Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Dai Fei Elmer Ker의 연구는 홍콩 특별행정구 식품보건국(Health Medical and Research Fund: 08190466), 홍콩특별행정구 혁신기술위원회(Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK 프로그램), 홍콩 연구 보조금 위원회, 홍콩 특별행정구(Early Career Scheme Award: 24201720 및 General Research Fund: 14213922) 및 The Chinese University of Hong Kong(교수 혁신상: FIA2018/A/01). Dan Wang의 연구는 홍콩 특별행정구 식품보건국(Health Medical and Research Fund, 07180686), 홍콩특별행정구 혁신기술위원회(Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK 프로그램) 및 홍콩 연구 보조금 위원회, 홍콩 특별행정구(일반 연구 기금: 14118620 및 14121121).

모든 시술은 연구소의 동물실험윤리위원회가 승인한 프로토콜에 따라 동물수술을 위해 지정된 적절한 시설을 갖춘 방에서 멸균 수술 기법을 사용하여 수행되어야 합니다. 본 연구에서 토끼 수술은 홍콩 중문대학 동물실험윤리위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 수술 절차
<ol><li>수술 부위를 준비하려면 발열 패드를 미리 데우고 멸균 수술용 커튼을 덮어 토끼의 체온을 유지합니다. 그런 다음 멸균된 수술 도구와 용품( 재료 표에 명시됨)을 배치하고 외과의의 선호도에 따라 정리합니다.</li>
	<li>뉴질랜드 흰 토끼(체중 3.5-4.5kg, 생후 약 5-6.5개월, 수컷 2마리와 암컷 1마리)에게 35mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진의 근육 투여를 통해 마취를 유도합니다. 그런 다음 발 및/또는 꼬리 꼬집기 테스트로 마취를 확인합니다.</li>
	<li>수술면을 유지하기 위해 추가 마취가 필요한 경우, 10mg/kg 케타민과 3mg/kg 자일라진을 변연 외이정맥(28 )을 통해 정맥 주사하고 5-10분 간격으로 동물의 호흡수를 모니터링한다.</li>
	<li>수술 기간을 준비하려면 원하는 절개 부위(SSC 근육-힘줄 단위의 표면 피부 영역)를 면도하고 베타딘과 70% 알코올을 번갈아 세 번 바르고 청소합니다. 면봉을 사용하여 베타딘과 70% 알코올을 원을 그리며 바릅니다(안쪽에서 바깥쪽으로). 눈 연고를 사용하여 토끼의 눈을 촉촉하고 윤활하게 유지하십시오. 20mg/kg 세팔렉신을 항감염제로 근육 주사로 투여합니다.</li>
	<li>쇄골 아래쪽에 3-4cm의 피부 절개를 하고 수술용 11번 메스를 사용하여 삼각흉근 간격을 분할한 다음 어깨에 접근하기 위해 수축합니다(그림 1A, B).</li>
	<li>SSC 근육-힘줄 단위를 찾으려면 먼저 coracobrachialis 근육(SSC 힘줄 부착을 덮고 있는 조직)을 식별하고 분할합니다. 그런 다음 SSC 힘줄을 식별하고 직각 클램프를 삽입하여 상완골의 결절이 적은 곳에 삽입될 때 전체 SSC 힘줄을 노출시킵니다(그림 1C).</li>
	<li>부상을 유발하기 전에 SSC 근육 힘줄(그림 1D)을 분리하고 절개 부위 근처에 수술 중 마취제(0.5% 부피바카인 0.2mg/kg)를 투여합니다. SSC 근육-힘줄 유닛을 실리콘 기반 펜로즈 튜브(그림 1E)로 감싸 주변 조직에 원치 않는 부착을 방지하고 후속 조직 회수를 돕습니다.</li>
	<li>부상을 유발하려면 수술용 No. 11 메스를 사용하여 근육-힘줄 접합부에 전체 두께 횡단을 만듭니다(그림 1F). 필요한 경우 거즈로 압력을 가하여 출혈을 멈추고 필요에 따라 식염수를 사용하여 상처를 세척하십시오.</li>
	<li>상처를 봉합하려면 4-0 폴리 글리콜산(PGA) 봉합사를 사용하여 삼각근 조직(그림 1G)을 근사화하고 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 피부 상처를 봉합합니다(그림 1H).</li>
