Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Dai Fei Elmer Kers forskning støttes af midler fra Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund: 08190466), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK program), Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (Early Career Scheme Award: 24201720 og General Research Fund: 14213922) og The Chinese University of Hong Kong (Faculty Innovation Award: FIA2018 / A / 01). Dan Wangs forskning støttes af midler fra Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK program) og Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (General Research Fund: 14118620 and 14121121).

Alle procedurer skal udføres ved hjælp af steril kirurgisk teknik i et passende udstyret rum, der er udpeget til dyreoperationer i henhold til en protokol, der er godkendt af instituttets etiske komité for dyreforsøg. I denne undersøgelse blev kaninoperationer udført i overensstemmelse med en protokol godkendt af The Chinese University of Hong Kong Animal Experimentation Ethics Committee.
1. Kirurgisk indgreb
<ol><li>For at forberede det kirurgiske område skal du forvarme en varmepude og overlejre den med sterile kirurgiske gardiner for at opretholde kaninens kropstemperatur. Derefter skal du lægge steriliserede kirurgiske værktøjer og forsyninger (som angivet i materialetabellen) og organisere dem efter kirurgens præference.</li>
	<li>Inducer anæstesi via intramuskulær administration af 35 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin til New Zealand hvide kaniner (vejer mellem 3,5 og 4,5 kg, ca. 5-6,5 måneder; to mandlige og en kvindelig kaniner blev brugt i denne undersøgelse). Bekræft derefter anæstesi med en pote og / eller haleklemmetest.</li>
	<li>Hvis yderligere anæstesi er nødvendig for at opretholde det kirurgiske plan, skal du administrere 10 mg / kg ketamin og 3 mg / kg xylazin intravenøst via den marginale ørevene28 og overvåge dyrets vejrtrækningshastighed med jævne mellemrum på 5-10 minutter.</li>
	<li>For at forberede det kirurgiske vindue skal du barbere det tilsigtede snitsted (hudområdet overfladisk i forhold til SSC-muskelseneenheden) og rengøre med tre skiftevis anvendelser af betadin og 70% alkohol. Brug en vatpind til at påføre betadin og 70% alkohol i cirkulære bevægelser (indefra og udefra). Brug øjensalve til at holde kaninens øjne fugtige og smurte. Administrer 20 mg/kg cephalexin intramuskulært som et antiinfektionsmiddel.</li>
	<li>Lav et 3-4 cm hudsnit ringere end kravebenet, del deltopektoralt interval ved hjælp af en kirurgisk nr. 11 skalpel og træk dig tilbage for at få adgang til skulderen (figur 1A, B).</li>
	<li>For at lokalisere SSC muskel-seneenheden skal du først identificere coracobrachialis-musklen (som væv, der dækker SSC-senefastgørelsen) og opdele den. Herefter skal du identificere SSC-senen og indsætte en retvinklet klemme for at eksponere hele SSC-senen ved dens indsættelse på humerus mindre tuberøsitet (figur 1C).</li>
	<li>Før skaden introduceres, isoleres SSC-muskelsenen (figur 1D) og administreres intraoperativ bedøvelse (0,2 mg/kg 0,5% bupivacain) lokalt nær transsektionsstedet. Pak SSC-muskelseneenheden ind i silikonebaserede penroseslanger (figur 1E) for at forhindre uønsket fastgørelse til det omgivende væv og hjælpe efterfølgende vævsudtagning.</li>
	<li>For at fremkalde skade skal du oprette en transsektion i fuld tykkelse ved muskel-senekrydset ved hjælp af en kirurgisk skalpel nr. 11 (figur 1F). Stop om nødvendigt blødningen ved at lægge pres på et stykke gasbind og brug saltvand til at skylle såret efter behov.</li>
	<li>For at lukke såret skal du bruge en 4-0 polyglycolsyre (PGA) sutur til at tilnærme deltoidmuskelvævet (figur 1G) og en 4-0 nylonsutur til at lukke hudsåret (figur 1H).</li>
