Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R01DE026677 och R01DE031477 (till Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) och en Rising STAR Award från University of Texas system (Y.S.K.).

Alla procedurer som beskrivs här utfördes i enlighet med ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Texas Health Science Center i San Antonio.
OBS: När djurkirurgi (steg 1) och bilddiagnostik (steg 2) har påbörjats måste de slutföras kontinuerligt. Dataanalys (steg 3) kan utföras senare.
1. Kirurgi och säkring av djuret för höger sida L5 DRG-avbildning
OBS: Både ...

<ol>
	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

Ihållande smärta är närvarande i ett brett spektrum av störningar, försvagande och / eller minskar livskvaliteten för cirka 8% av människor29. Primära sensoriska neuroner upptäcker skadliga stimuli på huden, och deras plasticitet bidrar till ihållande smärta8. Medan neuroner kan studeras i cellodling och explantat, tar det bort dem från deras normala fysiologiska sammanhang. Kirurgisk exponering av DRG, följt av Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning, möjlig...

Primära sensoriska neuroner innerverar huden direkt och bär somatosensorisk information tillbaka till centrala nervsystemet 1,2. Dorsala rotganglier (DRG) är cellkroppskluster av 10 000-15 000 primära sensoriska neuroner 3,4. DRG-neuroner presenterar olika storlek, myeliniseringsnivåer och gen- och receptoruttrycksmönster. Neuroner med mindre diameter inkluderar smärtavkännande neuroner och neuroner med större diameter svarar vanligtvis på icke-smärtsamma mekaniska stimuli 5,6. Störningar i de primära sensoriska neuronerna som skada, kronisk inflammation och perifera neuropatier kan sensibilisera dessa neuroner för olika stimuli och bidra till kronisk smärta, allodyni och smärtöverkänslighet 7,8. Därför är studien av DRG-neuroner viktig för att förstå både somatosensation i allmänhet och många smärt- och klådastörningar.
Neuroner som skjuter in vivo är viktiga för somatosensation, men tills nyligen har verktyg för att studera intakta ganglier in vivo varit begränsade till relativt litet antal celler9. Här beskriver vi en kraftfull metod för att studera nervcellers aktionspotentialer eller aktiviteter på populationsnivå in vivo som ensemble. Metoden använder avbildning baserad på cytoplasmatisk Ca2+ dynamik. De känsliga fluorescerande indikatorerna Ca 2+ är bra proxyvariabler för att mäta cellulär aktivitet på grund av den normalt låga koncentrationen av cytoplasmatisk Ca2+. Dessa indikatorer har möjliggjort samtidig övervakning av hundratals till flera tusen primära sensoriska neuroner hos möss 9,10,11,12,13,14,15,16 och råttor 17. Metoden för in vivo Ca2+ avbildning som beskrivs i denna studie kan användas för att direkt observera svar på populationsnivå på mekaniska, kalla, termiska och kemiska stimuli.
Det fosfoinositidbindande membranproteinet Pirt uttrycks i höga nivåer i nästan alla (>95%) primära sensoriska neuroner18,19 och kan användas för att driva uttrycket av Ca 2+ sensorn, GCaMP3, för att övervaka neuronaktivitet in vivo20. I detta protokoll beskrivs tekniker för att utföra in vivo DRG-kirurgi, Ca2+ avbildning och analys i höger sida ländrygg 5 (L5) DRG av Pirt-GCaMP3-möss14 med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi (LSM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

Ca 2+ avbildning kan användas som en proxy för cellulär aktivitet, inklusive åtgärdspotentialer och olika signalmekanismer som involverar Ca 2+ inträde i cytoplasman eller frisättning av intracellulära Ca 2+ butiker. Pirt-GCaMP3-baserad Ca2+ avbildning av primära sensoriska neuroner i dorsalrotganglion (DRG) hos möss erbjuder fördelen med samtidig mätning av ett stort antal celler. Upp till 1 800 neuroner kan övervakas, vilket gör att neuronala nätverk och somatosensoriska processer kan studeras som en ensemble i deras normala fysiologiska sammanhang på populationsnivå in vivo. Det stora antalet neuroner som övervakas möjliggör detektering av aktivitetsmönster som skulle vara utmanande att upptäcka med andra metoder. Stimuli kan appliceras på musens bakpot, vilket gör att de direkta effekterna av stimuli på DRG-neuronensemblen kan studeras. Antalet neuroner som producerar Ca 2+ transienter samt amplituden för Ca2+ transienter indikerar känslighet för specifika sensoriska modaliteter. Diametern hos neuroner ger bevis på aktiverade fibertyper (icke-skadliga mechano vs. skadliga smärtfibrer, Aβ, Aδ och C-fibrer). Neuroner som uttrycker specifika receptorer kan märkas genetiskt med td-tomat och specifika Cre-rekombinaser tillsammans med Pirt-GCaMP. Därför ger Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning av DRG ett kraftfullt verktyg och modell för analys av specifika sensoriska modaliteter och neuronsubtyper som fungerar som en ensemble på populationsnivå för att studera smärta, klåda, beröring och andra somatosensoriska signaler.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figur 4: Representativa bilder av L5 dorsalrotsganglier hos Pirt-GCaMP3-möss. (A,D) Högupplösta skanningar med en bildruta av L5-dorsalrotsganglierna hos Pirt-GCaMP3-möss visas. (B,E) . Genomsnittliga intensitetsprojektioner av 15 ramar av Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglier från panel A respektive pan...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