	<li>진통제로 부프레노르핀 0.03mg/kg의 피하 투여를 통해 수술 후 관리를 제공합니다(수술 직후 1회, 다음 48시간29분 동안 매일 2회).</li>
	<li>토끼가 덮인 온열 패드에서 회복할 수 있도록 하고 자해, 수술 부위 핥기, 봉합사 제거 등 원치 않는 행동을 방지하기 위해 부드러운 목걸이를 적용합니다(그림 1I).</li>
	<li>동물의 체중과 행동 변화를 모니터링하십시오. 체중이 10% 이상 감소하고 통제할 수 없는 심한 통증(안와 조임, 뺨 납작함, 콧구멍 모양 변화, 수염 위치 변화, 귀 모양 및 위치 변화의 5가지 행동 행동에 따라 평가)을 수의사에게 보고하여 조기 안락사와 같은 개입이 필요한지 결정합니다.</li>
</ol>2. 표본 채취
<ol><li>토끼는 부상 후 4주가 지나면 안락사시킨다. 토끼를 마취하고 치사량의 펜토바르비탈 나트륨(60mg/kg 이상)을 투여합니다. 개흉술로 사망을 확인합니다.</li>
	<li>상완골을 확인하고 수술로 절제하는 동시에 크고 작은 결절과 모든 연조직 부착물을 보존합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)로 4°C에서 72시간 동안 고정한 후 뼈를 석회질화하기 위해 실온에서 1개월 동안 10% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액으로 옮깁니다(72시간마다 배지 교체).</li>
	<li>석회질 제거 후, 샘플을 등급별 에탄올 탈수, 파라핀 포매, 조직학적 절편(8μm 절편) 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 Masson의 삼색 용액(30,31,32)으로 염색하여 표준 조직학적 처리를 실시합니다.</li>
	<li>정립 현미경으로 10x 배율로 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>선택한 그래픽 디자인 소프트웨어를 사용하여 앞서 설명한 대로 근육 내 근육, 섬유 조직 및 지방의 면적과 비율을 측정하여 H&E 및 Masson의 삼색 이미지의 반 정량화를 수행합니다.334. 이 예에서는 Adobe Photoshop 소프트웨어(https://www.adobe.com)가 사용됩니다.<ol><li>마술 지팡이 도구를 사용하여 특정 조직 유형을 나타내는 특정 색상의 영역을 선택합니다(빨간색은 근육 조직, 파란색은 섬유증, 흰색은 지방을 나타냄).</li>
		<li>메뉴 항목을 클릭합니다. 선택 | 역 | 선택 항목 저장 | 섹션의 이름을 지정합니다.</li>
		<li>메뉴 항목을 클릭하여 표시된 영역 내의 픽셀 수를 계산합니다 . 측정 로그 | Record Measurement(측정 기록 )를 사용하여 이러한 픽셀 값을 기록하고 선택한 조직 유형의 백분율을 수동으로 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 통계 분석
<ol><li>조직학적 데이터의 경우 선택한 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 대조군과 부상군 간의 두 개의 독립적인 표본을 비교하기 위해 스튜던트 t-검정을 수행합니다.</li>
	<li>데이터를 평균± 평균의 표준 오차로 표현합니다. <0.05의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.</li>
</ol>

저자는 선언 할 경쟁 이익이 없습니다.

재현 가능하고 생리학적으로 관련성이 있는 동물 모델은 질병 발병 기전에 대한 이해를 증진하고, 임상 치료의 결과를 평가하며, 수술 치료법을 개선 및 추가로 개발할 수 있는 능력을 제공한다35. 이 연구에서는 인간 RC 해부학 및 병태생리학의 측면을 모방하는 신뢰할 수 있고 정확한 토끼 SSC 모델이 확립되었습니다. RC 파열은 점진적이고 돌이킬 수 없는 근육 퇴행성 변화와 관련이 있어 치유 가능성이 감소합니다. 예를 들어, Ko et al.은 6주에 토끼 SSP를 재부착해도 다음 6주 동안 근육 위축이나 FD가 역전되지 않는다는 것을 보여주었습니다. 이러한 FD 매개 근육 위축은 힘줄-근육 강도 및 관절 운동 범위를 포함한 몇 가지 중요한 임상 매개변수에 영향을 미치며, 이는 수술 결과에 영향을 미칠 수 있다36,37.
