Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

המחקר של דאי פיי אלמר קר נתמך על ידי מימון מלשכת המזון והבריאות, הונג קונג SAR (קרן בריאות רפואית ומחקר: 08190466), ועדת חדשנות וטכנולוגיה, הונג קונג SAR (פרס דרגה 3: ITS/090/18; תוכנית Health@InnoHK), מועצת מענקי המחקר של הונג קונג, הונג קונג SAR (פרס תוכנית הקריירה המוקדמת: 24201720 וקרן המחקר הכללית: 14213922), והאוניברסיטה הסינית של הונג קונג (פרס חדשנות פקולטית: FIA2018/A/01). המחקר של דן וואנג נתמך על ידי מימון מלשכת המזון והבריאות, הונג קונג SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), ועדת החדשנות והטכנולוגיה, הונג קונג SAR (פרס Tier 3: ITS/333/18; תוכנית Health@InnoHK), ומועצת מענקי המחקר של הונג קונג, הונג קונג SAR (קרן מחקר כללית: 14118620 ו 14121121).

כל ההליכים חייבים להתבצע בטכניקה כירורגית סטרילית בחדר מאובזר המתאים לניתוחים בבעלי חיים על פי פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של המכון. במחקר הנוכחי, ניתוחי ארנבים בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הסינית של הונג קונג.
1. הליך כירורגי
<ol><li>כדי להכין את אזור הניתוח, לחמם מראש כרית חימום ולכסות אותו עם וילונות כירורגיים סטריליים כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של הארנב. לאחר מכן, הניחו כלים וציוד כירורגי מעוקר (כמפורט בטבלת החומרים) וארגנו אותם בהתאם להעדפת המנתח.</li>
	<li>השראת הרדמה באמצעות מתן תוך שרירי של 35 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קסילזין לארנבים לבנים בניו זילנד (במשקל שבין 3.5 ל-4.5 ק"ג, כבני 5-6.5 חודשים; במחקר זה נעשה שימוש בשני ארנבים זכרים ונקבה אחת). לאחר מכן, יש לאשר את ההרדמה בבדיקת צביטת כפות ו/או זנב.</li>
	<li>אם נדרשת הרדמה נוספת כדי לקיים את המישור הניתוחי, יש לתת 10 מ"ג/ק"ג קטמין ו-3 מ"ג/ק"ג קסילזין דרך וריד האוזן השולי28 ולעקוב אחר קצב הנשימה של בעל החיים בפרקי זמן קבועים של 5-10 דקות.</li>
	<li>להכנת חלון הניתוח, יש לגלח את אזור החתך המיועד (אזור העור שטחי ליחידת שריר-גיד SSC) ולנקות עם שלושה מריחה לסירוגין של בטאדין ו-70% אלכוהול. השתמשו במקלון צמר גפן כדי למרוח בטאדין ו-70% אלכוהול בתנועות סיבוביות (מבפנים לחוץ). השתמש משחת עיניים כדי לשמור על העיניים של הארנב לח ומשומן. יש לתת 20 מ"ג/ק"ג צפלקסין תוך שרירית כחומר אנטי זיהומי.</li>
	<li>בצעו חתך עור בקוטר 3-4 ס"מ נחות מעצם הבריח, פצלו את המרווח הדלטופקטורלי באמצעות אזמל כירורגי מס' 11, ונסוגו לאחור כדי לקבל גישה לכתף (איור 1A,B).</li>
	<li>כדי לאתר את יחידת שריר-גיד SSC, ראשית, יש לזהות את שריר הקוראקוברכיאליס (כרקמה המכסה את חיבור גיד SSC) ולפצל אותו. לאחר מכן, זהו את גיד ה-SSC, והכניסו מהדק ישר-זווית כדי לחשוף את כל גיד ה-SSC בעת החדרתו על הטוברוזיות הפחותות של עצם הזרוע (איור 1C).</li>
	<li>לפני תחילת הפציעה, בודדו את גיד-שריר SSC (איור 1D) ובצעו הרדמה תוך ניתוחית (0.2 מ"ג/ק"ג של 0.5% bupivacaine) באופן מקומי ליד אתר הטרנסקציה. עטפו את יחידת גיד השריר SSC בצינורות פנרוז מבוססי סיליקון (איור 1E) כדי למנוע היצמדות לא רצויה לרקמות שמסביב ולסייע בשאיבת הרקמה לאחר מכן.</li>
	<li>כדי לגרום לפציעה, צרו טרנסקציה בעובי מלא בצומת שריר-גיד באמצעות אזמל כירורגי מס' 11 (איור 1F). במידת הצורך, להפסיק את הדימום על ידי הפעלת לחץ עם חתיכת גזה ולהשתמש מלוחים כדי להשקות את הפצע לפי הצורך.</li>
	<li>כדי לסגור את הפצע, השתמשו בתפר של 4-0 חומצה פוליגליקולית (PGA) כדי לדמות מחדש את רקמת שריר הדלטואיד (איור 1G) ובתפר ניילון 4-0 כדי לסגור את פצע העור (איור 1H).</li>
