Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos National Institutes of Health Grants R01DE026677 e R01DE031477 (para Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) e um Rising STAR Award da University of Texas system (Y.S.K.).

Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio.
NOTA: Uma vez iniciadas, a cirurgia dos animais (etapa 1) e os exames de imagem (etapa 2) devem ser concluídos de forma contínua. A análise dos dados (etapa 3) poderá ser realizada posteriormente.
1. Cirurgia e fixação do animal para ima...

<ol>
	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

A dor persistente está presente em uma ampla gama de distúrbios, debilitando e/ou reduzindo a qualidade de vida de cerca de 8% das pessoas29. Os neurônios sensoriais primários detectam estímulos nocivos na pele, e sua plasticidade contribui para a dor persistente8. Enquanto os neurônios podem ser estudados em cultura celular e explantes, fazê-lo os remove de seu contexto fisiológico normal. A exposição cirúrgica do DRG, seguida de Pirt-GCaMP3 Ca2+, per...

Os neurônios sensoriais primários inervam diretamente a pele e transportam informações somatossensoriais de volta ao sistema nervoso central 1,2. Gânglios da raiz dorsal (DRGs) são aglomerados de corpos celulares de 10.000-15.000 neurônios sensoriais primários 3,4. Os neurônios DRG apresentam diversos tamanhos, níveis de mielinização e padrões de expressão gênica e receptora. Neurônios de menor diâmetro incluem neurônios sensíveis à dor e neurônios de maior diâmetro tipicamente respondem a estímulos mecânicos não dolorosos 5,6. Distúrbios nos neurônios sensoriais primários, como lesão, inflamação crônica e neuropatias periféricas, podem sensibilizar esses neurônios a vários estímulos e contribuir para dor crônica, alodínia e hipersensibilidade à dor 7,8. Portanto, o estudo dos neurônios DRG é importante na compreensão da somatosensação em geral e de muitos transtornos de dor e coceira.
Neurônios disparando in vivo são essenciais para a somatosensação, mas até recentemente, ferramentas para estudar gânglios intactos in vivo eram limitadas a um número relativamente pequeno de células 9. Aqui, descrevemos um método poderoso para estudar os potenciais de ação ou atividades de neurônios em nível populacional in vivo como um conjunto. O método emprega imagens baseadas na dinâmica citoplasmática do Ca2+. Os indicadores fluorescentes sensíveis ao Ca 2+ são bons proxies para medir a atividade celular devido à concentração normalmente baixa de Ca2+ citoplasmático. Esses indicadores têm permitido o monitoramento simultâneo de centenas a vários milhares de neurônios sensoriais primários em camundongos 9,10,11,12,13,14,15,16 e ratos 17. O método de imagem in vivo de Ca2+ descrito neste estudo pode ser usado para observar diretamente as respostas em nível populacional a estímulos mecânicos, frios, térmicos e químicos.
A proteína de membrana ligadora de fosfoinositídeos, Pirt, é expressa em níveis elevados em quase todos (>95%) neurônios sensoriais primários18,19 e pode ser usada para conduzir a expressão do sensor Ca 2+, GCaMP3, para monitorar a atividade dos neurônios in vivo20. Neste protocolo, são descritas técnicas para a realização de cirurgia DRG in vivo, imagem por Ca2+ e análise no DRG lombar 5 (L5) direito de camundongos Pirt-GCaMP314 usando microscopia confocal de varredura a laser (LSM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

A imagem por Ca 2+ pode ser usada como proxy da atividade celular, incluindo potenciais de ação e vários mecanismos de sinalização envolvendo a entrada de Ca 2+ no citoplasma ou a liberação de depósitos intracelulares de Ca2+. A imagem de Ca2+ baseada em Pirt-GCaMP3 de neurônios sensoriais primários do gânglio da raiz dorsal (DRG) em camundongos oferece a vantagem da medição simultânea de um grande número de células. Até 1.800 neurônios podem ser monitorados, permitindo que redes neuronais e processos somatossensoriais sejam estudados como um conjunto em seu contexto fisiológico normal em nível populacional in vivo. O grande número de neurônios monitorados permite a detecção de padrões de atividade que seriam difíceis de detectar usando outros métodos. Os estímulos podem ser aplicados na pata traseira do camundongo, permitindo que os efeitos diretos dos estímulos no conjunto de neurônios DRG sejam estudados. O número de neurônios produzindo transientes de Ca 2+, bem como a amplitude de transientes de Ca2+, indica sensibilidade a modalidades sensoriais específicas. O diâmetro dos neurônios fornece evidências de tipos de fibras ativadas (fibras mecanas não nocivas vs. fibras dolorosas nocivas, fibras Aβ, Aδ e C). Neurônios que expressam receptores específicos podem ser geneticamente marcados com td-Tomato e recombinases específicas de Cre juntamente com Pirt-GCaMP. Portanto, a imagem Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG fornece uma poderosa ferramenta e modelo para a análise de modalidades sensoriais específicas e subtipos de neurônios atuando como um conjunto em nível populacional para estudar dor, coceira, toque e outros sinais somatossensoriais.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figura 4: Imagens representativas dos gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3. (A,D) Imagens de alta resolução de quadro único de gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3 são mostrados. (B,E) . Projeções de intensidade média de 15 quadros dos gânglios do Pirt-GCa...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