여기에서 확립된 프로토콜은 SSC 근육-힘줄 단위의 절개 후 유의미한 만성 유사 특성을 보여주었습니다. 특히, 이러한 변화에는 근육량이 눈에 띄게 감소하고 지방 함량 및 섬유화 조직이 증가합니다(그림 2, 그림 3 및 그림 4). 이러한 발견은 인간 RC 파열에서 보고된 퇴행성 변화와 일치한다38. 최근 몇 년 동안, 쥐는 견봉 38,39,40 아래를 이동하는 인간 및 쥐 SSP와의 높은 해부학적 유사성으로 인해 RC 질병 및 부상에 대해 가장 집중적으로 연구된 동물 모델 중 하나로 부상했습니다. 그러나 견봉궁 아래를 통과하는 쥐 SSP의 부분은 인간의 경우와 달리 근육질이라는 점에 유의해야 한다41. 가장 중요한 것은, Barton et al.은 쥐23에서 SSP 힘줄 박리 후 유의미한 지방 축적의 부족을 인식했는데, 이는 인간의 조건(42)과 대조된다. 따라서 토끼 SSC 복합체는 인간의 만성 RC 파열을 모방하는 적절한 모델을 제공할 수 있다고 믿어집니다.
이 모델의 재현성을 보장하기 위해 이 프로토콜을 수행할 때 두 가지 사항에 유의해야 합니다. 첫째, 근육-힘줄 단위의 절개 후, 절제된 힘줄의 자유 단부는 유착을 형성할 위험이 있을 수 있으며, 이로 인해 후속 조작을 위해 힘줄 회수가 어려울 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 비흡수성 실리콘 튜브를 사용하여 횡단 후 근육-힘줄 접합부의 자유 끝단을 감싸 주변 조직과의 자발적 접착 및 자연 치유를 방지했습니다(그림 1E). 또한, 중재를 위한 두 번째 절차(즉, 안전한 수리를 수행하기 위해; 데이터 미도시됨) 동안 절제된 근육-힘줄 단위는 초기 수술 시 손상된 조직의 말단을 감싸서 명확하게 식별할 수 있습니다. 이 기술은 경제적이고, 효과적이며, 수술에서 쉽게 구현될 수 있다43. 둘째, 토끼는 수술 후 해로운 행동을 보일 수 있는 매우 민감한 종입니다. 이러한 문제를 피하려면 자해, 수술 부위 핥기, 봉합사 제거 등 원치 않는 행동을 방지하기 위해 부드러운 칼라를 적용하는 것이 좋습니다(그림 1I). 경질 플라스틱으로 만들어진 상업적으로 기존의 E-칼라와 비교할 때, 자체 제작한 소프트 칼라는 동물 복지 또는 과학적 탐구의 질에 영향을 미치는 피부 손상이나 기타 부작용을 일으키지 않았습니다. 이러한 단계는 정확하게 재현 가능한 토끼 RC 부상 모델을 만들고 재생 복구 전략을 연구할 수 있는 가능성을 제공하는 데 중요합니다.
동물 모델에서 힘줄의 병태생리학 및 치유를 연구하려면 뚜렷하고 재현 가능한 손상을 만들어야 하며 연구 시점을 신중하게 선택해야 합니다. 힘줄 손상 및 치유에 관한 대다수의 연구는 완전히 절제된 동물 힘줄(44)에 대해 수행되었는데, 이는 절개가 매우 재현 가능하고 임상 시나리오(45,46)를 적절하게 시뮬레이션할 수 있는 간단한 절차이기 때문이다. 휴겔(Huegel) 등은 부분적으로 절개된 힘줄의 손상이 완전히 절개된 힘줄의 손상보다 덜 심각하며, 고정은 관절 경직의 증가를 포함하여 힘줄 역학에 해로운 영향을 미친다는 것을 보여주었다47. 대규모 RC 찢어짐 설정에서 볼 수 있는 위축과 FD를 평가하려면 실험적으로 관찰된 특성 시점을 정의하는 것이 중요합니다. Gupta et al.은 수컷 토끼의 RC 손상 모델을 검증하고 2주 및 6주 시점에서 근육 위축을 관찰했으며, 이후 시점에서 지방 함량이 증가했으며(2주 지방 함량 5% 미만 vs. 6주 지방 함량 10% 이상), 인간 RC 파열에서 관찰된 병리학적 과정과 일치했습니다11. 이 연구에서는 4주 동안 수컷과 암컷 토끼의 SSC 근육-힘줄 단위를 절개하여 대규모 RC 찢어짐을 생성하여 SSC 근육 FD(지방 함량 36.5%)를 생성했습니다. 따라서, 4주간의 시점은 수컷과 암컷 뉴질랜드 흰토끼에서 SSC 근육 FD를 생성하는데 적합하다.
