Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Het onderzoek van Dai Fei Elmer Ker wordt ondersteund door financiering van het Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund: 08190466), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK programma), Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (Early Career Scheme Award: 24201720 and General Research Fund: 14213922) en The Chinese University of Hong Kong (Faculty Innovation Award: FIA2018/A/01). Het onderzoek van Dan Wang wordt ondersteund door financiering van het Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK programma) en Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (General Research Fund: 14118620 en 14121121).

Alle procedures moeten worden uitgevoerd met behulp van een steriele chirurgische techniek in een goed uitgeruste ruimte die is aangewezen voor dieroperaties volgens een protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven van het instituut. In de huidige studie werden konijnenoperaties uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat is goedgekeurd door de Chinese University of Hong Kong Animal Experimentation Ethics Committee.
1. Chirurgische ingreep
<ol><li>Om het operatiegebied voor te bereiden, verwarmt u een verwarmingskussen voor en bedekt u het met steriele operatiegordijnen om de lichaamstemperatuur van het konijn op peil te houden. Leg vervolgens gesteriliseerde chirurgische instrumenten en benodigdheden neer (zoals gespecificeerd in de materiaaltabel) en organiseer ze volgens de voorkeur van de chirurg.</li>
	<li>Induceren van anesthesie via intramusculaire toediening van 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine aan Nieuw-Zeelandse witte konijnen (met een gewicht tussen 3,5 en 4,5 kg, ongeveer 5-6,5 maanden oud; in dit onderzoek werden twee mannelijke en één vrouwelijke konijnen gebruikt). Bevestig vervolgens de anesthesie met een poot- en/of staartknijptest.</li>
	<li>Als aanvullende anesthesie nodig is om het operatievlak te ondersteunen, dien dan 10 mg/kg ketamine en 3 mg/kg xylazine intraveneus toe via de marginale oorader28 en controleer de ademhalingsfrequentie van het dier met regelmatige tussenpozen van 5-10 minuten.</li>
	<li>Om het operatievenster voor te bereiden, scheert u de beoogde incisieplaats (het huidgebied dat oppervlakkig is ten opzichte van de SSC-spier-peeseenheid) en reinigt u met drie afwisselende toepassingen van betadine en 70% alcohol. Gebruik een wattenstaafje om betadine en 70% alcohol in cirkelvormige bewegingen (van binnen naar buiten) aan te brengen. Gebruik oogzalf om de ogen van het konijn vochtig en gesmeerd te houden. Dien 20 mg/kg cefalexine intramusculair toe als anti-infectieus middel.</li>
	<li>Maak een huidincisie van 3-4 cm die inferieur is aan het sleutelbeen, splits het deltopectorale interval met een chirurgisch scalpel nr. 11 en trek het terug om toegang te krijgen tot de schouder (Figuur 1A,B).</li>
	<li>Om de SSC-spierpeeseenheid te lokaliseren, identificeert u eerst de coracobrachialis-spier (als weefsel dat de SSC-peesaanhechting bedekt) en splitst u deze. Identificeer vervolgens de SSC-pees en plaats een haakse klem om de hele SSC-pees bloot te leggen bij het inbrengen op de kleinere tuberositas van het opperarmbeen (Figuur 1C).</li>
	<li>Isoleer de SSC-spierpees (Figuur 1D) en dien intraoperatieve verdoving (0,2 mg/kg 0,5% bupivacaïne) lokaal toe in de buurt van de transsectieplaats voordat u het letsel inbrengt. Wikkel de SSC-spierpeeseenheid in penroseslangen op siliconenbasis (Figuur 1E) om ongewenste hechting aan de omliggende weefsels te voorkomen en het daaropvolgende ophalen van weefsel te vergemakkelijken.</li>
	<li>Om letsel te veroorzaken, maakt u een doorsnede over de volledige dikte bij de spier-peesovergang met behulp van een chirurgisch scalpel nr. 11 (Figuur 1F). Stop waar nodig het bloeden door druk uit te oefenen met een gaasje en gebruik indien nodig zoutoplossing om de wond te irrigeren.</li>
	<li>Om de wond te sluiten, gebruikt u een 4-0 polyglycolzuur (PGA) hechting om het deltaspierweefsel opnieuw te benaderen (Figuur 1G) en een 4-0 nylon hechting om de huidwond te sluiten (Figuur 1H).</li>
