Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Dai Fei Elmer Kers forskning støttes av finansiering fra Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund: 08190466), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK program), Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (Early Career Scheme Award: 24201720 og General Research Fund: 14213922), og The Chinese University of Hong Kong (Faculty Innovation Award: FIA2018 / A / 01). Dan Wangs forskning støttes av finansiering fra Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK program), og Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (General Research Fund: 14118620 og 14121121).

Alle prosedyrer må utføres ved hjelp av steril kirurgisk teknikk i et passende utstyrt rom beregnet for dyreoperasjoner i henhold til en protokoll godkjent av instituttets etiske komité for dyreforsøk. I denne studien ble kaninoperasjoner utført i samsvar med en protokoll godkjent av The Chinese University of Hong Kong Animal Experimentation Ethics Committee.
1. Kirurgisk prosedyre
<ol><li>For å forberede det kirurgiske området, forvarm en varmepute og overlegg den med sterile kirurgiske gardiner for å opprettholde kroppstemperaturen på kaninen. Deretter legger du ut steriliserte kirurgiske verktøy og forsyninger (som angitt i materialfortegnelsen) og organiserer dem i henhold til kirurgens preferanse.</li>
	<li>Indusere anestesi via intramuskulær administrering av 35 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin til hvite kaniner fra New Zealand (som veier mellom 3,5 og 4,5 kg, ca. 5-6,5 måneder; to hannkaniner og en hunnkanin ble brukt i denne studien). Deretter bekrefter anestesi med en pote og / eller hale klype test.</li>
	<li>Hvis ytterligere anestesi er nødvendig for å opprettholde operasjonsplanet, administrer 10 mg / kg ketamin og 3 mg / kg xylazin intravenøst via den marginale ørevenen28 og overvåke dyrets pustefrekvens med jevne mellomrom på 5-10 minutter.</li>
	<li>For å forberede operasjonsvinduet, barber det tiltenkte snittstedet (hudområdet overfladisk til SSC muskel-seneenheten) og rengjør med tre vekslende påføringer av betadin og 70% alkohol. Bruk en bomullspinne for å påføre betadin og 70% alkohol i sirkulære bevegelser (fra innsiden til utsiden). Bruk øyesalve for å holde kaninens øyne fuktige og smurte. Administrer 20 mg/kg cefaleksin intramuskulært som et antiinfeksjonsmiddel.</li>
	<li>Gjør et 3-4 cm hudsnitt dårligere enn kragebenet, del deltolektoralintervallet med en kirurgisk skalpell nr. 11, og trekk inn for å få tilgang til skulderen (figur 1A,B).</li>
	<li>For å lokalisere SSC muskel-sene-enheten, identifiser først coracobrachialis-muskelen (som vev som dekker SSC-senevedlegget) og splitt den. Etter dette, identifiser SSC-senen, og sett inn en rettvinklet klemme for å eksponere hele SSC-senen ved innføringen på den mindre tuberositeten til humerus (figur 1C).</li>
	<li>Før skaden innføres, isoleres SSC-muskelsenen (figur 1D) og intraoperativ bedøvelse (0,2 mg/kg 0,5 % bupivakain) lokalt nær transseksjonsstedet. Pakk SSC muskel-sene-enheten i silikonbasert penroseslange (figur 1E) for å forhindre uønsket festing til det omkringliggende vevet og hjelpe påfølgende vevsuthenting.</li>
	<li>For å indusere skade, lag en fulltykkelsestransseksjon ved muskel-sene-overgangen ved hjelp av en kirurgisk skalpell nr. 11 (figur 1F). Stopp blødningen ved å påføre trykk med et stykke gasbind og bruk saltvann for å irrigere såret etter behov.</li>
	<li>For å lukke såret, bruk en 4-0 polyglykolsyre (PGA) sutur for å reapproximere deltoidmuskelvevet (figur 1G) og en 4-0 nylonsutur for å lukke hudsåret (figur 1H).</li>
	<li>Lever behandling etter operasjonen gjennom subkutan administrering av 0,03 mg/kg buprenorfin som smertestillende middel (én gang umiddelbart etter operasjonen og to ganger daglig de neste 48 timeneog 29).</li>
	<li>La kaninene komme seg på en tildekket varmepute og påfør en myk krage for å forhindre uønsket atferd, inkludert selvlemlestelse, slikking av operasjonssteder og fjerning av suturer (figur 1I).</li>