이 연구에는 몇 가지 한계가 있다. 여기에는 다음이 포함됩니다: (i) 만성-유사 손상 생성을 위한 비교적 짧은 시점 및 잠재적으로 염증성 물질(실리콘 기반 펜로즈 튜빙)과 같은 동물 모델 생성과 관련된 단계; (ii) 관절 운동학 및 근육 수축력 생성을 평가하기 위한 보행 분석 및 근전도 검사의 부족과 같은 동물 모델 특성화 및 분석; (iii) 다른 RC 손상 부위와의 비교 부족과 같은 동물 모델 비교.
모델 생성 측면에서 인간 RC 손상은 일반적으로 몇 년에 걸쳐 발생할 수 있는 점진적 위축과 FD를 포함하며, 이는 여기에 보고된 4주 시점보다 상대적으로 깁니다. 비교적 짧은 시간 내에 약 36.5%의 근육 내 지방을 생성하는 동물 모델은 논리적으로 편리하고 필요하다고 판단되는 경우 연장될 수 있기 때문에 이는 허용되는 것으로 간주됩니다. 더욱이, 펜로즈 튜빙(penrose tubing)과 같은 실리콘 기반 임플란트의 생체 적합성은 세포 면역 반응 및 염증에 대한 보고로 인해 오랜 논란의 원천이 되어 왔다47; 따라서 염증 관련 RC 연구를 추구하는 경우 절제된 힘줄을 감싸는 대신 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 대체 불활성 물질을 대체할 수 있습니다.
동물모델 특성화 및 분석의 관점에서, 보행 분석(gait analysis)49 및 근전도 연구(electromyograph studies)50 의 부족은 연구의 결과를 정성적 조직학적 데이터로 제한할 수 있다. 이러한 양상들은 어깨 운동학 및 RC 근육 성능에 대한 정량적 데이터를 생성하기 위해 비디오 모션 분석(51 ) 및 표면 근전도(50 )를 사용함으로써 향후 연구에서 다루어질 수 있다.
모델 비교 측면에서, 토끼의 SSP와 극하 힘줄도 RC 연구에 널리 사용되어 왔기 때문에 향후 이러한 다양한 부상 부위 중 FD를 포함한 부상 중증도를 비교하면 모델 최적화를 위한 추가 부위를 식별할 수 있습니다.
요약하면, 이 연구는 수컷과 암컷 토끼의 만성 유사 RC 부상을 모델링하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이 모델은 단순성(절개)과 비교적 짧은 기간으로 인해 만성(4주)을 유도하는 동시에 근육 내 FD를 많이 생성(36.5%)하기 때문에 연구자에게 편리합니다. 따라서 이 프로토콜은 RC 병태생리학 연구의 연구자를 지원할 뿐만 아니라 근육 힘줄 복구 및 재생을 위한 새로운 치료법의 개발을 촉진할 것으로 기대됩니다.

만성 회전근개(RC) 파열은 근육 위축, 지방 조직 축적, 섬유증 등 근육 및 힘줄의 퇴행성 변화를 특징으로 하며, 이는 RC 복원 결과를 손상시키고 궁극적으로 어깨 통증과 기능 장애를 유발할 수 있습니다 1,2,3,4,5 . RC 파열 발병 기전을 더 잘 이해하고 수술 결과를 개선하려면 인간 RC 해부학 및 병태생리학의 측면을 모방할 수 있는 적절한 동물 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 구체적으로, RC 부상 모델은 다음 기준을 충족해야 합니다: (i) 부상 후 자연 치유가 부족합니다. (ii) 섬유증, 근육 위축 및 지방 조직의 축적이 현저히 존재합니다. (iii) 인간에게 사용되는 수술 기법의 근사치를 허용하기에 적절한 크기여야 한다6.
