Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01DE026677 y R01DE031477 de los Institutos Nacionales de Salud (a Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) y un premio Rising STAR del sistema de la Universidad de Texas (YSK).

Todos los procedimientos descritos aquí se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio.
NOTA: Una vez iniciada, la cirugía con animales (paso 1) y las imágenes (paso 2) deben completarse de manera continua. El análisis de datos (paso 3) se puede realizar más adelante.
1. Cirugía y fijación del animal para la imagen L...

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	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

El dolor persistente está presente en una amplia gama de trastornos, debilitando y/o reduciendo la calidad de vida de aproximadamente 8% de las personas29. Las neuronas sensoriales primarias detectan estímulos nocivos en la piel, y su plasticidad contribuye al dolor persistente8. Si bien las neuronas se pueden estudiar en cultivo celular y explantes, al hacerlo las elimina de su contexto fisiológico normal. La exposición quirúrgica del DRG, seguida de imágenes Pirt-GC...

Las neuronas sensoriales primarias inervan directamente la piel y llevan la información somatosensorial de vuelta al sistema nervioso central 1,2. Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) son grupos de células corporales de 10.000-15.000 neuronas sensoriales primarias 3,4. Las neuronas DRG presentan diversos tamaños, niveles de mielinización y patrones de expresión de genes y receptores. Las neuronas de diámetro más pequeño incluyen neuronas sensibles al dolor y las neuronas de mayor diámetro típicamente responden a estímulos mecánicos no dolorosos 5,6. Los trastornos en las neuronas sensoriales primarias, como lesiones, inflamación crónica y neuropatías periféricas, pueden sensibilizar estas neuronas a diversos estímulos y contribuir al dolor crónico, alodinia e hipersensibilidad al dolor 7,8. Por lo tanto, el estudio de las neuronas DRG es importante para comprender tanto la somatosensación en general como muchos trastornos de dolor y picazón.
Las neuronas que disparan in vivo son esenciales para la somatosensación, pero hasta hace poco, las herramientas para estudiar los ganglios intactos in vivo se han limitado a un número relativamente pequeño de células 9. Aquí, describimos un método poderoso para estudiar los potenciales de acción o actividades de las neuronas a nivel de población in vivo como un conjunto. El método emplea imágenes basadas en la dinámica citoplasmática de Ca2+. Los indicadores fluorescentes sensibles al Ca 2+ son buenos indicadores para medir la actividad celular debido a la concentración normalmente baja de Ca2+ citoplasmático. Estos indicadores han permitido el monitoreo simultáneo de cientos a varios miles de neuronas sensoriales primarias en ratones 9,10,11,12,13,14,15,16 y ratas 17. El método de imágenes de Ca2+ in vivo descrito en este estudio se puede utilizar para observar directamente las respuestas a nivel poblacional a estímulos mecánicos, fríos, térmicos y químicos.
La proteína de membrana de unión a fosfoinositida, Pirt se expresa en altos niveles en casi todas (>95%) neuronas sensoriales primarias18,19 y se puede utilizar para impulsar la expresión del sensor Ca 2+, GCaMP3, para monitorear la actividad neuronal in vivo20. En este protocolo, se describen técnicas para realizar cirugía DRG in vivo, imágenes de Ca2+ y análisis en el lado derecho lumbar 5 (L5) DRG de ratones Pirt-GCaMP314 utilizando microscopía de barrido láser confocal (LSM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

Las imágenes de Ca 2+ se pueden utilizar como un proxy de la actividad celular, incluidos los potenciales de acción y varios mecanismos de señalización que implican la entrada de Ca 2+ en el citoplasma o la liberación de reservas intracelulares de Ca2+. Las imágenes de Ca2+ basadas en Pirt-GCaMP3 de neuronas sensoriales primarias del ganglio de la raíz dorsal (DRG) en ratones ofrecen la ventaja de la medición simultánea de un gran número de células. Se pueden monitorizar hasta 1.800 neuronas, lo que permite estudiar redes neuronales y procesos somatosensoriales como un conjunto en su contexto fisiológico normal a nivel poblacional in vivo. El gran número de neuronas monitoreadas permite la detección de patrones de actividad que serían difíciles de detectar utilizando otros métodos. Los estímulos se pueden aplicar a la pata trasera del ratón, lo que permite estudiar los efectos directos de los estímulos en el conjunto de neuronas DRG. El número de neuronas que producen transitorios de Ca 2+, así como la amplitud de los transitorios de Ca2+ indica sensibilidad a modalidades sensoriales específicas. El diámetro de las neuronas proporciona evidencia de tipos de fibras activadas (mecanos no nocivos vs. fibras nocivas del dolor, fibras Aβ, Aδ y C). Las neuronas que expresan receptores específicos pueden ser marcadas genéticamente con td-Tomato y Cre específicas recombinasas junto con Pirt-GCaMP. Por lo tanto, las imágenes Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG proporcionan una poderosa herramienta y modelo para el análisis de modalidades sensoriales específicas y subtipos de neuronas que actúan como un conjunto a nivel poblacional para estudiar el dolor, la picazón, el tacto y otras señales somatosensoriales.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes representativas de los ganglios de la raíz dorsal L5 de ratones Pirt-GCaMP3. (A,D) Se muestran escaneos de alta resolución de fotograma único de los ganglios de la raíz dorsal L5 de ratones Pirt-GCaMP3. (B,E) . Proyecciones de intensidad media de 15 fotogramas de ganglios Pir...