	<li>לספק טיפול לאחר הניתוח באמצעות מתן תת עורי של 0.03 מ"ג / ק"ג buprenorphine כמו משכך כאבים (פעם אחת מיד לאחר הניתוח פעמיים ביום במשך 48 שעות29 הבא).</li>
	<li>אפשרו לארנבים להתאושש על כרית חימום מכוסה והשתמשו בקולר רך כדי למנוע התנהגות בלתי רצויה, כולל הטלת מום עצמי, ליקוק אתרי ניתוח והסרת תפרים (איור 1I).</li>
	<li>עקוב אחר בעלי החיים עבור משקל ושינויים התנהגותיים. דווחו לווטרינר על כל ירידה של יותר מ-10% במשקל הגוף ועל כאבים חמורים שאינם ניתנים לשליטה (מוערכים על סמך חמש פעולות התנהגותיות: הידוק מסלולי, השטחת לחיים, שינויים בצורת הנחיריים, שינויים במיקום השפם ושינויים בצורת האוזן ובמיקום) כדי לקבוע אם נדרשת התערבות כגון המתת חסד מוקדמת.</li>
</ol>2. קציר דגימות
<ol><li>הרדימו את הארנבים בגיל 4 שבועות מרגע הפציעה. מרדימים את הארנבים ונותנים מנה קטלנית של נתרן pentobarbital (יותר מ 60 מ"ג / ק"ג). לאשר מוות על ידי thoracotomy.</li>
	<li>לזהות את ראש ההומרל ולסלק אותו בניתוח, תוך שמירה על השחפיות הגדולות יותר ופחות וכל חיבורי הרקמות הרכות. תקן עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 72 שעות ב 4 ° C לפני המעבר לתמיסה של 10% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) במשך חודש אחד בטמפרטורת החדר (עם שינוי מדיה כל 72 שעות) כדי decalcize עצם.</li>
	<li>לאחר ההסתיידות, יש להעביר את הדגימות לעיבוד היסטולוגי סטנדרטי באמצעות התייבשות אתנול מדורגת, הטבעה פרפין, חתך היסטולוגי (חתכים של 8 מיקרומטר) וצביעה עם המטוקסילין ואאוסין (H&E) ותמיסות טריכרום30,31,32 של Masson.</li>
	<li>צלם תמונות עם מיקרוסקופ זקוף בהגדלה של פי 10.</li>
	<li>בצע כימות למחצה של תמונות הטריכרום של H&E ו- Masson על ידי מדידת השטח והאחוז של שריר, רקמה סיבית ושומן בתוך השריר, כפי שתואר קודם33,34 באמצעות תוכנת עיצוב גרפי לבחירה. בדוגמה זו, נעשה שימוש בתוכנת Adobe Photoshop (https://www.adobe.com).<ol><li>בחר אזור בצבע מסוים המייצג סוג רקמה מסוים באמצעות הכלי מטה הקסם (אדום הוא רקמת שריר, כחול הוא פיברוזיס ולבן מייצג שומן).</li>
		<li>לחץ על פריטי התפריט בחר | הפוך | שמור בחירה | תן שם לסעיף.</li>
		<li>ספירת מספר הפיקסלים באזור המסומן על-ידי לחיצה על פריטי תפריט חלון | יומן מדידות | הקלט מדידה כדי להקליט ערכי פיקסלים אלה, ולחשב ידנית את אחוז סוגי הרקמה שנבחרו.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>עבור נתונים היסטולוגיים, בצע את הניתוח הסטטיסטי באמצעות התוכנה האנליטית הנבחרת. בצע מבחן t של תלמיד להשוואה של שתי דגימות בלתי תלויות בין קבוצת הביקורת לבין קבוצת הנפגעים.</li>
	<li>בטא את הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. שקול ערך p של <0.05 כמובהק סטטיסטית.</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.

מודל בעל חיים הניתן לשחזור ורלוונטי פיזיולוגית מספק את היכולת לקדם את ההבנה של פתוגנזה של מחלות, להעריך את התוצאות של טיפולים קליניים, ולשפר ולפתח טיפולים כירורגיים35. במחקר זה נקבע מודל SSC ארנבי אמין ומדויק המחקה היבטים באנטומיה ובפתופיזיולוגיה של RC אנושי. דמעות RC קשורות לשינויים ניווניים שריריים מתקדמים וככל הנראה בלתי הפיכים, וכתוצאה מכך פוטנציאל ריפוי מופחת. לדוגמה, Ko et al. הראו כי חיבור מחדש של SSP ארנב לאחר 6 שבועות לא להפוך ניוון שרירים או FD ב 6 שבועות הבאים. ניוון שרירים בתיווך FD כזה משפיע על מספר פרמטרים קליניים חשובים, כולל כוח שריר הגידים וטווח התנועה של המפרקים, אשר עשויים להשפיע על תוצאות הניתוח36,37.