이러한 맥락에서 토끼 견갑하근(SSC)은 독특한 해부학적 구조, 병태생리학적 반응 및 생체역학적 특성을 감안할 때 RC 병태생리학 연구를 위한 정확하고 신뢰할 수 있는 동물 모델로 사용될 수 있다7. 실제로, 토끼 SSC RC 해부학은 인간 극상근(SSP) RC와 유사하며, 이는 과도한 사용으로 인한 부상과 가장 자주 관련된 근육-힘줄 단위입니다 8,9. 구체적으로, 토끼 SSC 힘줄 복합체는 뼈 터널과 상완근 아래를 통과하는데, 이는 SSP 힘줄 복합체가 견봉하 뼈 터널을 통과하고 견봉 인대 아래를 통과하는 인간의 상황과 유사하다7. 이러한 해부학적 유사성으로 인해 토끼 SSC는 인간 SSP와 유사한 근골격계 운동을 겪게 되며, 상완골 7,10의 상승 및 외전 중에 힘줄이 견봉 아래로 이동합니다.
더욱이, 인간 RC 파열11과 유사한 병리조직학적 변화가 SSC 파열 후 토끼에서 관찰되었다. 특히, 근육 복부는 근육량이 크게 감소하고 근섬유 단면적이 감소하며 비만도가 증가하는 심각한 FD를 겪습니다. 또한, Otarodifard 등은 (1) 단일 행, (2) 이중 행 및 (3) 경골 등가 RC 수리 기술 후 토끼 SSC의 생체 역학적 특성을 평가하고, 이러한 수리의 초기 생체역학적 특성이 사체 표본에서 수행된 인간 SSP RC 수리와 유사하다는 것을 발견했습니다12. 따라서 토끼 SSC와 인간 SSP의 해부학적, 생리학적, 생체역학적 유사성은 RC 부상을 모델링하는 데 유용합니다.
쥐, 생쥐, 개, 양을 포함한 많은 종의 동물이 RC 질병 및 복구 6,13,14,15 연구에 사용되어 왔지만 부상 만성의 정도가 주요 고려 사항입니다. 이는 RC 파열은 증상이 없을 수 있으며, 파열이 커져 만성화되어 힘줄과 근육 모두 심각한 퇴행을 보이는 훨씬 나중에 진단될 수 있기 때문이다16,17,18. 그러나 대부분의 RC 수리 모델은 건강한 힘줄이 절개된 후 즉시 수리되는 급성 부상 모델을 사용합니다 19,20,21,22. 이는 주로 물류 편의성과 기술적 용이성을 이유로 발생하며, 그 결과 만성 질환과 유사한 환경에서 RC 병태생리학을 조사하는 연구는 거의 없습니다. 더욱이, 몇몇 동물 모델은 만성 RC 연구에 대한 사용을 방해하는 특성을 가질 수 있습니다.
예를 들어, 쥐는 RC 파열 및 중재를 모델링하는 데 광범위하게 사용되었지만, 부상 후 상당한 지방 축적이 부족하여 인간의 상태와 대조를 이루며, 크기가 작기 때문에 반복적인 수술 절차가 어렵다23. 또한, Gerber et al.이 만성 RC 파열 후 근육 위축과 FD를 연구하기 위해 양의 극하수근을 사용했지만, 양의 극하수근과 인간 SSP 사이에는 해부학적 차이가 존재할 뿐만 아니라 이러한 대형 동물 모델을 연구하고 수용하기 위한 수많은 물류 문제가 있습니다. 또한 Gerber et al.은 만성 RC 파열의 특징을 모방하기 위해 극하근과 힘줄의 표재성 머리를 풀어 양에서 지연된 RC 손상 모델을 개발한 다음 4-6주에 힘줄에 대한 다양한 복구 기술의 효능을 평가했습니다. 불행하게도, 이 만성 유사 양 모델은 두 번째 수술 과정에서 방출된 힘줄의 끝이 흉터 조직과 구별할 수 없게 되었다는 한계를 가지고 있었다25.