	<li>Bied postoperatieve zorg door subcutane toediening van 0,03 mg/kg buprenorfine als pijnstiller (eenmaal direct na de operatie en tweemaal daags gedurende de volgende 48 uur29).</li>
	<li>Laat de konijnen herstellen op een afgedekt verwarmingskussen en breng een zachte halsband aan om ongewenst gedrag te voorkomen, waaronder zelfverminking, likken van operatieplaatsen en verwijderen van hechtingen (Figuur 1I).</li>
	<li>Houd de dieren in de gaten op gewichts- en gedragsveranderingen. Meld elke afname van meer dan 10% lichaamsgewicht en ernstige pijn die niet onder controle kan worden gehouden (beoordeeld op basis van vijf gedragsacties: orbitale verstrakking, afvlakking van de wangen, veranderingen in de vorm van het neusgat, veranderingen in de positie van de snorharen en veranderingen in de vorm en positie van het oor) aan de dierenarts om te bepalen of interventie zoals vroege euthanasie nodig is.</li>
</ol>2. Specimen oogst
<ol><li>Euthanaseer de konijnen na 4 weken vanaf het moment van verwonding. Verdoof de konijnen en geef een dodelijke dosis natriumpentobarbital (meer dan 60 mg/kg). Bevestig de dood door thoracotomie.</li>
	<li>Identificeer de humeruskop en snijd deze operatief weg, met behoud van de grote en kleine knobbeltjes en alle aanhechtingen van zacht weefsel. Fixeer met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 72 uur bij 4 °C alvorens over te brengen naar een oplossing van 10% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gedurende 1 maand bij kamertemperatuur (met mediawissel om de 72 uur) om het bot te ontkalken.</li>
	<li>Onderwerp de monsters na ontkalking aan standaard histologische verwerking met behulp van graduele ethanoldehydratie, paraffine-inbedding, histologische doorsnede (8 μm-secties) en kleuring met hematoxyline en eosine (H&E) en Masson's trichrome oplossingen30,31,32.</li>
	<li>Leg beelden vast met een rechtopstaande microscoop met een vergroting van 10x.</li>
	<li>Voer semi-kwantificering uit van de H&E- en Masson's trichrome beelden door de oppervlakte en het percentage spieren, vezelig weefsel en vet in de spier te meten, zoals eerder beschreven33,34 met behulp van grafische ontwerpsoftware naar keuze. In dit voorbeeld wordt Adobe Photoshop-software (https://www.adobe.com) gebruikt.<ol><li>Selecteer een gebied met een bepaalde kleur dat een bepaald weefseltype vertegenwoordigt met behulp van de toverstaf (rood is spierweefsel, blauw is fibrose en wit staat voor vet).</li>
		<li>Klik op de menu-items Selecteren | Omkeren | Selectie opslaan | Geef de sectie een naam.</li>
		<li>Tel het aantal pixels binnen het gemarkeerde gebied door te klikken op menu-items Venster | Meting Logboek | Meting opnemen om deze pixelwaarden vast te leggen en handmatig het percentage van de geselecteerde weefseltypen te berekenen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Statistische analyse
<ol><li>Voor histologische gegevens voert u de statistische analyse uit met behulp van de analytische software van uw keuze. Voer een t-toets van een student uit voor de vergelijking van twee onafhankelijke steekproeven tussen de controlegroep en de geblesseerde groep.</li>
	<li>Druk de gegevens uit als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. Beschouw een p-waarde van <0,05 als statistisch significant.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te melden.

Een reproduceerbaar en fysiologisch relevant diermodel biedt de mogelijkheid om het begrip van de pathogenese van ziekten te vergroten, de resultaten van klinische therapieën te evalueren en chirurgische behandelingen te verbeteren en verder te ontwikkelen35. In deze studie werd een betrouwbaar en nauwkeurig SSC-model voor konijnen vastgesteld dat aspecten van de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie nabootst. RC-tranen zijn gerelateerd aan progressieve en waarschijnlijk onomkeerbare spierdegeneratieve veranderingen, wat resulteert in een verminderd genezingspotentieel. Ko et al. toonden bijvoorbeeld aan dat de hernieuwde hechting van konijnen-SSP na 6 weken de spieratrofie of FD in de volgende 6 weken niet omkeerde. Dergelijke FD-gemedieerde spieratrofie beïnvloedt verschillende belangrijke klinische parameters, waaronder peesspierkracht en gewrichtsbewegingsbereik, die de chirurgische resultaten kunnen beïnvloeden36,37.