הפרוטוקול שנקבע כאן הראה תכונות כרוניות משמעותיות לאחר הטרנססקציה של יחידות שריר-גיד SSC. באופן ספציפי, השינויים האלה כוללים ירידה ניכרת במסת השריר ועלייה בתכולת השומן וברקמות הפיברוטיות (איור 2, איור 3 ואיור 4). ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם שינויים ניווניים שדווחו בדמעות RC אנושיות38. בשנים האחרונות, החולדה התגלתה כאחד המודלים הנחקרים ביותר בבעלי חיים עבור מחלת RC ופציעה בשל הדמיון האנטומי הגבוה שלה עם SSPs אנושיים וחולדות הנעים תחת אקרומיון38,39,40. עם זאת, יש לציין כי החלק של SSP חולדה אשר עובר מתחת לקשת אקרומיאלית הוא שרירי לעומת מגמתי, כפי שקורה בבני אדם41 . חשוב מכל, ברטון ועמיתיו זיהו חוסר בהצטברות שומן משמעותית לאחר ניתוק גיד SSP בחולדות23, העומד בניגוד למצב האנושי42. ככזה, הוא האמין כי קומפלקס SSC ארנב עשוי לספק מודל מתאים כדי לחקות את קרע RC כרוני של בני אדם.
כדי להבטיח את השחזור של מודל זה, שתי נקודות ראוי לציין בעת ביצוע פרוטוקול זה. ראשית, לאחר הטרנסקציה של יחידות שריר-גיד, הקצה החופשי של הגיד הטרנסקדטיבי עלול להיות בסיכון ליצירת הידבקויות, מה שיכול להפוך את שליפת הגידים למאתגרת עבור מניפולציות הבאות. כדי להימנע מהבעיה הזו, השתמשו בצינור סיליקון שאינו ניתן לספיגה כדי לעטוף את הקצה החופשי של צומת השריר-גיד לאחר טרנסקציה כדי למנוע הידבקות ספונטנית לרקמות שמסביב כמו גם ריפוי ספונטני (איור 1E). יתר על כן, ניתן לזהות בבירור את יחידת גיד השריר הטרנסקט במהלך הליך התערבות שני (כלומר, לבצע תיקון מאובטח; הנתונים אינם מוצגים) על ידי עטיפת קצה הרקמות הפגועות בזמן הניתוח הראשוני. טכניקה זו חסכונית, יעילה, וניתן ליישם אותה בקלות בניתוח43. שנית, ארנבים הם מין רגיש מאוד שעלול להפגין התנהגות מזיקה לאחר ניתוח. כדי להימנע מבעיות כאלה, מומלץ מאוד להשתמש גם בקולר רך כדי למנוע התנהגות לא רצויה, כולל הטלת מום עצמי, ליקוק אתרי ניתוח והסרת תפרים (איור 1I). בהשוואה לצווארונים אלקטרוניים קונבנציונליים מסחרית העשויים מפלסטיק קשיח, הצווארון הרך מייצור עצמי לא גרם לפגיעה בעור או לתופעות לוואי אחרות שהשפיעו על רווחת בעלי החיים או על איכות המחקר המדעי. יחד, צעדים כאלה הם קריטיים כדי ליצור מודל פציעת RC ארנב הניתן לשחזור מדויק ולספק את האפשרות ללמוד את אסטרטגיות התיקון הרגנרטיבי.
כדי לחקור פתופיזיולוגיה של גידים וריפוי במודל של בעלי חיים, יש ליצור פגיעה מובחנת וניתנת לשחזור, ולבחור בקפידה את נקודות הזמן של המחקר. הרוב המכריע של המחקרים על פגיעה בגידים וריפוי בוצעו על גידים בעלי חיים שעברו טרנסקטציה מלאה44, שכן טרנסקציה היא הליך פשוט שניתן לשחזר מאוד ויכול לדמות כראוי את התרחיש הקליני45,46. Huegel et al. הראו כי פציעה של גיד שעבר טרנסקטציה חלקית הייתה פחות חמורה מזו של גיד שעבר טרנסקטציה מלאה, ולאימוביליזציה הייתה השפעה מזיקה על מכניקת הגידים, כולל נוקשות מפרקים מוגברת47. כדי להעריך את הניוון ואת FD שנראה במצב של קרע RC מסיבי, חיוני להגדיר את נקודות הזמן האופייניות שנצפו בניסוי. גופטה ועמיתיו אימתו מודל פציעה RC בארנב הזכר והבחינו בניוון שרירים בנקודות זמן של שבועיים ושישה שבועות, עם תכולת שומן מוגברת בנקודות זמן מאוחרות יותר (פחות מ -5% תכולת שומן לאחר שבועיים לעומת יותר מ -10% תכולת שומן לאחר 6 שבועות), בהתאם לתהליך הפתולוגי שנצפה בדמעות RC אנושיות11. במחקר זה, נוצר קרע RC מסיבי על ידי טרנסקציה של יחידת גיד שריר SSC בארנבים זכרים ונקבות במשך 4 שבועות, מה שהביא לשריר SSC FD (תכולת שומן של 36.5%). לכן, נקודת זמן של 4 שבועות מתאימה ליצירת שריר SSC FD בארנבים לבנים בניו זילנד זכרים ונקבות.