	<li>Yde postoperativ behandling gennem subkutan administration af 0,03 mg/kg buprenorphin som smertestillende middel (en gang umiddelbart efter operationen og to gange dagligt i de næste 48 timer29).</li>
	<li>Lad kaninerne komme sig på en overdækket varmepude og påfør en blød krave for at forhindre uønsket adfærd, herunder selvlemlæstelse, slikning af kirurgiske steder og fjernelse af suturer (figur 1I).</li>
	<li>Overvåg dyrene for vægt og adfærdsændringer. Rapporter ethvert fald på mere end 10% kropsvægt og svær smerte, der ikke kan kontrolleres (vurderet ud fra fem adfærdshandlinger: orbital stramning, kindfladning, ændringer i næseborform, ændringer i whiskerposition og ændringer i øreform og position) til dyrlægen for at afgøre, om intervention såsom tidlig eutanasi er påkrævet.</li>
</ol>2. Prøve høst
<ol><li>Euthanize kaninerne på 4 uger fra skadestidspunktet. Bedøv kaninerne og giv en dødelig dosis natriumpentobarbital (mere end 60 mg / kg). Bekræft død ved thoracotomi.</li>
	<li>Identificer humeralhovedet og skær det kirurgisk, samtidig med at de større og mindre tuberkler og alle bløddelsvedhæftninger bevares. Der fastgøres med 4 % paraformaldehyd (PFA) i 72 timer ved 4 °C, inden der overføres til en opløsning af 10 % ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 1 måned ved stuetemperatur (med medieskift for hver 72 timer) for at afkalke knoglen.</li>
	<li>Efter afkalkning udsættes prøverne for standard histologisk behandling ved hjælp af gradueret ethanoldehydrering, paraffinindlejring, histologisk sektionering (8 μm sektioner) og farvning med hæmatoxylin og eosin (H&E) og Massons trikrome opløsninger30,31,32.</li>
	<li>Tag billeder med et opretstående mikroskop ved 10x forstørrelse.</li>
	<li>Udfør semi-kvantificering af H&E og Massons trikrome billeder ved at måle arealet og procentdelen af muskler, fibrøst væv og fedt i musklen, som tidligere beskrevet33,34 ved hjælp af en grafisk designsoftware efter eget valg. I dette eksempel bruges Adobe Photoshop-software (https://www.adobe.com).<ol><li>Vælg et område af en bestemt farve, der repræsenterer en bestemt vævstype ved hjælp af tryllestavværktøjet (rød er muskelvæv, blå er fibrose og hvid repræsenterer fedt).</li>
		<li>Klik på menupunkterne Vælg | Omvendt | Gem markering | Navngiv sektionen.</li>
		<li>Tæl antallet af pixels i det markerede område ved at klikke på menupunkter Vindue | Målelog | Optag måling for at registrere disse pixelværdier, og beregn procentdelen af de valgte vævstyper manuelt.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Statistisk analyse
<ol><li>For histologiske data skal du udføre den statistiske analyse ved hjælp af den valgte analytiske software. Udfør en studerendes t-test til sammenligning af to uafhængige prøver mellem kontrolgruppen og skadede grupper.</li>
	<li>Udtryk dataene som middelværdi ± standardfejl i middelværdien. Betragt en p-værdi på <0,05 som statistisk signifikant.</li>
</ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at erklære.

En reproducerbar og fysiologisk relevant dyremodel giver mulighed for at fremme forståelsen af sygdomspatogenese, evaluere resultaterne af kliniske behandlinger og forbedre og videreudvikle kirurgiske behandlinger35. I denne undersøgelse blev der etableret en pålidelig og nøjagtig kanin SSC-model, der efterligner aspekter af human RC-anatomi og patofysiologi. RC tårer er relateret til progressive og sandsynligvis irreversible muskulære degenerative ændringer, hvilket resulterer i et reduceret helingspotentiale. For eksempel viste Ko et al., at genvedhæftning af kanin SSP efter 6 uger ikke vendte muskelatrofi eller FD i de følgende 6 uger. Sådan FD-medieret muskelatrofi påvirker flere vigtige kliniske parametre, herunder senemuskelstyrke og ledbevægelsesområde, hvilket kan påvirke de kirurgiske resultater36,37.