O número de neurônios monitorados usando este método permite a coleta de dados da rede de neurônios que seriam impossíveis usando métodos mais antigos ou outros. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de monitorar quase 2.000 neurônios sensoriais primários de uma só vez, respondendo diretamente aos estímulos aplicados à pata traseira. Este procedimento é especialmente adequado para estudar intervenções terapêuticas para alodínia periférica e hipersensibilidade à dor.Este método pode ser adaptado para o estudo de gânglios trigeminais ou geniculados ou usado com sensores codificados geneticamente para moléculas de voltagem ou sinalização celular, como o AMP cíclico. É preciso prática para realizar essa cirurgia. Você pode praticar em até seis gânglios da raiz dorsal em um único animal.Quem demonstrará o procedimento será eu, com a ajuda de John Shannonhouse e do Sr. Ruben Gomez. Para começar, coloque o mouse em uma almofada aquecida para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius. Localize o aumento lombar sentindo o osso pélvico do rato.Em seguida, raspe a parte de trás do mouse acima da área de alargamento lombar. Usando tesoura, faça uma incisão retangular de três lados acima do aumento lombar e dobre a pele com pinças. Use a tesoura de dissecção de mola de 13 milímetros para fazer incisões de três a quatro milímetros no lado direito da coluna.Use tesoura para cortar a pele e os músculos para os lados para expor a coluna. Em seguida, usando tesoura de oito milímetros, corte o músculo e o tecido conjuntivo para limpar o processo transverso do lado direito L5 DRG. Tente minimizar o sangramento usando algodão ou Gelfoam para absorver o sangue.Abra o processo transversal L5 do lado direito usando rongeurs de Friedman-Pearson ou pinças finas fortes, tomando cuidado para não tocar no DRG. Em seguida, mova o mouse e a almofada de aquecimento para o palco personalizado. Use fita adesiva para prender o animal e a almofada de aquecimento no lugar.Colocar o nariz do animal no cone nasal para anestesia contínua com isoflurano. Fixe a pata traseira direita em uma posição fora do palco para facilitar a aplicação dos estímulos. Fixe a coluna no lugar com as pinças de estágio sobre a pele nas vértebras ou o osso pélvico apenas rostral e caudal ao DRG L5.Ajuste as braçadeiras e o palco para tornar a superfície do DRG o mais nivelada possível. Em seguida, coloque o estágio abaixo do microscópio para que a objetiva fique diretamente oito milímetros acima do DRG quando abaixada. Insira o termômetro retal.Conecte as linhas de energia à almofada de aquecimento e ao termômetro retal. Conecte o cone nasal às linhas de gás isoflurano. Use um microscópio confocal vertical com objetiva DIC 10x 0,4 e o software associado para aquisição de imagens.Use as configurações do filtro FITC verde de excitação a 495 nanômetros, emissão a 519 nanômetros e comprimento de onda de detecção entre 500 e 580 nanômetros. Sob o microscópio, encontre a superfície do DRG. Ajuste as braçadeiras no palco para que a superfície DRG fique o mais nivelada possível e a área de superfície máxima seja visualizada no plano focal.Monitorar o animal durante todo o procedimento para manter a anestesia com isoflurano sem sobredosagem. Para carregar o protocolo de varredura rápida do microscópio, use as configurações típicas de tamanho de voxel 2.496 por 2.496 por 16 mícrons, 512 por 512 pixels, 10 fatias ópticas Z-stack, uma unidade Airy para 32 micrômetros, 1% de potência laser de 488 nanômetros e cinco miliwatts, tempo de pixel 1,52 microssegundos, tempo de linha 0,91 milissegundos, tempo de quadro 465 milissegundos, velocidade de varredura LSM de oito, varredura bidirecional, detector de PMT ganho de 650 volts, e ganho digital de um. Faça uma varredura curta de oito ciclos do DRG clicando em Iniciar experimento na guia Aquisição.Crie um filme fazendo uma projeção ortogonal de varreduras em uma varredura por quadro ao longo do tempo. Verifique manualmente a clareza da imagem e os artefatos de imagem, como ondas de brilho cruzando o DRG. Ajuste a posição da braçadeira e a espessura da seção óptica e repita essa etapa até obter uma película clara e de alta qualidade.Em seguida, carregue