Het hier vastgestelde protocol vertoonde significante chronisch-achtige kenmerken na de doorsnede van SSC-spierpeeseenheden. In het bijzonder omvatten deze veranderingen een zichtbaar verminderde spiermassa en een verhoogd vetgehalte en fibrotisch weefsel (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4). Deze bevindingen komen overeen met degeneratieve veranderingen die zijn gerapporteerd in menselijke RC-tranen38. In de afgelopen jaren is de rat naar voren gekomen als een van de meest intensief bestudeerde diermodellen voor RC-ziekte en -letsel vanwege de hoge anatomische overeenkomsten met zowel menselijke als rat SSP's die onder het acromion38,39,40 reizen. Er moet echter worden opgemerkt dat het deel van de SSP van de rat dat onder de acromiale boog doorgaat, gespierd is in tegenstelling tot peesvormig, wat het geval is bij mensen41. Het belangrijkste is dat Barton et al. een gebrek aan significante vetophoping herkenden na SSP-peesloslating bij ratten23, wat in contrast staat met de menselijke conditie42. Als zodanig wordt aangenomen dat het SSC-complex van het konijn een geschikt model kan bieden om de chronische RC-scheur van mensen na te bootsen.
Om de reproduceerbaarheid van dit model te garanderen, zijn twee punten het vermelden waard bij het uitvoeren van dit protocol. Ten eerste kan na de doorsnede van spier-peeseenheden het vrije uiteinde van de doorgesneden pees het risico lopen verklevingen te vormen, waardoor het ophalen van de pees moeilijk kan worden voor latere manipulaties. Om dit probleem te voorkomen, werd een niet-resorbeerbare siliconenslang gebruikt om het vrije uiteinde van de spier-peesovergang na doorsnede te omwikkelen om spontane adhesie aan omliggende weefsels en spontane genezing te voorkomen (Figuur 1E). Verder kan de doorgesneden spier-peeseenheid tijdens een tweede interventieprocedure (d.w.z. om een veilige reparatie uit te voeren; gegevens niet getoond) duidelijk worden geïdentificeerd door het uiteinde van gewonde weefsels in te pakken op het moment van de eerste operatie. Deze techniek is economisch, effectief en kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in de chirurgie43. Ten tweede zijn konijnen een zeer gevoelige soort die na een operatie schadelijk gedrag kan vertonen. Om dergelijke problemen te voorkomen, wordt het ten zeerste aanbevolen om ook een zachte kraag aan te brengen om ongewenst gedrag te voorkomen, waaronder zelfverminking, likken van operatieplaatsen en verwijderen van hechtingen (Figuur 1I). In vergelijking met commercieel conventionele E-halsbanden die zijn gemaakt van hard plastic, veroorzaakte de zelfgemaakte zachte halsband geen huidletsel of andere bijwerkingen die het dierenwelzijn of de kwaliteit van wetenschappelijk onderzoek beïnvloedden. Samen zijn dergelijke stappen van cruciaal belang om een nauwkeurig reproduceerbaar RC-verwondingsmodel voor konijnen te creëren en de mogelijkheid te bieden om de regeneratieve reparatiestrategieën te bestuderen.
Om de pathofysiologie en genezing van pezen in een diermodel te bestuderen, moet een duidelijk en reproduceerbaar letsel worden gecreëerd en moeten de studietijdstippen zorgvuldig worden geselecteerd. De overgrote meerderheid van de onderzoeken naar peesletsel en genezing is uitgevoerd op volledig doorgesneden pezenvan dieren 44, aangezien transsectie een eenvoudige procedure is die zeer reproduceerbaar is en het klinische scenario adequaat kan simuleren45,46. Huegel et al. toonden aan dat de verwonding van een gedeeltelijk doorgesneden pees minder ernstig was dan die van een volledig doorgesneden pees, en immobilisatie had een nadelig effect op de peesmechanica, waaronder verhoogde gewrichtsstijfheid47. Om de atrofie en FD te evalueren die wordt gezien in de setting van massieve RC-scheur, is het essentieel om de experimenteel waargenomen karakteristieke tijdstippen te definiëren. Gupta et al. hebben een RC-verwondingsmodel gevalideerd bij het mannelijke konijn en spieratrofie waargenomen op tijdstippen van 2 en 6 weken, met een verhoogd vetgehalte op latere tijdstippen (minder dan 5% vetgehalte na 2 weken versus meer dan 10% vetgehalte na 6 weken), consistent met het pathologische proces dat wordt waargenomen bij menselijke RC-tranen11. In deze studie werd een enorme RC-scheur gecreëerd door transsectie van de SSC-spier-peeseenheid bij mannelijke en vrouwelijke konijnen gedurende 4 weken, wat resulteerde in SSC-spier FD (36,5% vetgehalte). Een tijdspunt van 4 weken is dus geschikt voor het genereren van SSC-spier FD bij mannelijke en vrouwelijke witte konijnen uit Nieuw-Zeeland.