Detta protokoll beskriver den kirurgiska exponeringen av dorsalrotganglion (DRG) följt av GCaMP3 (genetiskt kodad Ca2+ indikator; Grönt fluorescerande protein-kalmodulin-M13-protein 3) Ca2+ avbildning av neuronensemblerna med hjälp av Pirt-GCaMP3-möss samtidigt som man applicerar en mängd olika stimuli på den ipsilaterala baktassen.

In vivo Kalciumavbildning av neuronala ensembler i nätverk av primära sensoriska neuroner i intakta dorsala rotganglier

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Antalet neuroner som övervakas med denna metod möjliggör insamling av neuronnätverksdata som skulle vara omöjliga med äldre eller andra metoder. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att övervaka nästan 2 000 primära sensoriska neuroner samtidigt, som svarar direkt på stimuli applicerade på bakpoten. Denna procedur är särskilt väl lämpad för att studera terapeutiska ingrepp för perifer allodyni och smärtöverkänslighet.Denna metod kan anpassas för att studera trigeminus- eller geniculate ganglier eller användas med genetiskt kodade sensorer för spännings- eller cellsignalmolekyler, såsom cykliskt AMP. Det krävs övning för att utföra denna operation. Du kan träna på upp till sex dorsala rotganglier på ett enda djur.Att demonstrera proceduren kommer att vara jag själv, med hjälp av John Shannonhouse och Mr.Ruben Gomez. För att börja, placera musen på en uppvärmd dyna för att hålla kroppstemperaturen vid 37 grader Celsius. Lokalisera ländryggsförstoringen genom att känna musens bäckenben.Raka sedan musens baksida ovanför området för ländryggsförstoring. Använd sax, gör ett tresidigt rektangulärt snitt ovanför ländryggsförstoringen och vik bort huden med pincett. Använd 13-millimeter fjäderdissektionssaxen för att göra tre till fyra millimeter snitt på höger sida av ryggraden.Använd sax för att skära tillbaka huden och musklerna till sidorna för att exponera ryggraden. Skär sedan bort muskeln och bindväven med åtta millimeter sax för att rengöra den tvärgående processen på höger sida L5 DRG. Försök att minimera blödning genom att använda bomull eller Gelfoam för att absorbera blodet.Skär upp höger sida L5 tvärgående process med Friedman-Pearson rongeurs eller starka fina pincett, var försiktig så att du inte rör DRG. Flytta sedan musen och värmedynan till det anpassade scenen. Använd scentejp för att säkra djuret och värmedynan på plats.Placera djurets nos i noskonen för kontinuerlig isofluranbedövning. Säkra den högra bakpoten som sticker ut till en position utanför scenen för enkel applicering av stimuli. Säkra ryggraden på plats med scenklämmorna över huden på ryggkotorna eller bäckenbenet bara rostral och caudal till L5 DRG.Justera klämmorna och scenen för att göra ytan på DRG så jämn som möjligt. Placera sedan scenen under mikroskopet så att målet är direkt åtta millimeter över DRG när det sänks. Sätt i rektaltermometern.Anslut kraftledningarna till värmedynan och rektaltermometern. Anslut noskon till isoflurangasledningarna. Använd ett upprätt konfokalmikroskop med ett 10x 0,4 DIC-mål och tillhörande programvara för avbildning.Använd de gröna FITC-filterinställningarna för excitation vid 495 nanometer, emission vid 519 nanometer och detekteringsvåglängd mellan 500 och 580 nanometer. Under mikroskopet, hitta ytan på DRG. Justera klämmorna på scenen så att DRG-ytan är så jämn som möjligt och den maximala ytan visualiseras i fokalplanet.Övervaka djuret under hela proceduren för att upprätthålla isofluranbedövning utan överdosering. För att ladda mikroskopets snabbskanningsprotokoll, använd de typiska inställningarna för voxelstorlek 2,496 med 2,496 med 16 mikron, 512 med 512 pixlar, 10 optisk skiva Z-stack, en luftig enhet för 32 mikrometer, 1% lasereffekt på 488 nanometer och fem milliwatt, pixeltid 1,52 mikrosekunder, linjetid 0,91 millisekunder, bildtid 465 millisekunder, LSM-skanningshastighet på åtta, dubbelriktad skanning, PMT-detektorförstärkning 650 volt och digital förstärkning av en. Ta en kort genomsökning av DRG med åtta cykler genom att klicka på Starta experiment under fliken Förvärv.Skapa en film genom att göra en ortogonal projektion av skanningar med en skanning per bildruta över tid. Kontrollera manuellt om bilden är klar och avbildningsartefakter, till exempel vågor av ljusstyrka som passerar DRG. Justera klämpositionen och den optiska sektionstjockleken och upprepa detta steg tills en klar film av hög kvalitet uppnås.Ladda