	<li>Overvåk dyrene for vekt- og atferdsendringer. Rapporter enhver reduksjon på mer enn 10% kroppsvekt og alvorlig smerte som ikke kan kontrolleres (vurdert basert på fem atferdshandlinger: orbital stramming, kinnflating, neseborformendringer, værhårposisjonsendringer og øreform og posisjonsendringer) til veterinæren for å avgjøre om intervensjon som tidlig avlivning er nødvendig.</li>
</ol>2. Prøvehøsting
<ol><li>Euthanize kaninene på 4 uker fra skadetidspunktet. Bedøv kaninene og gi en dødelig dose natriumpentobarbital (mer enn 60 mg/kg). Bekreft død ved toraktomi.</li>
	<li>Identifiser humeralhodet og øk det kirurgisk, samtidig som du beholder de større og mindre tuberklene og alle bløtvevsvedlegg. Fiks med 4 % paraformaldehyd (PFA) i 72 timer ved 4 °C før overføring til en oppløsning med 10 % etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 1 måned ved romtemperatur (med medieskift hver 72. time) for å avkalke ben.</li>
	<li>Etter avkalkning, utsett prøvene for standard histologisk behandling ved bruk av gradert etanoldehydrering, parafininnebygging, histologisk seksjonering (8 μm seksjoner) og farging med hematoksylin og eosin (H&E) og Massons trikrome løsninger30,31,32.</li>
	<li>Ta bilder med et oppreist mikroskop ved 10x forstørrelse.</li>
	<li>Utfør semi-kvantifisering av H &E og Massons trichrome-bilder ved å måle området og prosentandelen av muskler, fibrøst vev og fett i muskelen, som tidligere beskrevet33,34 ved hjelp av en grafisk designprogramvare du velger. I dette eksemplet brukes Adobe Photoshop-programvare (https://www.adobe.com).<ol><li>Velg et område med en bestemt farge som representerer en bestemt vevstype ved hjelp av tryllestavverktøyet (rødt er muskelvev, blått er fibrose og hvitt representerer fett).</li>
		<li>Klikk på menyelementene Velg | Omvendt | Lagre merket område | Gi seksjonen et navn.</li>
		<li>Telle antall piksler i det merkede området ved å klikke menyelementer Vindu | Målelogg | Registrer mål for å registrere disse bildepunktverdiene, og manuelt beregne prosentandelen av de valgte vevstypene.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Statistisk analyse
<ol><li>For histologiske data, utfør den statistiske analysen ved hjelp av den valgte analytiske programvaren. Utfør en Student t-test for sammenligning av to uavhengige prøver mellom kontrollgruppen og den skadde gruppen.</li>
	<li>Uttrykk dataene som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet. Vurder en p-verdi på <0,05 som statistisk signifikant.</li>
</ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å oppgi.

En reproduserbar og fysiologisk relevant dyremodell gir muligheten til å fremme forståelsen av sykdomspatogenese, evaluere resultatene av kliniske terapier og forbedre og videreutvikle kirurgiske behandlinger35. I denne studien ble det etablert en pålitelig og nøyaktig kanin SSC-modell som etterligner aspekter av human RC-anatomi og patofysiologi. RC-rifter er relatert til progressive og sannsynligvis irreversible muskulære degenerative forandringer, noe som resulterer i redusert helbredelsespotensial. For eksempel viste Ko et al. at reattachment av kanin SSP ved 6 uker ikke reverserte muskelatrofi eller FD i de følgende 6 ukene. Slik FD-mediert muskelatrofi påvirker flere viktige kliniske parametere, inkludert senemuskelstyrke og felles bevegelsesutslag, noe som kan påvirke de kirurgiske utfallene36,37.
Protokollen som ble etablert her viste signifikante kronisk-lignende egenskaper etter transeksjonen av SSC muskel-seneenheter. Spesielt inkluderer disse endringene synlig redusert muskelmasse og økt fettinnhold og fibrotisk vev (figur 2, figur 3 og figur 4). Disse funnene stemmer overens med degenerative endringer rapportert i humane RC-rifter38. I de senere år har rotta dukket opp som en av de mest intensivt studerte dyremodellene for RC-sykdom og skade på grunn av sine høye anatomiske likheter med både menneskelige og rotte SSP som reiser under acromion38,39,40. Det skal imidlertid bemerkes at den delen av rotte SSP som passerer under den akromialbuen er muskuløs i motsetning til tendinøs, noe som er tilfelle hos mennesker41. Viktigst av alt, Barton et al. anerkjente mangel på betydelig fettakkumulering etter SSP-seneløsning hos rotter23, som står i kontrast til den menneskelige tilstanden42. Som sådan antas det at kanin SSC-komplekset kan gi en passende modell for å etterligne den kroniske RC-tåre hos mennesker.