Er zijn verschillende beperkingen aan deze studie. Deze omvatten: (i) stappen die verband houden met het genereren van diermodellen, zoals een relatief kort tijdspunt en mogelijk inflammatoire materialen (penroseslangen op siliconenbasis) voor het genereren van chronisch letsel; ii) karakterisering en analyse van diermodellen, zoals het ontbreken van loopanalyse en elektromyografie om de kinematica van de gewrichten en de contractiele krachtopwekking van de spieren te beoordelen; en (iii) vergelijking van diermodellen, zoals het ontbreken van vergelijking met andere RC-verwondingslocaties.
In termen van modelgeneratie gaat het bij menselijke RC-letsels meestal om progressieve atrofie en FD die over een periode van meerdere jaren kunnen optreden, wat relatief langer is dan het hier gerapporteerde tijdspunt van 4 weken. Dit wordt acceptabel geacht, aangezien een diermodel dat in relatief korte tijd ongeveer 36,5% intramusculair vet genereert, logistiek handig zal zijn en indien nodig kan worden verlengd. Bovendien is de biocompatibiliteit van implantaten op siliconenbasis, zoals penrose-slangen, een bron van langdurige controverse geweest vanwege meldingen van cellulaire immuunrespons en ontsteking47; daarom kan een alternatief inert materiaal, zoals polyethyleenglycol (PEG), worden vervangen door het omwikkelen van de gereseceerde pees als ontstekingsgerelateerde RC-onderzoeken worden uitgevoerd.
Wat de karakterisering en analyse van diermodellen betreft, kan het ontbreken van loopanalyse49 en elektromyograafstudies50 de bevindingen van het onderzoek beperken tot kwalitatieve histologische gegevens. Deze aspecten kunnen in toekomstige studies worden aangepakt door gebruik te maken van videobewegingsanalyse51 en oppervlakte-elektromyografie50 om kwantitatieve gegevens te genereren over schouderkinematica en RC-spierprestaties.
In termen van modelvergelijking, aangezien de SSP- en infraspinatus-pezen bij konijnen ook op grote schaal zijn gebruikt voor RC-studies, zal het vergelijken van de ernst van de verwonding, inclusief FD tussen deze verschillende letselplaatsen in de toekomst, aanvullende plaatsen identificeren voor modeloptimalisatie.
Samenvattend heeft deze studie een protocol ontwikkeld voor het modelleren van chronisch-achtige RC-verwondingen bij mannelijke en vrouwelijke konijnen. Dit model is handig voor onderzoekers vanwege de eenvoud (transsectie) en de relatief korte periode om chroniciteit te induceren (4 weken) en tegelijkertijd een grote mate (36,5%) van intramusculaire FD te genereren. Als zodanig wordt verwacht dat dit protocol onderzoekers zal helpen bij de studie van RC-pathofysiologie, en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor spier-peesherstel en -regeneratie zal vergemakkelijken.

Chronische scheuren in de rotator cuff (RC) worden gekenmerkt door degeneratieve veranderingen in spieren en pezen, waaronder atrofie van spieren, ophoping van vetweefsel en fibrose, wat de uitkomst van RC-herstel in gevaar kan brengen en uiteindelijk schouderpijn en disfunctie kan veroorzaken 1,2,3,4,5 . Om de pathogenese van RC-scheuren beter te begrijpen en de chirurgische resultaten te verbeteren, is het van cruciaal belang om geschikte diermodellen te ontwikkelen die aspecten van de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie kunnen nabootsen. In het bijzonder moeten RC-letselmodellen aan de volgende criteria voldoen: (i) geen spontane genezing na letsel; ii) een significante aanwezigheid van fibrose, spieratrofie en ophoping van vetweefsel bevatten; en iii) voldoende groot zijn om de chirurgische technieken die bij de mens worden gebruikt te kunnen benaderen6.