קיימות מספר מגבלות למחקר זה. אלה כוללים: (i) שלבים הקשורים ליצירת מודלים של בעלי חיים, כגון נקודת זמן קצרה יחסית וחומרים דלקתיים פוטנציאליים (צינורות פנרוז מבוססי סיליקון) ליצירת פציעות כרוניות; (ii) אפיון וניתוח מודלים של בעלי חיים, כגון חוסר ניתוח הליכה ואלקטרומיוגרפיה להערכת קינמטיקה משותפת ויצירת כוח כיווץ שרירים; ו-(iii) השוואת מודלים של בעלי חיים, כגון חוסר השוואה לאתרי פגיעה אחרים של RC.
במונחים של יצירת מודל, פציעות RC אנושיות כוללות בדרך כלל ניוון מתקדם ו- FD שעלולים להתרחש בטווח של מספר שנים, שהוא ארוך יחסית מנקודת הזמן של 4 שבועות שדווחה כאן. זה נחשב מקובל, שכן מודל בעלי חיים המייצר סביב 36.5% שומן תוך שרירי בטווח זמן קצר יחסית יהיה נוח מבחינה לוגיסטית וניתן להאריך אותו במידת הצורך. יתר על כן, התאימות הביולוגית של שתלים מבוססי סיליקון, כגון צינורות פנרוז, הייתה מקור למחלוקת ארוכת שנים עקב דיווחים על תגובה חיסונית תאית ודלקת47; לכן, חומר אינרטי חלופי, כגון פוליאתילן גליקול (PEG), עשוי להיות מוחלף לעטיפת הגיד המנותח אם מחפשים מחקרי RC הקשורים לדלקת.
מבחינת אפיון וניתוח מודלים של בעלי חיים, היעדר ניתוח הליכה49 ומחקרי אלקטרומיוגרף50 עשויים להגביל את ממצאי המחקר לנתונים היסטולוגיים איכותיים. היבטים אלה עשויים להיות מטופלים במחקרים עתידיים באמצעות ניתוח תנועה וידאו51 ואלקטרומיוגרפיה פני השטח50 כדי ליצור נתונים כמותיים על קינמטיקה של הכתף וביצועי שרירי RC.
מבחינת השוואת מודלים, מכיוון שגידי SSP ואינפרא-ספינטוס בארנבים נמצאים בשימוש נרחב גם במחקרי RC, השוואת חומרת הפציעה, כולל FD בין אתרי פציעה שונים אלה בעתיד, תזהה אתרים נוספים לאופטימיזציה של המודל.
לסיכום, מחקר זה פיתח פרוטוקול למידול פציעות RC כרוניות בארנבים זכרים ונקבות. מודל זה נוח לחוקרים בשל פשטותו (טרנסקציה) ופרק זמן קצר יחסית להשראת כרוניות (4 שבועות) תוך יצירת מידה רבה (36.5%) של FD תוך שרירי. ככזה, פרוטוקול זה צפוי לסייע לחוקרים בחקר הפתופיזיולוגיה של RC, כמו גם להקל על פיתוח טיפולים חדשניים לתיקון והתחדשות שריר-גיד.

קרעים כרוניים בשרוול המסובב (RC) מאופיינים בשינויים ניווניים בשרירים ובגידים, כולל ניוון שרירים, הצטברות רקמת שומן ופיברוזיס, אשר יכולים לסכן את התוצאה של תיקון RC ובסופו של דבר לגרום לכאבים בכתף ולתפקוד לקוי 1,2,3,4,5 . כדי להבין טוב יותר את הפתוגנזה של דמעות RC ולשפר את תוצאות הניתוח, חיוני לפתח מודלים מתאימים של בעלי חיים שיכולים לחקות היבטים של אנטומיה ופתופיזיולוגיה של RC אנושי. באופן ספציפי, מודלים של פציעות RC צריכים לעמוד בקריטריונים הבאים: (i) חסר ריפוי ספונטני לאחר פציעה; (ii) להכיל נוכחות משמעותית של פיברוזיס, ניוון שרירים והצטברות של רקמת שומן; ו-(iii) להיות בגודל מתאים כדי לאפשר קירוב של טכניקות כירורגיות המשמשות בבני אדם6.