For å sikre reproduserbarheten til denne modellen, er to punkter verdt å merke seg når du utfører denne protokollen. For det første, etter transeksjon av muskel-sene-enheter, kan den frie enden av den transekterte senen være i fare for å danne sammenvoksninger, noe som kan gjøre seneuthenting utfordrende for senere manipulasjoner. For å unngå dette problemet ble det brukt et ikke-resorberbart silikonrør for å vikle den frie enden av muskel-sene-overgangen etter transeksjon for å unngå spontan vedheft til omkringliggende vev samt spontan tilheling (figur 1E). Videre kan den transekterte muskel-sene-enheten under en annen prosedyre for intervensjon (dvs. å utføre en sikker reparasjon, data ikke vist) tydelig identifiseres ved å pakke enden av skadet vev på tidspunktet for første operasjon. Denne teknikken er økonomisk, effektiv og kan enkelt implementeres i kirurgi43. For det andre er kaniner en svært følsom art som kan utvise skadelig oppførsel etter operasjonen. For å unngå slike problemer anbefales det sterkt at en myk krage også brukes for å forhindre uønsket atferd, inkludert selvlemlestelse, slikking av operasjonssteder og fjerning av suturer (figur 1I). Sammenlignet med kommersielt konvensjonelle E-krager som er laget av stiv plast, forårsaket den selvlagde myke kragen ingen hudskader eller andre bivirkninger som påvirket dyrevelferden eller kvaliteten på vitenskapelige undersøkelser. Sammen er slike trinn avgjørende for å skape en nøyaktig reproduserbar kanin RC-skademodell og gi mulighet for å studere de regenerative reparasjonsstrategiene.
For å studere senepatofysiologi og helbredelse i en dyremodell, må det opprettes en distinkt og reproduserbar skade, og studietidspunktene må velges nøye. De aller fleste studier på seneskade og tilheling er utført på fullt transekterte dyresener44, da transeksjon er en enkel prosedyre som er svært reproduserbar og kan simulere det kliniske scenariet45,46 på en adekvat måte. Huegel et al. viste at skaden av en delvis transektert sene var mindre alvorlig enn en fullt transektert sene, og immobilisering hadde en skadelig effekt på senemekanikken, inkludert økt leddstivhet47. For å evaluere atrofi og FD som ses i innstillingen av massiv RC-tåre, er det viktig å definere de eksperimentelt observerte karakteristiske tidspunktene. Gupta et al. har validert en RC-skademodell hos hannkanin og observert muskelatrofi ved 2 og 6 ukers tidspunkter, med økt fettinnhold på senere tidspunkter (mindre enn 5% fettinnhold ved 2 uker vs. mer enn 10% fettinnhold ved 6 uker), i samsvar med den patologiske prosessen observert i humane RC-tårer11. I denne studien ble en massiv RC-rift opprettet ved transeksjon av SSC muskel-sene-enheten hos hann- og hunnkaniner i 4 uker, noe som resulterte i SSC muskel-FD (36,5% fettinnhold). Dermed er et 4 ukers tidspunkt passende for å generere SSC muskel FD hos mannlige og kvinnelige New Zealand hvite kaniner.
Det er flere begrensninger ved denne studien. Disse inkluderer: (i) trinn assosiert med generering av dyremodeller, for eksempel et relativt kort tidspunkt og potensielt inflammatoriske materialer (silikonbasert penroserør) for kronisk lignende skadegenerering; (ii) karakterisering og analyse av dyremodeller, for eksempel mangel på ganganalyse og elektromyografi for å vurdere leddkinematikk og muskelkontraktil kraftgenerering; og (iii) sammenligning av dyremodeller, for eksempel mangel på sammenligning med andre RC-skadesteder.
Når det gjelder modellgenerering, involverer menneskelige RC-skader vanligvis progressiv atrofi og FD som kan oppstå i løpet av flere år, noe som er relativt lengre enn 4-ukers tidspunktet som er rapportert her. Dette anses å være akseptabelt, siden en dyremodell som genererer rundt 36,5% intramuskulært fett på relativt kort tid vil være logistisk praktisk og kan forlenges hvis det anses nødvendig. Videre har biokompatibiliteten til silikonbaserte implantater, som penroserør, vært en kilde til langvarig kontrovers på grunn av rapporter om cellulær immunrespons og betennelse47; Derfor kan et alternativt inert materiale, som polyetylenglykol (PEG), erstattes for innpakning av resektert sene hvis man forfølger betennelsesassosierte RC-studier.
Når det gjelder karakterisering og analyse av dyremodeller, kan mangelen på ganganalyse49 og elektromyografstudier50 begrense studiens funn til kvalitative histologiske data. Disse aspektene kan tas opp i fremtidige studier ved å bruke videobevegelsesanalyse51 og overflateelektromyografi50 for å generere kvantitative data om skulderkinematikk og RC-muskelytelse.