Protokollen, der blev etableret her, viste signifikante kronisk-lignende egenskaber efter transsektion af SSC muskel-seneenheder. Specifikt omfatter disse ændringer synligt nedsat muskelmasse og øget fedtindhold og fibrotisk væv (figur 2, figur 3 og figur 4). Disse resultater er i overensstemmelse med degenerative ændringer rapporteret i humane RC tårer38. I de senere år har rotten vist sig som en af de mest intensivt studerede dyremodeller for RC-sygdom og skade på grund af dens høje anatomiske ligheder med både menneskelige og rotte-SSP'er, der rejser under akromionen38,39,40. Det skal dog bemærkes, at den del af rotte-SSP, der passerer under akromialbuen, er muskuløs i modsætning til tendinøs, hvilket er tilfældet hos mennesker41. Vigtigst af alt erkendte Barton et al. en mangel på signifikant fedtophobning efter SSP-seneløsning hos rotter23, hvilket står i modsætning til den menneskelige tilstand42. Som sådan menes det, at kaninens SSC-kompleks kan give en passende model til at efterligne den kroniske RC-tåre hos mennesker.
For at sikre reproducerbarheden af denne model er to punkter værd at bemærke, når du udfører denne protokol. For det første, efter transsektion af muskel-seneenheder, kan den frie ende af den transekterede sene være i fare for at danne adhæsioner, hvilket kan gøre senehentning udfordrende for efterfølgende manipulationer. For at undgå dette problem blev der anvendt en ikke-resorberbar silikoneslange til at pakke den frie ende af muskel-seneforbindelsen efter transsektion for at undgå spontan vedhæftning til omgivende væv samt spontan heling (figur 1E). Endvidere kan den transekterede muskelseneenhed under en anden interventionsprocedure (dvs. for at udføre en sikker reparation; data ikke vist) klart identificeres ved at indpakke enden af skadet væv på tidspunktet for den indledende operation. Denne teknik er økonomisk, effektiv og kan let implementeres i kirurgi43. For det andet er kaniner en meget følsom art, der kan udvise skadelig adfærd efter operationen. For at undgå sådanne problemer anbefales det stærkt, at en blød krave også påføres for at forhindre uønsket adfærd, herunder selvlemlæstelse, slikning af kirurgiske steder og fjernelse af suturer (figur 1I). Sammenlignet med kommercielt konventionelle E-halsbånd, der er lavet af stift plast, forårsagede den selvfremstillede bløde krave ingen hudskader eller andre bivirkninger, der påvirkede dyrevelfærden eller kvaliteten af videnskabelige undersøgelser. Sammen er sådanne trin afgørende for at skabe en nøjagtigt reproducerbar kanin RC-skademodel og give mulighed for at studere de regenerative reparationsstrategier.
For at studere senepatofysiologi og heling i en dyremodel skal der skabes en tydelig og reproducerbar skade, og undersøgelsestidspunkterne skal vælges omhyggeligt. Langt de fleste undersøgelser af seneskader og heling er udført på fuldt transekterede dyresener44, da transsektion er en simpel procedure, der er meget reproducerbar og kan simulere det kliniske scenarie45,46 tilstrækkeligt. Huegel et al. viste, at skaden på en delvist transekteret sene var mindre alvorlig end på en fuldt transekteret sene, og immobilisering havde en skadelig virkning på senemekanikken, herunder øget ledstivhed47. For at evaluere atrofi og FD, der ses i indstillingen af massiv RC-tåre, er det vigtigt at definere de eksperimentelt observerede karakteristiske tidspunkter. Gupta et al. har valideret en RC-skademodel hos hankaninen og observeret muskelatrofi ved 2 og 6 ugers tidspunkter med øget fedtindhold på senere tidspunkter (mindre end 5% fedtindhold efter 2 uger vs. mere end 10% fedtindhold efter 6 uger), i overensstemmelse med den patologiske proces observeret i humane RC-tårer11. I denne undersøgelse blev der skabt en massiv RC-rift ved transsektion af SSC-muskelseneenheden hos han- og hunkaniner i 4 uger, hvilket resulterede i SSC-muskel FD (36,5% fedtindhold). Således er et 4 ugers tidspunkt passende til generering af SSC-muskel FD hos mandlige og kvindelige New Zealand hvide kaniner.
