現象を生成するニューロンの数が少ないことを活性化しました。さらに、小径および中径のニューロンは、すべての刺激下で自発的にカルシウム過渡性を産生したが、大径のニューロンは、300gのプレス刺激に応答してカルシウム過渡性のみを産生した。DRGは、水平で最適な光学スライス厚さである必要があります。セルの最大数を検出でき、ムービーにうねりがないようにする必要があります。この技術は、体性感覚と味覚の集団レベルで感覚モダリティを分析し、慢性および神経因性疼痛に寄与するペアまたは同期クラスターで活性化する隣接するニューロンを研究するために使用されています。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks Video (Video) | JoVE

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans Video (Video) | JoVE

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration Video (Video) | JoVE

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals Video (Video) | JoVE

動物を振る舞う、覚醒中のシングルユニット記録のためにマイクロワイヤの組織化された配列を移植するための手順

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

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無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

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げっ歯類での後根神経節の脊髄および単離の油圧押出

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons Video (Video) | JoVE

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release Video (Video) | JoVE

伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...