Name: in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleri R01DE026677 ve R01DE031477 (Y.S.K.'ye), UTHSCSA başlangıç fonu (YSK) ve Teksas Üniversitesi sisteminden (YSK) Yükselen STAR Ödülü ile desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm prosedürler, San Antonio'daki Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Bir kez başladıktan sonra, hayvan cerrahisi (adım 1) ve görüntüleme (adım 2) sürekli olarak tamamlanmalıdır. Veri analizi (adım 3) daha sonra yapılabilir.
1. Sağ taraf L5 DRG görüntüleme için hayvanın ameliyatı ve ...

<ol>
	<li>Rivero-Meli&#225;n, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate.">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li><li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats.">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li><li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat.">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li><li>S&#248;rensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice.">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li><li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain.">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li><li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding.">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves.">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).</li><li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery.">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy.">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).</li><li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6.">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP.">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).</li><li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment.">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain.">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold.">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li><li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli.">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li><li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+phosphoinositide-binding+protein,+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1.">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain.">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cytoNet:+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities.">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery.">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li><li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons:+modulation+by+capsaicin,+menthol+and+mustard+oil.">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171 (2015).</li><li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord.">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li><li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system.">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li><li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey.">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li><li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca(2+)+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li><li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+sensing+by+Na(V)1.8-positive+and+Na(V)1.8-negative+sensory+neurons.">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li><li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons.">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225 (2020).</li><li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa:+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment.">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).</li><li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons.">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li><li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes.">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca(2+)+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin.">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li><li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth.">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li><li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins.">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor.">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li><li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging.">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).</li></ol>

Kalıcı ağrı, çok çeşitli bozukluklarda mevcuttur, insanların yaklaşık% 8'i için yaşam kalitesini zayıflatır ve / veya azaltır29. Birincil duyusal nöronlar ciltteki zararlı uyaranları tespit eder ve plastisiteleri kalıcı ağrıya katkıda bulunur8. Nöronlar hücre kültüründe ve eksplantlarda incelenebilirken, bunu yapmak onları normal fizyolojik bağlamlarından uzaklaştırır. DRG'nin cerrahi maruziyeti, ardından Pirt-GCaMP3 Ca2 + gör?...

Primer duyusal nöronlar doğrudan cildi innerve eder ve somatosensoriyel bilgiyi merkezi sinir sistemine geri taşır 1,2. Dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), 10.000-15.000 birincil duyusal nöronunhücre gövdesi kümeleridir 3,4. DRG nöronları farklı boyutlarda, miyelinasyon düzeylerinde ve gen ve reseptör ekspresyon paternleri sunar. Daha küçük çaplı nöronlar ağrıyı algılayan nöronları içerir ve daha büyük çaplı nöronlar tipik olarak ağrılı olmayan mekanik uyaranlara cevap verir 5,6. Yaralanma, kronik inflamasyon ve periferik nöropatiler gibi birincil duyusal nöronlardaki bozukluklar, bu nöronları çeşitli uyaranlara duyarlı hale getirebilir ve kronik ağrı, allodini ve ağrı aşırı duyarlılığına katkıda bulunabilir 7,8. Bu nedenle, DRG nöronlarının incelenmesi hem genel olarak somatosensation hem de birçok ağrı ve kaşıntı bozukluğunu anlamada önemlidir.
İn vivo ateşlenen nöronlar somatosensitasyon için gereklidir, ancak yakın zamana kadar, in vivo bozulmamış gangliyonları incelemek için kullanılan araçlar nispeten azsayıda hücre 9 ile sınırlıydı. Burada, nöronların aksiyon potansiyellerini veya aktivitelerini in vivo olarak popülasyon düzeyinde bir topluluk olarak incelemek için güçlü bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, sitoplazmikCa2 + dinamiklerine dayanan görüntüleme kullanır. Ca 2 + hassas floresan göstergeleri, normalde düşük sitoplazmik Ca2 + konsantrasyonu nedeniyle hücresel aktiviteyi ölçmek için iyi proxy'lerdir. Bu göstergeler, farelerde 9,10,11,12,13,14,15,16 vesıçanlarda 17 olmak üzere yüzlerce ila birkaç bin birincil duyusal nöronun aynı anda izlenmesine izin vermiştir. Bu çalışmada açıklanan in vivo Ca2+ görüntüleme yöntemi, mekanik, soğuk, termal ve kimyasal uyaranlara karşı popülasyon düzeyindeki tepkileri doğrudan gözlemlemek için kullanılabilir.
Fosfoinositid bağlayıcı membran proteini Pirt, hemen hemen tüm (% >95) birincil duyusal nöronlarda yüksek seviyelerde eksprese edilir 18,19 ve in vivo20 nöron aktivitesini izlemek için Ca2 + sensörü GCaMP3'ün ekspresyonunu sürmek için kullanılabilir. Bu protokolde, in vivo DRG cerrahisi, Ca2+ görüntüleme ve Pirt-GCaMP3 farelerinin sağ taraf lomber 5 (L5) DRG'sinde analiz yapmak için teknikler tanımlanmıştır14 konfokal lazer tarama mikroskobu (LSM) kullanarak.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anased Injection (Xylazine)</td>
			<td>Covetrus, Akorn</td>
			<td>33197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>422642-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-106-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller Heating Pad</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Ceramic Coated Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isoflurane)</td>
			<td>MWI Animal Health, Piramal Group</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelFoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (Ketamine)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>KET-00002R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Green Stage Tape</td>
			<td>JSITON/ Amazon</td>
			<td>B803YW8ZWL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Midmark</td>
			<td>91305430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMALGO small animal algometer</td>
			<td>Bioseb In vivo Research Instruments</td>
			<td>BIO-SMALGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf Model 923-B</td>
			<td>923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>td-Tomato C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Plate, 6 in x 10 in</td>
			<td>Newport</td>
			<td>290-TP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpV1-Cre C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>17769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td>
			<td>Cal Zeiss</td>
			<td>Zen (Blue Edition) 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia

Ca 2 + görüntüleme, aksiyon potansiyelleri ve Ca 2 + sitoplazmaya girişi veya hücre içi Ca 2 + depolarının salınımını içeren çeşitli sinyal mekanizmaları dahil olmak üzere hücresel aktivite için bir proxy olarak kullanılabilir. Farelerde dorsal kök ganglionunun (DRG) birincil duyusal nöronlarının Pirt-GCaMP3 tabanlı Ca2+ görüntülemesi, çok sayıda hücrenin aynı anda ölçülmesinin avantajını sunar. 1.800'e kadar nöron izlenebilir, bu da nöronal ağların ve somatosensoriyel süreçlerin in vivo popülasyon düzeyinde normal fizyolojik bağlamlarında bir topluluk olarak incelenmesine izin verir. İzlenen çok sayıda nöron, diğer yöntemler kullanılarak tespit edilmesi zor olacak aktivite kalıplarının tespit edilmesini sağlar. Uyaranlar, fare arka pençesine uygulanabilir ve uyaranların DRG nöron topluluğu üzerindeki doğrudan etkilerinin incelenmesine izin verir. Ca2+ geçicilerini üreten nöronların sayısı veCa2+ geçicilerinin genliği, spesifik duyusal modalitelere duyarlılığı gösterir. Nöronların çapı, aktif lif tiplerinin (zararlı olmayan mekanolara karşı zararlı ağrı lifleri, Aβ, Aδ ve C lifleri) kanıtını sağlar. Spesifik reseptörleri eksprese eden nöronlar, Pirt-GCaMP ile birlikte td-Domates ve spesifik Cre rekombinazları ile genetik olarak etiketlenebilir. Bu nedenle, DRG'nin Pirt-GCaMP3 Ca2 + görüntülemesi, ağrı, kaşıntı, dokunma ve diğer somatosensoriyel sinyalleri incelemek için popülasyon düzeyinde bir topluluk görevi gören spesifik duyusal modalitelerin ve nöron alt tiplerinin analizi için güçlü bir araç ve model sağlar.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Şekil 4: Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının temsili görüntüleri. (A,D) Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının tek kareli yüksek çözünürlüklü taramaları gösterilmiştir. (B,E) . Uyaranların yokluğunda, sırasıyla panel A ve panel D'den 15 kare P...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia Video (Video) | JoVE