Coleman et al.은 또한 초기 수술 시 횡단된 힘줄 끝을 합성 막으로 덮음으로써 양의 만성 RC 파열 모델을 개발했는데, 이를 통해 영양 확산을 허용하고 손상된 조직 주변의 흉터 조직 형성을 효율적으로 최소화하는 동시에 힘줄과 흉터 조직 간의 구별을 개선했습니다26. 한편, Turner 등은 대규모 힘줄 수축에서 직접적인 재부착이 거의 일어나지 않기 때문에 지연된 수리가 4주 이내에 수행되어야 한다고 제안했다27. 이러한 연구는 함께 만성 토끼 SSC RC 손상 모델의 성공적인 확립을 위한 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜에 기여했습니다.
이 프로토콜에서는 조직학적 평가를 통해 섬유증 및 FD 매개 근육 위축과 관련된 병리학적 변화를 연구할 수 있는 만성 토끼 RC 손상 모델을 4주에 확립합니다. 특히, 초기 수술 시 실리콘 기반 펜로즈 튜브를 사용하여 근육-힘줄 접합부의 자유 끝을 감싸면 두 번째 수술 절차 중에 RC 조직을 명확하게 식별할 수 있으며, 결과적으로 비계 확대술의 유무에 관계없이 RC 치유를 연구하기 위한 안전한 수리가 용이합니다. 전체적으로, 만성 유사 토끼 SSC 모델은 RC 병태생리학을 더 잘 모방할 수 있으며 최소한의 기술 및 물류 요구 사항을 제기할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

토끼 회전근개(RC) 병태생리학은 관련 근육 조직 및 힘줄의 점진적이고 퇴행성 변화를 유발할 수 있으며, 이는 근-힘줄/근건성 단위의 강도 및 수축과 같은 임상적으로 관련된 매개변수에 부정적인 영향을 미쳐 궁극적으로 어깨 기능 상실을 유발하고 RC 복구 결과에 부정적인 영향을 미칩니다. 인간 RC 해부학 및 병태생리학의 측면을 모방한 동물 모델은 부상 진행에 대한 개념적 이해를 높이고 효과적인 조직 공학 및 재생 의학 기반 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다.
이러한 맥락에서 토끼 견갑하(SSC) 모델은 (i) 가장 빈번하게 부상을 입은 RC 부위인 인간 극상근(SSP) 뼈-힘줄-근육 단위와의 해부학적 유사성으로 인해 적합합니다. (ii) 섬유증 및 근육 지방 변성(FD) 측면에서 인간과의 병태생리학적 유사성; (iii) 외과 수술에 대한 편의 시설. 따라서 본 연구의 목적은 SSC RC 손상을 유도하기 위한 수술 기법을 기술하는 것이다. 간단히 말해서, 이 절차는 근육-힘줄 접합부에서 전체 두께 횡단을 한 후 근육-힘줄 접합부의 자유 끝을 실리콘 기반 펜로즈 튜브로 감싸 근육-힘줄 접합부의 자유 끝을 자발적인 재부착을 방지하여 SSC를 분리하는 것을 포함합니다. 조직학적 평가는 수술 후 4주에 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Masson의 삼색 염색을 사용하여 근육 FD의 진행을 모니터링하기 위해 수행됩니다.
근육 및 FD의 손실은 인간 RC 병태생리학적 조건과 유사하게 SSC 근육-힘줄 접합부의 절개 후 4주 후에 분명했습니다. 이 프로토콜은 RC 병태생리학과 관련된 골격근 변화를 연구하고 만성 유사 RC 파열에 대한 새로운 치료 전략 개발을 지원하는 강력한 도구 역할을 할 수 있는 만성 토끼 SSC RC 손상 모델을 성공적으로 확립하기 위한 단계를 보여줍니다.