Der findes flere begrænsninger for denne undersøgelse. Disse omfatter: (i) trin forbundet med dyremodelgenerering, såsom et relativt kort tidspunkt og potentielt inflammatoriske materialer (silikonebaserede penroseslanger) til kronisk lignende skadegenerering; ii) karakterisering og analyse af dyremodeller, såsom manglende ganganalyse og elektromyografi til vurdering af ledkinematik og muskelkontraktil kraftgenerering og (iii) sammenligning af dyremodeller, såsom manglende sammenligning med andre RC-skadesteder.
Med hensyn til modelgenerering involverer menneskelige RC-skader typisk progressiv atrofi og FD, der kan forekomme i løbet af flere år, hvilket er relativt længere end det 4 ugers tidspunkt, der er rapporteret her. Dette anses for at være acceptabelt, da en dyremodel, der genererer omkring 36,5% intramuskulært fedt på relativt kort tid, vil være logistisk praktisk og kan forlænges, hvis det anses for nødvendigt. Desuden har biokompatibiliteten af silikonebaserede implantater, såsom penroseslanger, været en kilde til langvarig kontrovers på grund af rapporter om cellulært immunrespons og betændelse47; derfor kan et alternativt inert materiale, såsom polyethylenglycol (PEG), erstattes af indpakning af den resekterede sene, hvis der forfølges inflammationsassocierede RC-undersøgelser.
Med hensyn til dyremodelkarakterisering og analyse kan manglen på ganganalyse49 og elektromyografundersøgelser50 begrænse undersøgelsens resultater til kvalitative histologiske data. Disse aspekter kan behandles i fremtidige undersøgelser ved hjælp af videobevægelsesanalyse51 og overfladeelektromyografi50 for at generere kvantitative data om skulderkinematik og RC-muskelydelse.
Med hensyn til modelsammenligning, da SSP og infraspinatus sener i kaninerne også har været meget udbredt til RC-undersøgelser, vil sammenligning af skadens sværhedsgrad, herunder FD blandt disse forskellige skadesteder i fremtiden, identificere yderligere steder til modeloptimering.
Sammenfattende har denne undersøgelse udviklet en protokol til modellering af kronisk-lignende RC-skader hos mandlige og kvindelige kaniner. Denne model er praktisk for efterforskere på grund af dens enkelhed (transsektion) og relativt korte periode til at inducere kronicitet (4 uger), mens den genererer en stor grad (36,5%) af intramuskulær FD. Som sådan forventes denne protokol at hjælpe efterforskere i studiet af RC-patofysiologi samt lette udviklingen af nye lægemidler til muskel-senereparation og regenerering.

Kroniske rotator manchet (RC) tårer er karakteriseret ved degenerative ændringer i muskulatur og sener, herunder atrofi af muskler, ophobning af fedtvæv og fibrose, som kan kompromittere resultatet af RC reparation og i sidste ende forårsage skuldersmerter og dysfunktion 1,2,3,4,5 . For bedre at forstå RC-tårepatogenesen og forbedre kirurgiske resultater er det afgørende at udvikle passende dyremodeller, der kan efterligne aspekter af human RC-anatomi og patofysiologi. Specifikt skal RC-skademodeller opfylde følgende kriterier: (i) mangler spontan heling efter skade; ii) indeholder en signifikant tilstedeværelse af fibrose, muskelatrofi og akkumulering af fedtvæv og iii) være af en sådan størrelse til at muliggøre tilnærmelse af kirurgiske teknikker, der anvendes på mennesker6.