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Bu yöntem kullanılarak izlenen nöronların sayısı, eski veya diğer yöntemlerin kullanılmasının imkansız olacağı nöron ağı verilerinin toplanmasına izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, arka pençeye uygulanan uyaranlara doğrudan yanıt veren, aynı anda yaklaşık 2.000 birincil duyusal nöronu izleme yeteneğidir. Bu prosedür özellikle periferik allodini ve ağrı aşırı duyarlılığı için terapötik müdahaleleri incelemek için çok uygundur.Bu yöntem, trigeminal veya genikülat ganglionları incelemek için uyarlanabilir veya siklik AMP gibi voltaj veya hücre sinyal molekülleri için genetik olarak kodlanmış sensörlerle kullanılabilir. Bu ameliyatı gerçekleştirmek pratik gerektirir. Tek bir hayvan üzerinde altı adede kadar sırt kökü gangliyonu üzerinde pratik yapabilirsiniz.John Shannonhouse ve Bay Ruben Gomez'in yardımıyla prosedürü kendim göstereceğim. Başlamak için, vücut ısısını 37 santigrat derecede tutmak için fareyi ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin. Farenin pelvik kemiğini hissederek bel genişlemesini bulun.Ardından, farenin arkasını bel büyütme alanının üzerinde tıraş edin. Makas kullanarak, bel genişlemesinin üzerinde üç taraflı dikdörtgen bir kesi yapın ve cildi forsepslerle katlayın. Omurganın sağ tarafında üç ila dört milimetrelik kesikler yapmak için 13 milimetrelik yaylı diseksiyon makasını kullanın.Omurgayı açığa çıkarmak için cildi ve kasları yanlara doğru kesmek için makas kullanın. Daha sonra, sekiz milimetrelik makas kullanarak, sağ taraf L5 DRG'nin enine işlemini temizlemek için kas ve bağ dokusunu kesin. Kanı emmek için pamuk veya Jelfoam kullanarak kanamayı en aza indirmeye çalışın.DRG'ye dokunmamaya dikkat ederek Friedman-Pearson rongeurs veya güçlü ince forsepsler kullanarak sağ taraftaki L5 enine işlemini kesin. Ardından, fareyi ve ısıtma yastığını özel sahne alanına getirin. Hayvanı ve ısıtma yastığını yerine sabitlemek için sahne bandı kullanın.Sürekli izofluran anestezisi için hayvanın burnunu burun konisine yerleştirin. Uyaranların kolay uygulanması için sağ arka pençeyi sahneden uzak bir konuma yapıştırarak sabitleyin. Omurgayı, omurlardaki cildin üzerindeki sahne kelepçeleri veya pelvik kemiğin L5 DRG'ye sadece rostral ve kaudal olarak yerine sabitleyin.DRG'nin yüzeyini mümkün olduğunca düz hale getirmek için kelepçeleri ve sahneyi ayarlayın. Ardından, aşamayı mikroskopun altına yerleştirin, böylece hedef indirildiğinde DRG'nin doğrudan sekiz milimetre üzerinde olur. Rektal termometreyi takın.Güç hatlarını ısıtma yastığına ve rektal termometreye bağlayın. Burun konisini izofluran gaz hatlarına bağlayın. 10x 0.4 DIC hedefine ve görüntüleme için ilgili yazılıma sahip dik bir konfokal mikroskop kullanın.495 nanometrede uyarma, 519 nanometrede emisyon ve 500 ila 580 nanometre arasında algılama dalga boyunun yeşil FITC filtre ayarlarını kullanın. Mikroskop altında, DRG'nin yüzeyini bulun. Sahne alanındaki kelepçeleri, DRG yüzeyi mümkün olduğunca düz olacak ve maksimum yüzey alanı odak düzleminde görselleştirilecek şekilde ayarlayın.Aşırı doz almadan izofluran anestezisini korumak için prosedürü boyunca hayvanı izleyin. Mikroskop hızlı tarama protokolünü yüklemek için, voksel boyutu 2.496 x 2.496 x 16 mikron, 512 x 512 piksel, 10 optik dilim Z-yığını, 32 mikrometre için bir Airy ünitesi, 488 nanometre ve beş miliwatt'ın% 1'lik lazer gücü, piksel süresi 1.52 mikrosaniye, çizgi süresi 0.91 milisaniye, kare süresi 465 milisaniye, LSM tarama hızı sekiz, çift yönlü tarama, PMT dedektörü 650 volt kazanç ve bir dijital kazanç. Edinme sekmesinin altındaki Denemeyi Başlat'ı tıklayarak DRG'nin kısa, sekiz döngülü bir taramasını yapın.Zaman içinde kare başına bir taramada taramaların ortogonal projeksiyonunu yaparak bir film oluşturun. DRG'yi geçen parlaklık dalgaları gibi görüntü netliği ve görüntüleme yapıtlarını manuel olarak kontrol edin. Kelepçe konumunu ve optik bölüm kalınlığını ayarlayın ve net, yüksek kaliteli