SSC 근육-힘줄 단위의 절개에 따른 RC 병리학의 만성을 평가하기 위해 전체 조직 형태 및 세포 변화를 총 평가 및 조직학적 분석(각각 H&E 및 Masson의 삼색 염색)을 통해 특성화했습니다(그림 2, 그림 3 및 그림 4). 총 조직 형태의 대표 이미지는 손상된 SSC 근육에서 흰색 지방과 같은 조직의 모습을 보여주었는데, 이는 대조군에는 없었습니다(그림 2). H&E 염색은 근육 세포성 및 조직의 손실을 확인했으며, 이는 대조군에 비해 손상된 SSC 근육에서 많은 수의 지방 세포(압축된 핵을 포함하는 세포질의 얇은 테두리로 둘러싸인 빈 공간)로 대체되었습니다(그림 3A).
H&E 이미지의 반정량적 평가는 대조군(0.69% ±± 0.18%)에 비해 손상된 SSC 근육(36.5% 8.5%)에 존재하는 높은 수준의 근육 내 지방 세포를 보여주었습니다(그림 3B). Masson의 삼색 염색은 또한 대조군에 비해 손상된 SSC 근육에서 근육 위축과 무질서한 콜라겐 섬유 배열을 확인했습니다(그림 4A). Masson의 삼색 이미지에 대한 반정량적 평가는 대조군(99.2% ± 0.16%)에 비해 손상된 SSC 근육(41.3% ± 2.6%)의 근육 세포성 감소를 보여주었습니다(그림 4B). 추가적인 반정량적 평가에서는 손상된 SSC 근육(22.3% ± 13.1%)과 대조군(0.07% ± 0.05%) 간에 섬유화 조직 형성에 유의한 차이가 없었지만, 손상된 SSC 근육에서 높은 수준의 섬유화가 관찰되었습니다(그림 4C). 총 조직 형태학과 조직학적 분석은 손상된 토끼 SSC 근육 힘줄이 만성 RC 병태생리학의 특징으로 알려진 심각한 근육 위축, 지방 축적 및 섬유증을 나타낸다는 것을 보여주었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> 그림 1: 만성 유사 SSC 근육 힘줄 손상 모델의 수술 절차. (A) 수술 창을 만들고 상완골, 상완골두, 쇄골과 같은 해부학적 랜드마크를 촉진으로 식별했습니다. (B) 3.0cm의 피부 절개를 쇄골 아래쪽으로 하였다. (C) 상완근(coracobrachialis muscle)을 분할하여 SSC 근육을 노출시켰다. (D) SSC 근육-힘줄 단위를 분리하였다. (E) 실리콘 기반 펜로즈 드레인을 사용하여 SSC 근육-힘줄 조직을 감쌌습니다. (F) SSC 근육-힘줄이 절제되었다. (G) coracobrachialis 근육은 PGA 봉합사를 사용하여 재근사화되었습니다. (H) 피부 절개는 나일론 봉합사를 사용하여 봉합하였다. (I) 수술 후, 토끼들에게 부드러운 목걸이를 착용하도록 했다. 약어: SSC = subscapularis; PGA = 폴리 글리콜산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> 그림 2: 대표적인 SSC 근육의 총 형태. 검은색 화살표는 흰색 지방 조직을 나타냅니다. 약어: SSC = subscapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> 그림 3: 4주 시점의 만성 유사 RC 손상 모델의 조직학적 분석. (A) 대표적인 H&E 염색 조직학 이미지는 위축된 근섬유와 지방세포의 축적을 보여주었습니다. (B) 부상 근육 지방 축적 비율의 정량화. n = 토끼 3마리. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. *, 통계적으로 유의합니다(p≤ 0.05). 스케일 바 = 5,000μm(A, 왼쪽 열), 600μm(A, 오른쪽 열). 약어: SSC = subscapularis; RC = 회전근개; H&E = 헤마톡실린 및 에오신. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> 그림 4: 4주 시점의 만성 유사 RC 손상 모델의 조직학적 분석. (A) Masson의 삼색으로 염색된 이미지는 상당한 섬유증을 보여주었습니다. 섬유성 결합 조직은 파란색으로 염색됩니다. (B) 근육 및 (C) 섬유화 조직의 비율 정량화. n = 토끼 3마리. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. *, 통계적으로 유의합니다(p≤ 0.05). 스케일 바 = 5,000 μm(A, 왼쪽 열), 200 μm(A, 오른쪽 열). 약어: SSC = subscapularis; RC = 회전근개. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