Inden for denne sammenhæng kan kaninens subscapularis (SSC) muskel bruges som en nøjagtig og pålidelig dyremodel til undersøgelse af RC-patofysiologi i betragtning af dens unikke anatomi, patofysiologiske respons og biomekaniske egenskaber7. Faktisk ligner kanin SSC RC anatomi human supraspinatus (SSP) RC, som er den muskel-seneenhed, der oftest er forbundet med skade som følge af overforbrug 8,9. Specifikt passerer kanin-SSC-senekomplekset gennem en knogletunnel og under coracobrachialis-musklen, hvilket er analogt med situationen hos mennesker, hvor SSP-senekomplekset passerer gennem den subakromiale knogletunnel og under coracoacromial ligament7. Denne anatomiske lighed resulterer i, at kanin SSC gennemgår lignende muskuloskeletale bevægelser som human SSP, hvor senen bevæger sig under akromionen under højde og bortførelse af humerus 7,10.
Desuden er patohistologiske ændringer, svarende til humane RC-tårer11, blevet observeret hos kaninen efter SSC-rivning. Specifikt gennemgår muskelmaven alvorlig FD med et betydeligt tab af muskelmasse, nedsat muskelfibertværsnitsareal og øget fedme. Derudover vurderede Otarodifard et al. de biomekaniske egenskaber ved kaninens SSC efter (1) enkeltrække, (2) dobbeltrække og (3) transosseøse ækvivalente RC-reparationsteknikker og fandt, at de oprindelige biomekaniske egenskaber ved disse reparationer lignede humane SSP RC-reparationer udført i kadaveriske prøver12. Som sådan gør den anatomiske, fysiologiske og biomekaniske lighed mellem kanin SSC og human SSP det nyttigt til modellering af RC-skader.
Selvom mange dyrearter, herunder rotter, mus, hunde og får, er blevet brugt i undersøgelsen af RC-sygdom og reparation 6,13,14,15, er graden af skadekronicitet en vigtig overvejelse. Dette skyldes, at RC-tårer kan være asymptomatiske og ofte kan diagnosticeres meget senere, når tåren er forstørret og blevet kronisk, hvor både senen og musklen udviser alvorlig degeneration16,17,18. Imidlertid anvender de fleste RC-reparationsmodeller akutte skademodeller, hvor den sunde sene transekteres og derefter straks repareres 19,20,21,22. Dette sker stort set af logistiske hensigtsmæssigheder og teknisk lethed, hvilket resulterer i få undersøgelser, der undersøger RC-patofysiologien inden for en kronisk-lignende indstilling. Desuden kan flere dyremodeller have egenskaber, der hindrer deres anvendelse til kroniske RC-undersøgelser.
For eksempel, selvom rotten i vid udstrækning er blevet brugt til at modellere RC-tåre og intervention, står manglen på signifikant fedtophobning efter skade i kontrast til den menneskelige tilstand, og dens lille størrelse gør gentagne kirurgiske procedurer udfordrende23. Selvom Gerber et al. brugte infraspinatus hos får til at studere muskelatrofi og FD efter kronisk RC-tåre24, eksisterer der en vis anatomisk ulighed mellem fårinfraspinatus og human SSP samt adskillige logistiske udfordringer ved at studere og huse en så stor dyremodel. Derudover udviklede Gerber et al. en forsinket RC-skademodel hos får ved at frigive det overfladiske hoved af infraspinatusmusklen og senen for at efterligne funktionerne i en kronisk RC-tåre og evaluerede derefter effektiviteten af forskellige reparationsteknikker på senen efter 4 til 6 uger. Desværre havde denne kronisk-lignende fåremodel en begrænsning, idet enden af den frigivne sene ikke kunne skelnes fra arvæv under den anden kirurgiske procedure25.
Coleman et al. udviklede også en kronisk RC-tåremodel hos får ved at dække den transekterede seneende med en syntetisk membran på tidspunktet for den indledende operation, hvilket muliggjorde næringsstofdiffusion og effektivt minimerede arvævsdannelse omkring det skadede væv, samtidig med at diskriminationen mellem senen og arvævet blev forbedret26. I mellemtiden foreslog Turner et al., at en forsinket reparation skulle udføres inden for 4 uger, da direkte genmontering sjældent sker i en massiv senetilbagetrækning27. Sammen har disse undersøgelser bidraget til reproducerbare og pålidelige protokoller til en vellykket etablering af en kronisk-lignende kanin SSC RC skademodel.