Binnen deze context kan de musculus van het konijn subscapularis (SSC) worden gebruikt als een nauwkeurig en betrouwbaar diermodel voor de studie van RC-pathofysiologie, gezien zijn unieke anatomie, pathofysiologische respons en biomechanische eigenschappen7. De anatomie van de SSC RC van konijnen is inderdaad vergelijkbaar met de menselijke supraspinatus (SSP) RC, de spier-peeseenheid die het vaakst wordt geassocieerd met letsel als gevolg van overmatig gebruik 8,9. In het bijzonder gaat het SSC-peescomplex van het konijn door een benige tunnel en onder de musculus coracobrachialis, wat analoog is aan de situatie bij mensen waarbij het SSP-peescomplex door de subacromiale benige tunnel en onder het coracoacromiale ligament7 gaat. Deze anatomische gelijkenis leidt ertoe dat de SSC van het konijn vergelijkbare musculoskeletale bewegingen ondergaat als de menselijke SSP, waarbij de pees onder het acromion beweegt tijdens het optillen en abducteren van het opperarmbeen 7,10.
Bovendien zijn pathohistologische veranderingen, vergelijkbaar met menselijke RC-tranen11, waargenomen bij het konijn na SSC-scheur. In het bijzonder ondergaat de spierbuik ernstige FD, met een aanzienlijk verlies van spiermassa, een verminderd spiervezelgebied in dwarsdoorsnede en een verhoogde adipositas. Bovendien beoordeelden Otarodifard et al. de biomechanische kenmerken van de SSC van het konijn na (1) enkelrijige, (2) dubbele rij en (3) transossale-equivalente RC-reparatietechnieken, en ontdekten dat de initiële biomechanische kenmerken van deze reparaties vergelijkbaar waren met menselijke SSP RC-reparaties uitgevoerd in kadaverspecimens12. Als zodanig maakt de anatomische, fysiologische en biomechanische gelijkenis van konijnen-SSC met menselijke SSP het nuttig voor het modelleren van RC-verwondingen.
Hoewel veel diersoorten, waaronder ratten, muizen, honden en schapen, zijn gebruikt bij de studie van RC-ziekte en -herstel 6,13,14,15, is de mate van chroniciteit van letsel een belangrijke overweging. Dit komt omdat RC-tranen asymptomatisch kunnen zijn en vaak veel later kunnen worden gediagnosticeerd wanneer de scheur is vergroot en chronisch van aard is geworden, waarbij zowel de pees als de spier ernstige degeneratie vertonen16,17,18. De meeste RC-reparatiemodellen maken echter gebruik van acute blessuremodellen, waarbij de gezonde pees wordt doorgesneden en vervolgens onmiddellijk wordt gerepareerd 19,20,21,22. Dit gebeurt grotendeels om redenen van logistieke opportuniteit en technisch gemak, wat resulteert in weinig studies die de pathofysiologie van RC onderzoeken binnen een chronisch-achtige setting. Bovendien kunnen verschillende diermodellen eigenschappen bezitten die het gebruik ervan voor chronische RC-studies belemmeren.
Hoewel de rat bijvoorbeeld op grote schaal is gebruikt om RC-scheuren en -interventies te modelleren, staat het ontbreken van significante vetophoping na letsel in contrast met de menselijke conditie, en zijn kleine formaat maakt herhaalde chirurgische ingrepen een uitdaging23. Verder, hoewel Gerber et al. de infraspinatus van schapen gebruikten om spieratrofie en FD na chronische RC-scheur24 te bestuderen, bestaat er enige anatomische ongelijkheid tussen de infraspinatus van schapen en menselijke SSP, evenals tal van logistieke uitdagingen voor het bestuderen en huisvesten van zo'n groot diermodel. Daarnaast ontwikkelden Gerber et al. een vertraagd RC-letselmodel bij schapen door de oppervlakkige kop van de infraspinatus-spier en -pees los te laten om de kenmerken van een chronische RC-scheur na te bootsen, en evalueerden vervolgens de werkzaamheid van verschillende reparatietechnieken op de pees na 4 tot 6 weken. Helaas had dit chronisch aandoende schapenmodel een beperking, in die zin dat het uiteinde van de losgelaten pees tijdens de tweede chirurgische ingreep niet meer te onderscheiden was van littekenweefsel25.