בהקשר זה, שריר הארנב subscapularis (SSC) יכול לשמש כמודל חייתי מדויק ואמין לחקר פתופיזיולוגיה RC, בהתחשב באנטומיה הייחודית שלו, התגובה הפתופיזיולוגית והתכונות הביומכניות שלו7. ואכן, אנטומיה של ארנב SSC RC דומה לאנטומיה של SUPRASPINATUS האנושי (SSP) RC, שהיא יחידת השריר-גיד הקשורה לרוב לפציעה הנובעת משימוש יתר 8,9. באופן ספציפי, קומפלקס גיד SSC ארנב עובר דרך תעלה גרמית מתחת שריר coracobrachialis, אשר מקביל למצב בבני אדם שבו קומפלקס גיד SSP עובר דרך התעלה הגרמית subacromial ומתחת הרצועה coracoacromial7. דמיון אנטומי זה גורם לכך שארנב SSC עובר תנועות שרירים ושלד דומות לאלה של SSP אנושי, בהן הגיד נע מתחת לאקרומיון במהלך הגבהה וחטיפה של ההומרוס 7,10.
יתר על כן, שינויים פתולוגיים, בדומה לקרעי RC11 אנושיים, נצפו בארנב לאחר קרע SSC. באופן ספציפי, בטן השריר עוברת FD חמור, עם אובדן משמעותי של מסת שריר, ירידה באזור חתך סיבי שריר, ושומן מוגבר. בנוסף, Otarodifard et al. העריכו את המאפיינים הביומכניים של SSC הארנב לאחר (1) שורה אחת, (2) שורה כפולה, ו (3) טכניקות תיקון RC שוות ערך transosseous, ומצאו כי המאפיינים הביומכניים הראשוניים של תיקונים אלה היו דומים לתיקוני SSP RC אנושיים שבוצעו בדגימות cadaveric12. ככזה, הדמיון האנטומי, הפיזיולוגי והביומכני של SSC ארנב עם SSP אנושי הופך אותו שימושי למידול פציעות RC.
למרות שמינים רבים של בעלי חיים, כולל חולדות, עכברים, כלבים וכבשים, שימשו בחקר מחלת RC ותיקון 6,13,14,15, מידת כרוניקת הפציעה היא שיקול מרכזי. הסיבה לכך היא שקרעי RC יכולים להיות א-סימפטומטיים ולעתים קרובות עשויים להיות מאובחנים הרבה יותר מאוחר כאשר הקרע גדל והפך כרוני בטבע, כאשר הן הגיד והן השריר מפגינים ניוון חמור16,17,18. עם זאת, רוב דגמי תיקון RC משתמשים במודלים של פציעה חריפה, שבהם מעבירים את הגיד הבריא ואז מתקנים אותו מיד 19,20,21,22. זה קורה בעיקר מסיבות של תועלת לוגיסטית וקלות טכנית, וכתוצאה מכך מחקרים מעטים הבוחנים את הפתופיזיולוגיה RC בסביבה כרונית. יתר על כן, מספר מודלים של בעלי חיים עשויים להיות בעלי תכונות המעכבות את השימוש בהם למחקרי RC כרוניים.
לדוגמה, למרות שנעשה שימוש נרחב בחולדה כדי למדל קרע RC והתערבות, היעדר הצטברות שומן משמעותית לאחר פציעה מנוגד למצב האנושי, וגודלה הקטן הופך הליכים כירורגיים חוזרים ונשנים למאתגרים23. יתר על כן, למרות שגרבר ועמיתיו השתמשו באינפרא-ספינטוס של כבשים כדי לחקור ניוון שרירים ו-FD לאחר קרע RC כרוני24, קיים שוני אנטומי מסוים בין אינפרא-ספינטוס של כבשים לבין SSP אנושי, כמו גם אתגרים לוגיסטיים רבים ללימוד ודיור של מודל בעלי חיים כה גדול. בנוסף, Gerber et al. פיתחו מודל של פגיעה מאוחרת ב-RC בכבשים על ידי שחרור הראש השטחי של השריר והגיד האינפרא-ספינטוס כדי לחקות את התכונות של קרע RC כרוני, ולאחר מכן העריכו את היעילות של טכניקות תיקון שונות על הגיד לאחר 4 עד 6 שבועות. למרבה הצער, מודל כבשה כרוני זה היה בעל מגבלה, בכך שקצה הגיד המשוחרר הפך לבלתי ניתן להבחנה מרקמת צלקת במהלך ההליך הכירורגי השני25.