I denne protokol etableres en kronisk-lignende kanin RC-skademodel efter 4 uger, hvor patologiske ændringer relateret til fibrose og FD-medieret muskelatrofi kan studeres via histologiske vurderinger. Især indpakning af den frie ende af muskel-seneforbindelsen ved hjælp af en silikonebaseret penroseslange på tidspunktet for den indledende operation muliggør klar identifikation af RC-vævet under den anden kirurgiske procedure og letter følgelig en sikker reparation for at studere RC-heling med og uden stilladsforstørrelse. Alt i alt kan en kronisk-lignende kanin SSC-model bedre efterligne RC-patofysiologi og stille minimale tekniske og logistiske krav.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

Patofysiologi hos kaninrotatormanchet (RC) kan føre til progressive og stærkt degenerative ændringer i dens tilknyttede muskulatur og sener, hvilket negativt påvirker klinisk relevante parametre, såsom styrke og tilbagetrækning af muskelsenen/myotendinøs enhed, hvilket i sidste ende forårsager tab af skulderfunktion og påvirker RC-reparationsresultaterne negativt. Dyremodeller, der efterligner aspekter af human RC-anatomi og patofysiologi, er afgørende for at fremme den konceptuelle forståelse af skadeprogression og udvikle effektiv vævsteknik og regenerativ medicinbaseret terapi.
Inden for denne sammenhæng er en kanin subscapularis (SSC) model egnet på grund af (i) dens anatomiske lighed med den humane supraspinatus (SSP) knogle-senemuskelenhed, som er det hyppigst skadede RC-sted; ii) dets patofysiologiske lighed med mennesker med hensyn til fibrose og muskelfedtdegeneration (FD) og iii) dets modtagelighed for kirurgiske indgreb. Derfor er målet med denne undersøgelse at beskrive de kirurgiske teknikker til inducering af SSC RC-skade. Kort fortalt involverer proceduren isolering af SSC ved at identificere coracobrachialis-musklen efterfulgt af en transsektion i fuld tykkelse ved muskel-seneforbindelsen og indpakning af den frie ende af muskel-seneforbindelsen med en silikonebaseret penroseslange for at forhindre spontan genfastgørelse. Histologiske evalueringer udføres for at overvåge progressionen af muskel FD 4 uger efter operationen ved hjælp af hæmatoxylin og eosin (H & E) samt Massons trikromfarvning.
Tab af muskler og FD var tydelige 4 uger efter transsektion af SSC muskel-sene-krydset, svarende til humane RC patofysiologiske tilstande. Denne protokol demonstrerer trinene til vellykket etablering af en kronisk-lignende kanin SSC RC-skademodel, som kan tjene som et kraftfuldt værktøj til at studere skeletmuskelændringer forbundet med RC-patofysiologi og hjælpe udviklingen af nye terapeutiske strategier for kronisk-lignende RC-tårer.

For at vurdere kroniciteten af RC-patologi efter transsektion af SSC-muskelseneenheder blev den samlede vævsmorfologi og cellulære ændringer karakteriseret via grov evaluering og histologisk analyse (henholdsvis H&E og Massons trikromfarvning) 4 uger efter skaden (figur 2, figur 3 og figur 4 ). Repræsentative billeder af grov vævsmorfologi viste udseendet af hvidt fedtlignende væv i skadede SSC-muskler, som var fraværende i kontrolgruppen (figur 2). H&E-farvning bekræftede tab af muskelcellularitet og organisation, som blev erstattet med et stort antal adipocytter (tomme rum omgivet af tynde fælge af cytoplasma, der indeholdt komprimerede kerner) i skadede SSC-muskler i forhold til kontrolgruppen (figur 3A).