o protocolo de varredura de alta resolução do microscópio usando as configurações típicas de tamanho de voxel 1,248 por 1,248 por 14 mícrons, 1024 por 1024 pixels, seis fatias ópticas Z-stack, unidade 1,2 Airy ou 39 micrômetros, 5% de potência do laser de 488 nanômetros e 25 miliwatts, tempo de pixel 2,06 microssegundos, tempo de linha 4,95 milissegundos, tempo de quadro 5,06 segundos, velocidade de varredura LSM de seis, varredura bidirecional, ganho do detector de PMT a 650 volts e ganho digital de um. Clique no botão Iniciar experimento na guia Aquisição para criar uma imagem de alta resolução do DRG. Carregue o protocolo de varredura rápida do microscópio e registre a atividade espontânea no DRG por 80 ciclos.Gere um filme de projeção ortogonal e verifique se a imagem é de qualidade suficiente para análise. Para aplicação de estímulos, ajuste o microscópio para realizar de 15 a 20 varreduras. Aguarde a conclusão das varreduras de um a cinco para produzir a linha de base.Aplicar o estímulo durante os exames de seis a 10. Aguarde pelo menos cinco minutos após cada estímulo antes de aplicar o próximo para evitar dessensibilização. Para uma prensa mecânica, segure a pinça do algômetro com a pata entre as pás sem tocar a pata.Aperte a pata começando imediatamente após o final da varredura cinco e parando imediatamente após a varredura 10. Monitore a força de pressão com um algômetro e certifique-se de que ela não exceda 10 g acima da força desejada. Para estímulos térmicos, aqueça um copo de água até um pouco acima da temperatura desejada.Quando a água estiver na temperatura correta, aplique o estímulo imediatamente após a varredura cinco, mergulhando a pata na água. Puxe o copo imediatamente após a varredura 10. A exposição cirúrgica ao DRG L5 seguida de microscopia confocal permitiu que até 1.800 neurônios fossem imageados de uma só vez usando camundongos Pirt-GCaMP3.Neurônios sensoriais primários foram observados em um conjunto em nível populacional para transitórios espontâneos de cálcio na ausência de estímulos e em resposta a estímulos em seu contexto fisiológico normal. Estímulos fortes ou calor nocivo aumentaram as respostas de cálcio. Em comparação com a prensagem com 100 g, a prensagem com 300 g aumentou o número de neurônios produtores de transientes de cálcio e a área delta F por F0 sob a curva.O calor quente em uma faixa de temperatura não nociva de 21 e 45 graus Celsius aumentou o número de neurônios produzindo transientes de cálcio e a área delta F por F0 sob a curva. Temperaturas não nocivas ativaram um número menor de neurônios produzindo transientes em comparação com um estímulo térmico nocivo a 57 graus Celsius. Além disso, neurônios de diâmetro menor e médio produziram transientes de cálcio espontaneamente e sob todos os estímulos, mas neurônios de maior diâmetro só produziram transientes de cálcio em resposta ao estímulo de pressão de 300 g.O DRG deve ser nivelado e de espessura de corte óptico ideal. Deve ser tal que você possa detectar o número máximo de células e não há oscilação no filme. Esta técnica tem sido utilizada para analisar modalidades sensoriais em nível populacional para somatosensação e paladar e para estudar neurônios adjacentes ativados em pares ou em agrupamentos sincronizados que contribuem para a dor crônica e neuropática.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks Video (Video) | JoVE

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Neurociência

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans Video (Video) | JoVE

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration Video (Video) | JoVE

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals Video (Video) | JoVE

Um Procedimento para Implantação de Arrays organizado de microfios para gravações a única unidade em Awake, comportando-se Animais

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb Video (Video) | JoVE

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents Video (Video) | JoVE

Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons Video (Video) | JoVE

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release Video (Video) | JoVE

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...