קולמן ועמיתיו פיתחו גם מודל של קרע RC כרוני בכבשים על ידי כיסוי קצה הגיד הטרנסקטטיבי בקרום סינתטי בזמן הניתוח הראשוני, אשר איפשר דיפוזיה של חומרי מזון ומזער ביעילות היווצרות רקמת צלקת סביב הרקמה הפגועה, תוך שיפור ההבחנה בין הגיד לרקמת הצלקת26. בינתיים, טרנר ואחרים הציעו כי תיקון מושהה צריך להתבצע בתוך 4 שבועות, שכן חיבור מחדש ישיר קורה לעתים רחוקות בנסיגה מסיבית של גיד27. יחד, מחקרים אלה תרמו לפרוטוקולים ניתנים לשחזור ואמינים לביסוס מוצלח של מודל פציעה דמוי ארנב כרוני SSC RC.
בפרוטוקול זה, מודל פציעה RC דמוי ארנב כרוני נקבע לאחר 4 שבועות, שבו ניתן ללמוד שינויים פתולוגיים הקשורים לפיברוזיס וניוון שרירים בתיווך FD באמצעות הערכות היסטולוגיות. בפרט, עיטוף הקצה החופשי של צומת שריר-גיד באמצעות צינור פנרוז מבוסס סיליקון בזמן הניתוח הראשוני מאפשר זיהוי ברור של רקמות RC במהלך ההליך הכירורגי השני, וכתוצאה מכך, מאפשר תיקון בטוח ללמוד ריפוי RC עם וללא הגדלת פיגומים. בסך הכל, מודל SSC דמוי ארנב כרוני עשוי לחקות טוב יותר פתופיזיולוגיה RC ולהציב דרישות טכניות ולוגיסטיות מינימליות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

פתופיזיולוגיה של השרוול המסובב ארנב (RC) יכולה להוביל לשינויים מתקדמים וניווניים מאוד בשרירים ובגידים הקשורים אליו, אשר משפיעים לרעה על פרמטרים רלוונטיים מבחינה קלינית, כגון כוח ונסיגה של יחידת שריר-גיד/מיוטנדי, מה שבסופו של דבר גורם לאובדן תפקוד הכתף ומשפיע לרעה על תוצאות תיקון RC. מודלים של בעלי חיים המחקים היבטים של אנטומיה ופתופיזיולוגיה של RC אנושי חיוניים לקידום ההבנה המושגית של התקדמות פציעות ופיתוח הנדסת רקמות יעילה וטיפולים מבוססי רפואה רגנרטיבית.
בהקשר זה, מודל subscapularis ארנב (SSC) מתאים בשל (i) הדמיון האנטומי שלו ליחידת שריר העצם-גיד האנושית supraspinatus (SSP), שהיא אתר RC הפצוע ביותר; (ii) הדמיון הפתופיזיולוגי שלה לבני אדם במונחים של פיברוזיס וניוון שומן שרירים (FD); ו-(iii) התאמתו להליכים כירורגיים. לכן, מטרת מחקר זה היא לתאר את הטכניקות הכירורגיות לגרימת פציעת SSC RC. בקצרה, ההליך כולל בידוד של SSC על ידי זיהוי שריר coracobrachialis ואחריו טרנסקציה בעובי מלא בצומת שריר-גיד ועיטוף הקצה החופשי של צומת שריר-גיד עם צינור פנרוז מבוסס סיליקון כדי למנוע חיבור מחדש ספונטני. הערכות היסטולוגיות מבוצעות כדי לעקוב אחר התקדמות FD שריר ב 4 שבועות לאחר הניתוח באמצעות hematoxylin ו eosin (H&E) כמו גם צביעת טריכרום של Masson.
אובדן שריר ו-FD ניכרו 4 שבועות לאחר טרנסקציה של צומת שריר-גיד SSC, בדומה למצבים פתופיזיולוגיים של RC אנושי. פרוטוקול זה מדגים את השלבים לביסוס מוצלח של מודל פציעה דמוי ארנב SSC RC דמוי ארנב, שיכול לשמש ככלי רב עוצמה לחקר שינויים בשרירי השלד הקשורים לפתופיזיולוגיה של RC ולסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לקרעי RC דמויי כרוניקה.

כדי להעריך את הכרוניות של פתולוגיית RC בעקבות הטרנסקציה של יחידות שריר-גיד SSC, המורפולוגיה הכוללת של הרקמה והשינויים התאיים אופיינו באמצעות הערכה גסה וניתוח היסטולוגי (H&E וצביעת טריכרום של מאסון, בהתאמה), 4 שבועות לאחר הפציעה (איור 2, איור 3 ואיור 4). תמונות מייצגות של מורפולוגיה של רקמה גסה הראו הופעה של רקמה דמוית שומן לבן בשרירי SSC פגועים, שנעדרה בקבוצת הביקורת (איור 2). צביעת H&E אישרה אובדן של תאי שריר וארגון, אשר הוחלף במספר גדול של אדיפוציטים (חללים ריקים המוקפים בשוליים דקים של ציטופלסמה שהכילו גרעינים דחוסים) בשרירי SSC פגועים ביחס לקבוצת הביקורת (איור 3A).