Semikvantitativ vurdering af H&E-billeder viste en høj grad af intramuskulære adipocytter til stede i skadede SSC-muskler (36,5% ± 8,5%) i forhold til kontrolgruppen (0,69% ± 0,18%) (figur 3B). Massons trikrome farvning bekræftede også muskelatrofi og uorganiserede kollagenfiberarrangementer i skadede SSC-muskler i forhold til kontrolgruppen (figur 4A). Semikvantitativ vurdering af Massons trikrome billeder viste en reduktion i muskelcellularitet for skadede SSC-muskler (41,3% ± 2,6%) i forhold til kontrolgruppen (99,2% ± 0,16%) (figur 4B). Selvom yderligere semikvantitativ vurdering ikke viste nogen signifikant forskel for dannelse af fibrotisk væv mellem skadede SSC-muskler (22,3% ± 13,1%) og kontrolgruppen (0,07% ± 0,05%), blev der observeret en høj grad af fibrose i skadede SSC-muskler (figur 4C). Sammen viste grov vævsmorfologi og histologisk analyse, at skadet kanin SSC muskelsene udviste alvorlig muskelatrofi, fedtophobning og fibrose, som er kendte kendetegn ved kronisk RC-patofysiologi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> Figur 1: Kirurgisk procedure for kronisk-lignende SSC muskel-sene skade model. (A) Et kirurgisk vindue blev oprettet, og anatomiske landemærker som humerus, humeralt hoved og kraveben blev identificeret ved palpation. (B) Et hudsnit på 3,0 cm blev gjort ringere end kravebenet. (C) Coracobrachialis-musklen blev delt for at blotte SSC-musklen. D) SSC's muskelseneenhed var isoleret. (E) Et silikonebaseret penrosedræn blev brugt til at pakke SSC-muskelsenevævet ind. F) SSC's muskelsene blev transekteret. (G) Coracobrachialis muskel blev reappapponeret ved hjælp af PGA suturer. (H) Hudsnittet blev lukket ved hjælp af nylonsuturer. (I) Efter operationen fik kaninerne et blødt halsbånd at bære. Forkortelser: SSC = subscapularis; PGA = polyglycolsyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> Figur 2: Bruttomorfologi af repræsentative SSC-muskler. Sorte pile repræsenterer hvide fedtvæv. Forkortelse: SSC = subscapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> Figur 3: Histologisk analyse af kronisk-lignende RC skademodel efter 4 uger. (A) Repræsentative H&E-farvede histologibilleder viste atrofiske muskelfibre og akkumulering af adipocytter. (B) Kvantificering af akkumuleringsprocenten for skadet muskelfedt. n = 3 kaniner. Fejlbjælker angiver SEM. *, statistisk signifikant (s≤ 0,05). Skalasøjler = 5.000 μm (A, venstre kolonne), 600 μm (A, højre kolonne). Forkortelser: SSC = subscapularis; RC = rotator manchet; H&E = hæmatoxylin og eosin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> Figur 4: Histologisk analyse af kronisk-lignende RC skademodel efter 4 uger. (A) Massons trikromfarvede billeder viste betydelig fibrose. Fibrøst bindevæv er farvet blåt. (B) Kvantificering af andelen af muskelvæv og (C) fibrotisk væv. n = 3 kaniner. Fejlbjælker angiver SEM. *, statistisk signifikant (s≤ 0,05). Skalasøjler = 5.000 μm (A, venstre kolonne), 200 μm (A, højre kolonne). Forkortelser: SSC = subscapularis; RC = rotator manchet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

Denne undersøgelse beskriver procedurer for etablering af en kronisk-lignende kanin rotator manchet (RC) skade. Specifikt er skaden skabt i subscapularis (SSC) muskel-sener / myotendinøs enhed for at efterligne human RC-anatomi og patofysiologi, herunder svær muskelfedtdegeneration (FD). Denne protokol kan anvendes til at studere RC-skader og vurdere regenerative terapier.

Udvikling af en kaninkronisk-lignende rotator manchetskademodel til undersøgelse af fibrose og muskulær fedtdegeneration

Rabbit rotator cuff (RC) pathophysiology can lead to progressive and highly degenerative changes in its associated musculature and tendons, which ...