Coleman et al. ontwikkelden ook een chronisch RC-scheurmodel bij schapen door het doorgesneden peesuiteinde te bedekken met een synthetisch membraan op het moment van de eerste operatie, wat diffusie van voedingsstoffen mogelijk maakte en de vorming van littekenweefsel rond het gewonde weefsel efficiënt minimaliseerde, terwijl de discriminatie tussen de pees en het littekenweefsel werd verbeterd26. Ondertussen suggereerden Turner et al. dat een uitgestelde reparatie binnen 4 weken moet worden uitgevoerd, aangezien directe herbevestiging zelden gebeurt bij een massale peesretractie27. Samen hebben deze studies bijgedragen aan reproduceerbare en betrouwbare protocollen voor de succesvolle oprichting van een chronisch-achtig SSC RC-letselmodel voor konijnen.
In dit protocol wordt een chronisch-achtig RC-letselmodel bij konijnen vastgesteld na 4 weken, waarin pathologische veranderingen gerelateerd aan fibrose en FD-gemedieerde spieratrofie kunnen worden bestudeerd via histologische beoordelingen. Met name het omwikkelen van het vrije uiteinde van de spier-peesovergang met behulp van een penroseslang op siliconenbasis op het moment van de eerste operatie maakt een duidelijke identificatie van de RC-weefsels mogelijk tijdens de tweede chirurgische ingreep en vergemakkelijkt bijgevolg een veilige reparatie om RC-genezing te bestuderen met en zonder steigervergroting. Al met al kan een chronisch-achtig SSC-model voor konijnen de pathofysiologie van RC beter nabootsen en minimale technische en logistieke vereisten stellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

De pathofysiologie van de rotator cuff (RC) van konijnen kan leiden tot progressieve en zeer degeneratieve veranderingen in de bijbehorende musculatuur en pezen, wat een negatieve invloed heeft op klinisch relevante parameters, zoals kracht en terugtrekking van de spier-pees/myotendineuze eenheid, wat uiteindelijk leidt tot verlies van schouderfunctie en een negatieve invloed heeft op de resultaten van RC-herstel. Diermodellen die aspecten van de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie nabootsen, zijn cruciaal voor het bevorderen van het conceptuele begrip van de progressie van letsel en het ontwikkelen van effectieve weefselmanipulatie en op regeneratieve geneeskunde gebaseerde therapieën.
Binnen deze context is een rabbit subscapularis (SSC)-model geschikt vanwege (i) de anatomische gelijkenis met de menselijke supraspinatus (SSP) bot-pees-spiereenheid, de meest gewonde RC-plaats; ii) de pathofysiologische gelijkenis met de mens in termen van fibrose en spiervetdegeneratie (FD); en (iii) de geschiktheid voor chirurgische ingrepen. Daarom is het doel van deze studie om de chirurgische technieken voor het induceren van SSC RC-letsel te beschrijven. Kort gezegd omvat de procedure de isolatie van de SSC door de coracobrachialis-spier te identificeren, gevolgd door een transsectie over de volledige dikte bij de spier-peesovergang en het vrije uiteinde van de spier-peesovergang te omwikkelen met een penrose-slang op siliconenbasis om spontane herbevestiging te voorkomen. Histologische evaluaties worden uitgevoerd om de progressie van spier-FD 4 weken na de operatie te volgen met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) en de trichrome kleuring van Masson.
Verlies van spieren en FD waren duidelijk 4 weken na transsectie van de SSC-spier-peesovergang, vergelijkbaar met pathofysiologische omstandigheden bij de mens. Dit protocol demonstreert de stappen voor het succesvol opzetten van een chronisch-achtig SSC RC-letselmodel voor konijnen, dat kan dienen als een krachtig hulpmiddel om skeletspierveranderingen geassocieerd met RC-pathofysiologie te bestuderen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor chronisch-achtige RC-tranen te ondersteunen.

Om de chroniciteit van RC-pathologie na de transsectie van SSC-spierpeeseenheden te beoordelen, werden de algehele weefselmorfologie en cellulaire veranderingen gekarakteriseerd via grove evaluatie en histologische analyse (respectievelijk H&E en Masson's trichrome kleuring), 4 weken na de blessure (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4). Representatieve beelden van de morfologie van grof weefsel toonden het verschijnen van wit vetachtig weefsel in gewonde SSC-spieren, dat afwezig was in de controlegroep (Figuur 2). H&E-kleuring bevestigde verlies van spiercellulariteit en -organisatie, dat werd vervangen door grote aantallen adipocyten (lege ruimtes omgeven door dunne randen van cytoplasma die samengedrukte kernen bevatten) in gewonde SSC-spieren ten opzichte van de controlegroep (Figuur 3A).