sedan mikroskopets högupplösta skanningsprotokoll med de typiska inställningarna för voxelstorlek 1.248 med 1.248 med 14 mikron, 1024 med 1024 pixlar, sex optiska skivor Z-stack, 1.2 Airy-enhet eller 39 mikrometer, 5% lasereffekt på 488 nanometer och 25 milliwatt, pixeltid 2.06 mikrosekunder, linjetid 4.95 millisekunder, bildtid 5.06 sekunder, LSM-skanningshastighet på sex, dubbelriktad skanning, PMT-detektorförstärkning vid 650 volt och digital förstärkning av en. Klicka på knappen Starta experiment under fliken Förvärv för att skapa en högupplöst bild av DRG. Ladda mikroskopets snabbskanningsprotokoll och registrera spontan aktivitet i DRG i 80 cykler.Generera en ortogonal projektionsfilm och kontrollera att bilden är av tillräcklig kvalitet för analys. För att applicera stimuli, ställ in mikroskopet för att utföra 15 till 20 skanningar. Vänta tills genomsökningarna en till fem har slutförts för att producera baslinjen.Applicera stimulansen under skanningar sex till 10. Vänta minst fem minuter efter varje stimulans innan du applicerar nästa för att förhindra desensibilisering. För en mekanisk press, håll algometerns pincher med tassen mellan paddlarna utan att röra tassen.Nyp ihop tassen med början omedelbart efter slutet av skanning fem och stoppa omedelbart efter skanning 10. Övervaka presskraften med en algometer och se till att den inte överstiger 10 g över önskad kraft. För termiska stimuli, värm en bägare med vatten till strax över önskad temperatur.När vattnet har rätt temperatur, applicera stimulansen omedelbart efter skanning fem genom att nedsänka tassen i vattnet. Dra bort bägaren omedelbart efter skanning 10. Kirurgisk L5 DRG-exponering följt av konfokalmikroskopi tillät upp till 1 800 neuroner att avbildas samtidigt med Pirt-GCaMP3-möss.Primära sensoriska neuroner observerades i en ensemble på populationsnivå för spontana kalciumtransienter i frånvaro av stimuli och som svar på stimuli i deras normala fysiologiska sammanhang. Starka stimuli eller skadlig värme ökade kalciumsvaren. Jämfört med att pressa med 100 g ökade pressning med 300 g antalet neuroner som producerar kalciumtransienter och delta F med F0-området under kurvan.Varm värme i ett icke-skadligt temperaturområde på 21 och 45 grader Celsius ökade antalet neuroner som producerar kalciumtransienter och delta F med F0-området under kurvan. Icke-skadliga temperaturer aktiverade ett mindre antal neuroner som producerar transienter jämfört med en skadlig värmestimulans vid 57 grader Celsius. Vidare producerade neuroner med mindre och medelstor diameter kalciumövergående spontant och under alla stimuli, men neuroner med större diameter producerade endast kalciumtransienter som svar på 300 g pressstimulans.DRG ska vara jämn och optimal optisk skivtjocklek. Det ska vara sådant att du kan upptäcka det maximala antalet celler och det finns ingen vågighet i filmen. Denna teknik har använts för att analysera sensoriska modaliteter på populationsnivå för somatosensation och smak och för att studera intilliggande neuroner som aktiveras i par eller i synkroniserade kluster som bidrar till kronisk och neuropatisk smärta.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks (Video) | JoVE 

Funktionell Kalcium Imaging i utvecklingsländerna kortikala nätverk

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans (Video) | JoVE 

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration Video (Video) | JoVE

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals Video (Video) | JoVE

Ett förfarande för Implantation Organized arrayer av Microwires för Single-enhet Inspelningar i Awake, uppför djur

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb Video (Video) | JoVE

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents Video (Video) | JoVE

Hydraulisk Extrudering av ryggmärgen och isolering av dorsalrotsganglier i Gnagare

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

Dorsala ganglion Injection och dorsala krosskada som en modell för Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons Video (Video) | JoVE

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release Video (Video) | JoVE

Dorsalrotsganglier ganglier isolering och primära kultur att studera neurotransmitterfrigöraren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

I Vivo kalcium avbildning av sidolinje hårcellerna i Larval zebrafiskar

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...