Denne protokol demonstrerer en kompleks kirurgisk teknik til at fremkalde en kronisk-lignende rotatormanchetskade hos kaniner og er nyttig til at studere rotatormanchetpatogenese og udvikle regenerative terapier. Kaniner er mellemstore til store dyremodeller, der er lette at huse logistisk, manipulere kirurgisk og viser høje niveauer af rotatormanchetmuskelfedtdegeneration, når de er skadet, svarende til mennesker. Subscapularis skadesmodellen vist her er anatomisk analog med supraspinatus knoglesenemuskelkomplekset, en af de hyppigst skadede rotatormanchetenheder.Til at begynde med skal du forberede det kirurgiske vindue ved at barbere det tilsigtede snitsted for en bedøvet kanin. Brug vatpinde til at rengøre området med tre skiftevis anvendelser af Betadine og 70% alkohol i cirkulære bevægelser. Administrer 20 milligram pr. Kg cephalexin intramuskulært som et profylaktisk antiinfektionsmiddel.Lav et tre til fire centimeter hudsnit ringere end kravebenet, del deltopektoralt interval ved hjælp af en saks og træk dig tilbage for at få adgang til skulderen. For at lokalisere subscapularis muskelseneenheden skal du først identificere coracobrachialis-musklen. Identificer derefter subscapularis-senen og indsæt en retvinklet klemme for at udsætte hele senen ved dens indsættelse på humerusens mindre tuberøsitet.Isoler subscapularis muskelsenen. Efter administration af smertestillende middel før operationen lokalt nær transsektionsstedet, skal du pakke subscapularis muskelseneenheden ind i silikonebaseret penroseslange for at forhindre uønsket fastgørelse til det omgivende væv og hjælpe efterfølgende vævsudtagning. For at fremkalde skade skal du oprette en transsektion i fuld tykkelse ved muskelsenekrydset ved hjælp af en kirurgisk nummer 11 skalpel.Stop om nødvendigt blødningen ved at lægge pres på et stykke gasbind og brug saltvand til at skylle såret efter behov. For at lukke såret skal du bruge en 4-0 polyglycolsyresutur til at tilnærme deltoidmuskelvævet og en 4-0 nylon- eller silkesutur til at lukke hudsåret efterfulgt af sårrensning. Administrer 0,03 milligram pr. Kg buprenorphin subkutant som smertestillende middel en gang umiddelbart efter operationen og to gange dagligt i de næste 48 timer.Den histologiske analyse af den kronisk-lignende rotator manchetskademodel efter fire uger er vist i denne figur. H&E-farvningen bekræftede tabet af muskelcellularitet og organisation, som blev erstattet med et stort antal adipocytter i skadede subscapularis-muskler i forhold til kontrolgruppen. Kvantificeringen af den skadede muskelfedtakkumuleringsprocent er vist i denne figur.Massons trikrome farvning bekræftede også muskelatrofi og uorganiserede kollagenfiberarrangementer i skadede subscapularis-muskler i forhold til kontrolgruppen. Kvantificeringen af andelen af muskel og fibrotisk væv er vist i denne figur. Vurderingen viste en reduktion i muskelcellularitet for skadede subscapularis muskler i forhold til kontrolgruppen.En høj grad af fibrose blev også observeret i skadede subscapularis muskler. Identifikation af subscapularis senen og indpakning af subscapularis muskelseneenheden i penrose slange er de vigtigste trin i denne procedure. Efter denne procedure kan et terapeutisk indgreb anvendes.I dette tilfælde kan analyserne beskrevet her sammen med yderligere myografi eller ganganalyse bruges til at vurdere interventionsresultatet. Denne teknik er afgørende for at hjælpe forskere i studiet af rotator cuff patofysiologi, samt lette udviklingen af nye behandlinger til muskel sener reparation og regenerering.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolation, Kultur og transplantation af Muskel satellit celler

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Kosttilskud af polyumættede fedtsyrer i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...