bir film elde edilene kadar bu adımı tekrarlayın.Ardından, voksel boyutu 1.248 x 1.248 x 14 mikron, 1024 x 1024 piksel, altı optik dilim Z-yığını, 1.2 Airy birimi veya 39 mikrometre, 488 nanometre ve 25 miliwatt'ın% 5 lazer gücü, piksel süresi 2.06 mikrosaniye, satır süresi 4.95 milisaniye, kare süresi 5.06 saniye, altı LSM tarama hızı, çift yönlü tarama, 650 voltta PMT dedektörü kazancı ve bir dijital kazanç. DRG'nin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü oluşturmak için Edinme sekmesinin altındaki Denemeyi Başlat düğmesine tıklayın. Mikroskop hızlı tarama protokolünü yükleyin ve 80 döngü boyunca DRG'de spontan aktiviteyi kaydedin.Ortogonal bir projeksiyon filmi oluşturun ve görüntünün analiz için yeterli kalitede olduğunu doğrulayın. Uyaranları uygulamak için, mikroskobu 15 ila 20 tarama yapacak şekilde ayarlayın. Taban çizgisini oluşturmak için bir ila beş arasındaki taramaların tamamlanmasını bekleyin.Altı ila 10 arasındaki taramalar sırasında uyaranı uygulayın. Duyarsızlaşmayı önlemek için bir sonrakini uygulamadan önce her uyaranı takiben en az beş dakika bekleyin. Mekanik bir pres için, algometrenin kıskaçını, pençeye dokunmadan kürekler arasındaki pençe ile tutun.Beş taramanın bitiminden hemen sonra başlayan ve tarama 10'dan hemen sonra duran pençeyi sıkıştırın. Pres kuvvetini bir algometre ile izleyin ve istenen kuvvetin üzerinde 10 g'ı geçmediğinden emin olun. Termal uyaranlar için, bir su kabını istenen sıcaklığın hemen üzerine ısıtın.Su doğru sıcaklıkta olduğunda, pençeyi suya batırarak beş taramadan hemen sonra uyaranı uygulayın. 10 taramasından hemen sonra beheri çekin. Cerrahi L5 DRG maruziyeti ve ardından konfokal mikroskopi, Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak aynı anda 1.800 nörona kadar görüntülenmesine izin verdi.Primer duyusal nöronlar, uyaranların yokluğunda ve normal fizyolojik bağlamlarında uyaranlara yanıt olarak spontan kalsiyum geçicileri için popülasyonel düzeyde bir toplulukta gözlenmiştir. Güçlü uyaranlar veya zararlı ısı, kalsiyum tepkilerini arttırdı. 100 g ile preslemeye kıyasla, 300 g ile presleme, kalsiyum geçici maddeleri üreten nöronların sayısını ve eğrinin altındaki delta F'yi F0 alanı ile arttırdı.21 ve 45 santigrat derecelik zararlı olmayan bir sıcaklık aralığındaki ılık ısı, kalsiyum geçici maddeleri üreten nöronların sayısını ve eğrinin altındaki delta F'yi F0 alanına kadar arttırdı. Zararlı olmayan sıcaklıklar, 57 santigrat derecedeki zararlı bir ısı uyaranına kıyasla geçici olarak üreten daha az sayıda nöronu aktive etti. Ayrıca, daha küçük ve orta çaplı nöronlar kendiliğinden ve tüm uyaranlar altında geçici kalsiyum ürettiler, ancak daha büyük çaplı nöronlar sadece 300 g pres uyaranına yanıt olarak kalsiyum geçici ürettiler.DRG düz ve optimum optik dilim kalınlığında olmalıdır. Maksimum hücre sayısını tespit edebileceğiniz ve filmde dalgalılık olmayacak şekilde olmalıdır. Bu teknik, somatosensitasyon ve tat için popülasyonel düzeyde duyusal modaliteleri analiz etmek ve kronik ve nöropatik ağrıya katkıda bulunan çiftler halinde veya senkronize kümelerde aktive olan bitişik nöronları incelemek için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks Video (Video) | JoVE

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans Video (Video) | JoVE

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration Video (Video) | JoVE

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals Video (Video) | JoVE

Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb Video (Video) | JoVE

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents Video (Video) | JoVE

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration Video (Video) | JoVE

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons Video (Video) | JoVE

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release Video (Video) | JoVE

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish Video (Video) | JoVE

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...