הערכה כמותית למחצה של תמונות H&E הראתה רמה גבוהה של נוכחות אדיפוציטים תוך שריריים בשרירי SSC פגועים (36.5% ± 8.5%) ביחס לקבוצת הביקורת (0.69% ± 0.18%) (איור 3B). צביעת הטריכרום של מאסון גם אישרה ניוון שרירים וסידור לא מאורגן של סיבי קולגן בשרירי SSC פגועים ביחס לקבוצת הביקורת (איור 4A). הערכה כמותית למחצה של תמונות הטריכרום של מאסון הראתה ירידה בתאי השריר עבור שרירי SSC פגועים (41.3% ± 2.6%) ביחס לקבוצת הביקורת (99.2% ± 0.16%) (איור 4B). אף על פי שהערכה כמותית למחצה נוספת לא הראתה הבדל משמעותי בהיווצרות רקמות פיברוטיות בין שרירי SSC פגועים (22.3% ± 13.1%) לבין קבוצת הביקורת (0.07% ± 0.05%), נצפתה רמה גבוהה של פיברוזיס בשרירי SSC פגועים (איור 4C). יחד, מורפולוגיה גסה של רקמות וניתוח היסטולוגי הראו כי גיד שריר SSC של ארנב פצוע הפגין ניוון שרירים חמור, הצטברות שומן ופיברוזיס, שהם סימני ההיכר הידועים של פתופיזיולוגיה כרונית של RC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> איור 1: הליך כירורגי עבור מודל פציעה כרונית דמוית SSC שריר-גיד. (A) נוצר חלון ניתוחי וזוהו נקודות ציון אנטומיות כגון עצם הזרוע, ראש הומרל ועצם הבריח במישוש. (B) חתך בעור בקוטר 3.0 ס"מ נעשה נחות מעצם הבריח. (C) שריר הקוראקוברכיאליס פוצל כדי לחשוף את שריר ה-SSC. (D) בודדה יחידת שריר-גיד SSC. (E) נעשה שימוש בניקוז פנרוז מבוסס סיליקון כדי לעטוף את רקמת גיד השריר SSC. (F) גיד שריר-SSC עבר טרנסקטציה. (G) שריר הקוראקוברכיאליס עבר קירוב מחדש באמצעות תפרים PGA. (H) החתך בעור נסגר באמצעות תפרי ניילון. (I) לאחר הניתוח, הארנבים קיבלו צווארון רך ללבישה. קיצורים: SSC = subscapularis; PGA = חומצה פולי גליקולית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> איור 2: מורפולוגיה גסה של שרירי SSC מייצגים. חיצים שחורים מייצגים רקמות שומן לבנות. קיצור: SSC = subscapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> איור 3: ניתוח היסטולוגי של מודל פציעה RC דמוי RC כרוני לאחר 4 שבועות. (A) תמונות היסטולוגיה מוכתמות H&E מייצגות הראו סיבי שריר אטרופיים והצטברות של אדיפוציטים. (B) כימות אחוז הצטברות שומן בשריר פגוע. n = 3 ארנבים. קווי שגיאה מציינים SEM. *, מובהק סטטיסטית (p≤ 0.05). פסי קנה מידה = 5,000 מיקרומטר (A, עמודה שמאלית), 600 מיקרומטר (A, עמודה ימנית). קיצורים: SSC = subscapularis; RC = שרוול מסובב; H&E = hematoxylin ו eosin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> איור 4: ניתוח היסטולוגי של מודל פציעה RC דמוי כרוני לאחר 4 שבועות. (A) התמונות המוכתמות בטריכרום של מאסון הראו פיברוזיס משמעותי. רקמת חיבור סיבית מוכתמת בכחול. (B) כימות החלק היחסי של שריר ו-(C) רקמה פיברוטית. n = 3 ארנבים. קווי שגיאה מציינים SEM. *, מובהק סטטיסטית (p≤ 0.05). פסי קנה מידה = 5,000 מיקרומטר (A, עמודה שמאלית), 200 מיקרומטר (A, עמודה ימנית). קיצורים: SSC = subscapularis; RC = שרוול מסובב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

מחקר זה מפרט נהלים לביסוס פגיעה כרונית בשרוול מסובב ארנב (RC). באופן ספציפי, הפציעה נוצרת ביחידה תת-סקפולארית (SSC) של גיד-שריר/מיוטנדי כדי לחקות אנטומיה ופתופיזיולוגיה של RC אנושי, כולל ניוון שומן שרירי חמור (FD). פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לחקור פציעות RC ולהעריך טיפולים רגנרטיביים.