이 연구는 만성 토끼 회전근개(RC) 손상을 확립하기 위한 절차를 자세히 설명합니다. 특히, 부상은 견갑하(SSC) 근육-힘줄/근건성 단위에서 생성되어 심각한 근육 지방 변성(FD)을 포함한 인간 RC 해부학 및 병태생리학을 모방합니다. 이 프로토콜은 RC 손상을 연구하고 재생 요법을 평가하는 데 적용할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 토끼에서 만성 회전근개 손상을 유도하기 위한 복잡한 수술 기법을 보여주며, 회전근개 발병기전을 연구하고 재생 요법을 개발하는 데 유용합니다. 토끼는 중대형 동물 모델로, 물류적으로 수용하기 쉽고, 외과적으로 조작하기 쉬우며, 인간과 유사하게 다쳤을 때 높은 수준의 회전근개 근육 지방 변성을 보입니다. 여기에 표시된 견갑하 손상 모델은 가장 자주 손상되는 회전근개 장치 중 하나인 극상근 힘줄 근육 복합체와 해부학적으로 유사합니다.시작하려면 마취된 토끼의 의도된 절개 부위를 면도하여 수술 창을 준비합니다. 면봉을 사용하여 베타딘과 70% 알코올을 세 번 번갈아 가며 원을 그리며 해당 부위를 청소합니다. 예방적 항감염제로 세팔렉신 킬로그램당 20mg을 근육 주사로 투여합니다.쇄골 아래쪽에 3-4cm의 피부 절개를 하고 가위로 삼각흉근 간격을 분할한 다음 어깨에 접근하기 위해 수축합니다. 견갑하근 힘줄 단위를 찾으려면 먼저 상완근을 확인합니다. 그런 다음 견갑하 힘줄을 식별하고 직각 클램프를 삽입하여 상완골의 작은 결절에 삽입할 때 전체 힘줄을 노출시킵니다.견갑하근 힘줄을 분리합니다. 수술 전 진통제를 절개 부위 근처에 국소적으로 투여한 후 견갑하근 힘줄 단위를 실리콘 기반 펜로즈 튜브로 감싸 주변 조직에 원치 않는 부착을 방지하고 후속 조직 회수를 돕습니다. 부상을 유도하려면 수술 번호 11 메스를 사용하여 근육 힘줄 접합부에 전체 두께 횡단을 만듭니다.필요한 경우 거즈로 압력을 가하여 출혈을 멈추고 필요에 따라 식염수를 사용하여 상처를 세척하십시오. 상처를 봉합하려면 4-0 폴리글리콜산 봉합사를 사용하여 삼각근 조직을 근사화하고 4-0 나일론 또는 실크 봉합사를 사용하여 피부 상처를 봉합한 다음 상처를 세척합니다. 부프레노르핀 킬로그램당 0.03mg을 수술 직후 진통제로 한 번, 이후 48시간 동안 하루에 두 번 피하로 투여한다.4주째의 만성 회전근개 손상 모델의 조직학적 분석이 이 그림에 나와 있습니다. H&E 염색은 근육 세포성 및 조직의 손실을 확인했으며, 이는 대조군에 비해 손상된 견갑하근에서 많은 수의 지방세포로 대체되었습니다. 부상 근육 지방 축적 비율의 정량화는 이 그림에 나와 있습니다.Masson의 삼색 염색은 또한 대조군에 비해 손상된 견갑하근에서 근육 위축과 무질서한 콜라겐 섬유 배열을 확인했습니다. 근육과 섬유화 조직의 비율을 정량화한 것이 이 그림에 나와 있습니다. 평가 결과, 대조군에 비해 손상된 견갑하근의 근육 세포성이 감소한 것으로 나타났습니다.손상된 견갑하근에서도 높은 수준의 섬유화가 관찰되었습니다. 견갑하 힘줄을 식별하고 견갑하 힘줄 단위를 펜로즈 튜브로 감싸는 것이 이 절차의 가장 중요한 단계입니다. 이 절차에 따라 치료적 개입이 적용될 수 있습니다.이 경우, 여기에 설명된 분석은 추가적인 근근 조영술 또는 보행 분석과 함께 중재 결과를 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 회전근개 병태생리학 연구의 연구자들을 지원하고 근육 힘줄 복구 및 재생을 위한 새로운 치료법의 개발을 촉진하는 데 매우 중요합니다.

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