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In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

El número de neuronas monitoreadas usando este método permite la recopilación de datos de la red neuronal que sería imposible usando métodos más antiguos u otros. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de monitorear casi 2, 000 neuronas sensoriales primarias a la vez, respondiendo directamente a los estímulos aplicados a la pata trasera. Este procedimiento es especialmente adecuado para estudiar intervenciones terapéuticas para la alodinia periférica y la hipersensibilidad al dolor.Este método puede adaptarse para estudiar los ganglios trigéminos o geniculados o usarse con sensores codificados genéticamente para moléculas de voltaje o señalización celular, como el AMP cíclico. Se necesita práctica para realizar esta cirugía. Puedes practicar en hasta seis ganglios de la raíz dorsal en un solo animal.Demostraré el procedimiento seré yo, con la asistencia de John Shannonhouse y el Sr. Rubén Gómez. Para comenzar, coloque el mouse en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 grados centígrados. Localiza el agrandamiento lumbar palpando el hueso pélvico del ratón.Luego, afeite la parte posterior del mouse por encima del área de agrandamiento lumbar. Con unas tijeras, haga una incisión rectangular de tres lados por encima del agrandamiento lumbar y doble la piel con fórceps. Use las tijeras de disección de resorte de 13 milímetros para hacer incisiones de tres a cuatro milímetros en el lado derecho de la columna vertebral.Use tijeras para cortar la piel y los músculos a los lados para exponer la columna vertebral. Luego, usando tijeras de ocho milímetros, corte el músculo y el tejido conectivo para limpiar el proceso transversal del lado derecho L5 DRG. Trate de minimizar el sangrado usando algodón o espuma de gel para absorber la sangre.Corte el proceso transversal L5 del lado derecho utilizando rongeurs de Friedman-Pearson o pinzas finas fuertes, teniendo cuidado de no tocar el DRG. A continuación, mueva el mouse y la almohadilla térmica a la etapa personalizada. Use cinta adhesiva para asegurar al animal y la almohadilla térmica en su lugar.Coloque la nariz del animal en el cono de la nariz para la anestesia continua con isoflurano. Asegure la pata trasera derecha sobresaliendo a una posición fuera del escenario para facilitar la aplicación de los estímulos. Asegure la columna vertebral en su lugar con las pinzas de la etapa sobre la piel de las vértebras o el hueso pélvico justo rostral y caudal hasta el DRG L5.Ajuste las abrazaderas y la plataforma para que la superficie del DRG esté lo más nivelada posible. Luego, coloque la etapa debajo del microscopio para que el objetivo esté directamente ocho milímetros por encima del DRG cuando se baje. Inserte el termómetro rectal.Conecte las líneas eléctricas a la almohadilla térmica y al termómetro rectal. Conecte el cono de la nariz a las líneas de gas isoflurano. Utilice un microscopio confocal vertical con un objetivo DIC de 10x 0,4 y el software asociado para la obtención de imágenes.Utilice la configuración del filtro verde FITC de excitación a 495 nanómetros, emisión a 519 nanómetros y longitud de onda de detección entre 500 y 580 nanómetros. Bajo el microscopio, encuentre la superficie del DRG. Ajuste las abrazaderas en el escenario para que la superficie DRG esté lo más nivelada posible y el área de superficie máxima se visualice en el plano focal.Controle al animal durante todo el procedimiento para mantener la anestesia con isoflurano sin sobredosis. Para cargar el protocolo de escaneo rápido del microscopio, use la configuración típica de tamaño de vóxel 2.496 por 2.496 por 16 micras, 512 por 512 píxeles, 10 pila Z de corte óptico, una unidad Airy para 32 micrómetros, 1% de potencia láser de 488 nanómetros y cinco milivatios, tiempo de píxeles 1.52 microsegundos, tiempo de línea 0.91 milisegundos, tiempo de cuadro 465 milisegundos, velocidad de escaneo LSM de ocho, escaneo bidireccional, ganancia del detector PMT de 650 voltios y ganancia digital de uno. Realice un breve escaneo de ocho ciclos del DRG haciendo clic en Iniciar experimento en la pestaña Adquisición.Cree una película haciendo una proyección ortogonal de escaneos a un escaneo por fotograma a lo largo del tiempo. Compruebe manualmente la claridad de la imagen y los artefactos de imagen, como las ondas de brillo que cruzan el DRG. Ajuste la posición de la abrazadera y el grosor de la sección óptica, y repita este paso hasta que se logre una película clara y de alta calidad.Luego, cargue el protocolo de escaneo de alta resolución del microscopio utilizando la configuración típica de tamaño