Semi-kwantitatieve beoordeling van H&E-beelden toonde een hoge mate van intramusculaire adipocyten in geblesseerde SSC-spieren (36,5% ± 8,5%) in vergelijking met de controlegroep (0,69% ± 0,18%) (Figuur 3B). De trichrome kleuring van Masson bevestigde ook spieratrofie en ongeorganiseerde collageenvezelarrangementen in geblesseerde SSC-spieren ten opzichte van de controlegroep (Figuur 4A). Semi-kwantitatieve beoordeling van de trichrome beelden van Masson toonde een vermindering van de spiercellulariteit voor geblesseerde SSC-spieren (41,3% ± 2,6%) ten opzichte van de controlegroep (99,2% ± 0,16%) (Figuur 4B). Hoewel verdere semi-kwantitatieve beoordeling geen significant verschil liet zien voor de vorming van fibrotisch weefsel tussen gewonde SSC-spieren (22,3% ± 13,1%) en de controlegroep (0,07% ± 0,05%), werd een hoge mate van fibrose waargenomen in geblesseerde SSC-spieren (Figuur 4C). Samen toonden grove weefselmorfologie en histologische analyse aan dat gewonde SSC-spierpees van konijnen ernstige spieratrofie, vetophoping en fibrose vertoonde, die bekende kenmerken zijn van chronische RC-pathofysiologie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> Figuur 1: Chirurgische ingreep voor chronisch-achtig SSC spier-peesblessuremodel. (A) Er werd een chirurgisch venster gemaakt en anatomische oriëntatiepunten zoals het opperarmbeen, de humeruskop en het sleutelbeen werden geïdentificeerd door palpatie. (B) Een incisie in de huid van 3,0 cm werd inferieur gemaakt aan het sleutelbeen. (C) De musculus coracobrachialis werd gespleten om de SSC-spier bloot te leggen. (D) De SSC-spierpeeseenheid werd geïsoleerd. (E) Een penrosedrain op siliconenbasis werd gebruikt om het SSC-spier-peesweefsel in te pakken. (F) De SSC-spierpees werd doorsneden. (G) De musculus coracobrachialis werd opnieuw benaderd met behulp van PGA-hechtingen. (H) De huidincisie werd gesloten met nylon hechtingen. (I) Na de operatie kregen de konijnen een zachte halsband om te dragen. Afkortingen: SSC = subscapularis; PGA = polyglycolzuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> Figuur 2: Bruto morfologie van representatieve SSC-spieren. Zwarte pijlen staan voor wit vetweefsel. Afkorting: SSC = subscapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> Figuur 3: Histologische analyse van chronisch-achtig RC-letselmodel na 4 weken. (A) Representatieve H&E-gekleurde histologiebeelden toonden atrofische spiervezels en accumulatie van adipocyten. (B) Kwantificering van het accumulatiepercentage van geblesseerd spiervet. n = 3 konijnen. Foutbalken geven SEM aan. *, statistisch significant (p≤ 0,05). Schaalbalken = 5.000 μm (A, linkerkolom), 600 μm (A, rechterkolom). Afkortingen: SSC = subscapularis; RC = rotator manchet; H&E = hematoxyline en eosine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> Figuur 4: Histologische analyse van chronisch-achtig RC-letselmodel na 4 weken. (A) De trichroom gekleurde beelden van Masson toonden substantiële fibrose. Vezelig bindweefsel is blauw gekleurd. (B) Kwantificering van het aandeel spierweefsel en (C) fibrotisch weefsel. n = 3 konijnen. Foutbalken geven SEM aan. *, statistisch significant (p≤ 0,05). Schaalbalken = 5.000 μm (A, linkerkolom), 200 μm (A, rechterkolom). Afkortingen: SSC = subscapularis; RC = rotator manchet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

Deze studie beschrijft procedures voor het vaststellen van een chronisch vergelijkbaar letsel aan de rotator cuff (RC) van konijnen. In het bijzonder wordt de verwonding gecreëerd in de subscapularis (SSC) spierpees/myotendineuze eenheid om de menselijke RC-anatomie en pathofysiologie na te bootsen, inclusief ernstige spiervetdegeneratie (FD). Dit protocol kan worden toegepast om RC-letsels te bestuderen en regeneratieve therapieën te beoordelen.