פיתוח מודל פגיעה בשרוול מסובב דמוי ארנב כרוני לחקר פיברוזיס וניוון שומן שרירי

Rabbit rotator cuff (RC) pathophysiology can lead to progressive and highly degenerative changes in its associated musculature and tendons, which ...

פרוטוקול זה מדגים טכניקה כירורגית מורכבת לגרימת פציעה כרונית דמוית שרוול מסובב בארנבים, והוא שימושי בחקר פתוגנזה של השרוול המסובב ופיתוח טיפולים רגנרטיביים. ארנבים הם מודלים בינוניים עד גדולים של בעלי חיים שקל לאכלס מבחינה לוגיסטית, לתפעל אותם בניתוח ולהראות רמות גבוהות של ניוון שומן בשרוול המסובב כאשר הם נפצעים, בדומה לבני אדם. מודל הפציעה subscapularis המוצג כאן מקביל אנטומית לקומפלקס שרירי גיד העצם supraspinatus, אחת מיחידות השרוול המסובב הפצועות בתדירות הגבוהה ביותר.כדי להתחיל, להכין את חלון הניתוח על ידי גילוח אתר החתך המיועד של ארנב מורדם. בעזרת צמר גפן, נקו את האזור עם שלושה מריחה לסירוגין של בטאדין ו-70% אלכוהול בתנועות סיבוביות. לנהל 20 מיליגרם לק"ג של cephalexin תוך שרירית כמו סוכן אנטי זיהומי מניעתי.בצע חתך עור של שלושה עד ארבעה סנטימטרים נחות מעצם הבריח, פצל את המרווח הדלטופקטורלי באמצעות מספריים, ונסוג כדי לקבל גישה לכתף. כדי לאתר את יחידת גיד השריר subscapularis, תחילה לזהות את שריר coracobrachialis. לאחר מכן זהו את הגיד subscapularis והכניסו מהדק זווית ישרה כדי לחשוף את הגיד כולו בהחדרתו על הטוברוזיות הפחותות של עצם הזרוע.בודד את גיד השריר subscapularis. לאחר מתן משכך כאבים לפני הניתוח באופן מקומי בסמוך לאתר הטרנסקציה, יש לעטוף את יחידת גיד השריר subscapularis בצינורות פנרוז מבוססי סיליקון כדי למנוע חיבור לא רצוי לרקמות הסובבות ולסייע בשאיבת רקמות לאחר מכן. כדי לגרום לפציעה, יש ליצור טרנססקציה בעובי מלא בצומת גיד השריר באמצעות אזמל כירורגי מספר 11.במידת הצורך, להפסיק את הדימום על ידי הפעלת לחץ עם חתיכת גזה ולהשתמש מלוחים כדי להשקות את הפצע לפי הצורך. כדי לסגור את הפצע, השתמש בתפר חומצה פוליגליקולית 4-0 כדי לקרב מחדש את רקמת שריר הדלטואיד ובתפר ניילון או משי 4-0 כדי לסגור את פצע העור, ולאחר מכן ניקוי הפצע. לנהל 0.03 מיליגרם לקילוגרם של buprenorphine תת עורית כמו משכך כאבים פעם אחת מיד לאחר הניתוח, ופעמיים ביום במשך 48 השעות הבאות.הניתוח ההיסטולוגי של מודל הפציעה של השרוול המסובב דמוי השרוול המסובב הכרוני לאחר ארבעה שבועות מוצג באיור זה. צביעת H&E אישרה את אובדן התא והארגון של השריר, אשר הוחלף במספר רב של אדיפוציטים בשרירי subscapularis הפגועים ביחס לקבוצת הביקורת. כימות אחוז הצטברות השומן בשריר הפגוע מוצג באיור זה.צביעת הטריכרום של מאסון אישרה גם ניוון שרירים וסידור לא מאורגן של סיבי קולגן בשרירי תת-סקפולריס הפגועים ביחס לקבוצת הביקורת. כימות שיעור השריר והרקמה הפיברוטית מוצגים באיור זה. ההערכה הראתה ירידה בתאי השריר עבור שרירים תת-סקפולאריים פגועים ביחס לקבוצת הביקורת.רמה גבוהה של פיברוזיס נצפתה גם בשרירים subscapularis פגועים. זיהוי גיד subscapularis ועטיפת יחידת גיד שריר subscapularis בצינורות penrose הם השלבים החשובים ביותר של הליך זה. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם התערבות טיפולית.במקרה זה, הניתוחים המתוארים כאן, יחד עם מיוגרפיה נוספת או ניתוח הליכה, עשויים לשמש להערכת תוצאות ההתערבות. טכניקה זו חיונית לסיוע לחוקרים בחקר הפתופיזיולוגיה של השרוול המסובב, כמו גם להקלה על פיתוח טיפולים חדשניים לתיקון והתחדשות גידי שריר.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...