de vóxel 1.248 por 1.248 por 14 micras, 1024 por 1024 píxeles, seis pilas Z de corte óptico, unidad Airy de 1.2 o 39 micrómetros, 5% de potencia láser de 488 nanómetros y 25 milivatios, tiempo de píxeles 2.06 microsegundos, tiempo de línea 4.95 milisegundos, tiempo de fotogramas 5.06 segundos, velocidad de escaneo LSM de seis, escaneo bidireccional, ganancia del detector PMT a 650 voltios y ganancia digital de uno. Haga clic en el botón Iniciar experimento en la pestaña Adquisición para crear una imagen de alta resolución del DRG. Cargue el protocolo de escaneo rápido del microscopio y registre la actividad espontánea en el DRG durante 80 ciclos.Genere una película de proyección ortogonal y verifique que la imagen sea de calidad suficiente para el análisis. Para aplicar estímulos, configure el microscopio para realizar de 15 a 20 exploraciones. Espere a que se completen los escaneos del uno al cinco para producir la línea de base.Aplique el estímulo durante las exploraciones de seis a 10. Espere al menos cinco minutos después de cada estímulo antes de aplicar el siguiente para evitar la desensibilización. Para una prensa mecánica, sostenga la pinza del algometro con la pata entre las paletas sin tocar la pata.Pellizque la pata comenzando inmediatamente después del final de la exploración cinco y deteniéndose inmediatamente después de la exploración 10. Controle la fuerza de prensa con un algometro y asegúrese de que no exceda los 10 g por encima de la fuerza deseada. Para estímulos térmicos, caliente un vaso de precipitados de agua justo por encima de la temperatura deseada.Cuando el agua esté a la temperatura correcta, aplique el estímulo inmediatamente después del escaneo cinco sumergiendo la pata en el agua. Tire del vaso de precipitados inmediatamente después de escanear 10. La exposición quirúrgica a L5 DRG seguida de microscopía confocal permitió obtener imágenes de hasta 1.800 neuronas a la vez utilizando ratones Pirt-GCaMP3.Las neuronas sensoriales primarias se observaron en un conjunto a nivel poblacional para transitorios espontáneos de calcio en ausencia de estímulos y en respuesta a estímulos en su contexto fisiológico normal. Los estímulos fuertes o el calor nocivo aumentaron las respuestas de calcio. En comparación con el prensado con 100 g, el prensado con 300 g aumentó el número de neuronas que producen transitorios de calcio y el área delta F por F0 bajo la curva.El calor cálido en un rango de temperatura no nociva de 21 y 45 grados centígrados aumentó el número de neuronas que producen transitorios de calcio y el área delta F por F0 debajo de la curva. Las temperaturas no nocivas activaron un número menor de neuronas que producen transitorios en comparación con un estímulo de calor nocivo a 57 grados centígrados. Además, las neuronas de diámetro más pequeño y mediano produjeron calcio transitorio espontáneamente y bajo todos los estímulos, pero las neuronas de mayor diámetro solo produjeron transitorios de calcio en respuesta al estímulo de presión de 300 g.El DRG debe estar nivelado y tener un grosor de corte óptico óptimo. Debe ser tal que pueda detectar el número máximo de celdas y no haya ondulación en la película. Esta técnica se ha utilizado para analizar modalidades sensoriales a nivel poblacional para la somatosensación y el gusto y para estudiar neuronas adyacentes que se activan en pares o en grupos sincronizados que contribuyen al dolor crónico y neuropático.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks (Video) | JoVE 

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans Video (Video) | JoVE

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration Video (Video) | JoVE

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

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Un procedimiento para la implantación de matrices Organizados de Microhilos para grabaciones de una sola unidad en Awake, Comportarse Animales

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb Video (Video) | JoVE

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

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Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

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Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

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Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

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Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

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En proyección de imagen del calcio Vivo de las células de pelo de la línea Lateral en el pez cebra larvas

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...