Ontwikkeling van een chronisch model voor rotator cuff-letsel bij konijnen voor de studie van fibrose en spierdegeneratie

Rabbit rotator cuff (RC) pathophysiology can lead to progressive and highly degenerative changes in its associated musculature and tendons, which ...

Dit protocol demonstreert een complexe chirurgische techniek voor het induceren van een chronisch letsel aan de rotator cuff bij konijnen, en is nuttig bij het bestuderen van de pathogenese van de rotator cuff en het ontwikkelen van regeneratieve therapieën. Konijnen zijn middelgrote tot grote diermodellen die logistiek gemakkelijk te huisvesten zijn, chirurgisch te manipuleren zijn en hoge niveaus van rotator cuff spiervetdegeneratie vertonen wanneer ze gewond raken, vergelijkbaar met mensen. Het hier getoonde subscapularis-letselmodel is anatomisch analoog aan het supraspinatus-botpeesspiercomplex, een van de meest gewonde rotator cuff-eenheden.Bereid om te beginnen het chirurgische venster voor door de beoogde incisieplaats van een verdoofd konijn te scheren. Reinig het gebied met wattenstaafjes met drie afwisselende toepassingen van Betadine en 70% alcohol in cirkelvormige bewegingen. Dien 20 milligram per kilogram cefalexine intramusculair toe als profylactisch anti-infectiemiddel.Maak een huidincisie van drie tot vier centimeter die inferieur is aan het sleutelbeen, splits het deltopectorale interval met een schaar en trek het in om toegang te krijgen tot de schouder. Om de peeseenheid van de subscapularis-spier te lokaliseren, identificeert u eerst de musculus coracobrachialis. Identificeer vervolgens de pees subscapularis en plaats een haakse klem om de hele pees bloot te leggen bij het inbrengen op de kleine tuberositas van het opperarmbeen.Isoleer de pees van de subscapularis-spier. Na toediening van een preoperatieve pijnstiller lokaal in de buurt van de doorsnijdingsplaats, wikkelt u de subscapularis-spierpeeseenheid in penroseslangen op siliconenbasis om ongewenste hechting aan de omliggende weefsels te voorkomen en het daaropvolgende ophalen van weefsel te vergemakkelijken. Om letsel op te wekken, maakt u een doorsnede over de volledige dikte bij de spierpeesovergang met behulp van een chirurgisch scalpel nummer 11.Stop waar nodig het bloeden door druk uit te oefenen met een gaasje en gebruik indien nodig zoutoplossing om de wond te irrigeren. Om de wond te sluiten, gebruikt u een 4-0 polyglycolzuurhechting om het deltaspierweefsel opnieuw te benaderen en een 4-0 nylon of zijden hechting om de huidwond te sluiten, gevolgd door wondreiniging. Dien 0,03 milligram per kilogram buprenorfine subcutaan toe als pijnstiller eenmaal direct na de operatie en tweemaal daags gedurende de volgende 48 uur.De histologische analyse van het chronisch-achtige rotator cuff letselmodel na vier weken is weergegeven in deze figuur. De H&E-kleuring bevestigde het verlies van spiercellulariteit en -organisatie, dat werd vervangen door grote aantallen adipocyten in gewonde subscapularis-spieren ten opzichte van de controlegroep. De kwantificering van het percentage gewonde spiervetaccumulatie wordt weergegeven in deze figuur.De trichrome kleuring van Masson bevestigde ook spieratrofie en ongeorganiseerde collageenvezelarrangementen in gewonde subscapularis-spieren ten opzichte van de controlegroep. De kwantificering van het aandeel spier- en fibrotisch weefsel wordt weergegeven in deze figuur. De beoordeling toonde een vermindering van de spiercellulariteit voor geblesseerde subscapularis-spieren ten opzichte van de controlegroep.Een hoge mate van fibrose werd ook waargenomen bij gewonde subscapularis-spieren. Het identificeren van de subscapularispees en het omwikkelen van de peeseenheid van de subscapularis-spier in penrose-slangen zijn de belangrijkste stappen van deze procedure. Na deze procedure kan een therapeutische interventie worden toegepast.In dit geval kunnen de hier beschreven analyses, samen met aanvullende myografie of loopanalyse, worden gebruikt om de uitkomst van de interventie te beoordelen. Deze techniek is cruciaal om onderzoekers te helpen bij de studie van de pathofysiologie van de rotator cuff en om de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor herstel en regeneratie van spierpezen te vergemakkelijken.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Intraveneuze micro-injecties van de zebravis Larven tot acute nierschade Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...