Når det gjelder modellsammenligning, siden SSP- og infraspinatussenene hos kaninene også har blitt mye brukt til RC-studier, vil sammenligning av skadealvorlighetsgrad, inkludert FD blant disse forskjellige skadestedene i fremtiden, identifisere flere steder for modelloptimalisering.
Oppsummert har denne studien utviklet en protokoll for modellering av kronisk-lignende RC-skader hos hann- og hunnkaniner. Denne modellen er praktisk for etterforskere på grunn av sin enkelhet (transeksjon) og relativt kort periode for å indusere kronisitet (4 uker) mens den genererer en stor grad (36,5%) intramuskulær FD. Som sådan forventes denne protokollen å hjelpe etterforskere i studiet av RC-patofysiologi, samt legge til rette for utvikling av nye terapier for reparasjon og regenerering av muskelsener.

Kronisk rotator cuff (RC) tårer er preget av degenerative endringer i muskulatur og sener, inkludert atrofi av muskler, akkumulering av fettvev, og fibrose, som kan kompromittere utfallet av RC reparasjon og til slutt føre til skulder smerte og dysfunksjon 1,2,3,4,5 . For bedre å forstå RC-tårepatogenesen og forbedre kirurgiske resultater, er det avgjørende å utvikle passende dyremodeller som kan etterligne aspekter av human RC-anatomi og patofysiologi. Spesielt bør RC-skademodeller oppfylle følgende kriterier: (i) mangler spontan helbredelse etter skade; (ii) inneholder en signifikant tilstedeværelse av fibrose, muskelatrofi og akkumulering av fettvev; og (iii) være av tilstrekkelig størrelse til å tillate tilnærming av kirurgiske teknikker brukt hos mennesker6.
I denne sammenheng kan kanin subscapularis (SSC) muskelen brukes som en nøyaktig og pålitelig dyremodell for studiet av RC-patofysiologi, gitt sin unike anatomi, patofysiologiske respons og biomekaniske egenskaper7. Faktisk er kanin SSC RC-anatomi lik human supraspinatus (SSP) RC, som er muskel-seneenheten som oftest er forbundet med skade som stammer fra overforbruk 8,9. Spesielt passerer kanin SSC-senekomplekset gjennom en benete tunnel og under coracobrachialis-muskelen, som er analog med situasjonen hos mennesker hvor SSP-senekomplekset passerer gjennom den subakromiale benete tunnelen og under det korakoakromiale ligamentet7. Denne anatomiske likheten resulterer i at kanin SSC gjennomgår lignende muskel- og skjelettbevegelser som human SSP, hvor senen beveger seg under acromion under heving og bortføring av humerus 7,10.
Videre er det observert patihistologiske forandringer, tilsvarende humane RC-rifter11, hos kanin etter rift i SSC. Spesielt gjennomgår muskelmagen alvorlig FD, med et betydelig tap av muskelmasse, redusert muskelfibertverrsnittsareal og økt fett. I tillegg vurderte Otarodifard et al. de biomekaniske egenskapene til kaninen SSC etter (1) enkeltrad, (2) dobbeltrad og (3) transosseøs-ekvivalente RC-reparasjonsteknikker, og fant at de første biomekaniske egenskapene til disse reparasjonene var lik menneskelige SSP RC-reparasjoner utført i kadaveriske prøver12. Som sådan gjør den anatomiske, fysiologiske og biomekaniske likheten til kanin SSC med menneskelig SSP det nyttig for modellering av RC-skader.
Selv om mange dyrearter, inkludert rotter, mus, hunder og sauer, har blitt brukt i studiet av RC-sykdom og reparasjon 6,13,14,15, er graden av skadekronisitet et sentralt hensyn. Dette skyldes at RC-tårer kan være asymptomatiske og ofte kan diagnostiseres mye senere når riften har forstørret og blitt kronisk i naturen, med både senen og muskelen som viser alvorlig degenerasjon16,17,18. Imidlertid bruker de fleste RC-reparasjonsmodeller akutte skademodeller, der den friske senen transekteres og deretter umiddelbart repareres 19,20,21,22. Dette skjer i stor grad på grunn av logistisk hensiktsmessighet og teknisk letthet, noe som resulterer i få studier som undersøker RC-patofysiologien innenfor en kronisk lignende setting. Videre kan flere dyremodeller ha egenskaper som hindrer deres bruk for kroniske RC-studier.
For eksempel, selv om rotta har blitt mye brukt til å modellere RC-tåre og intervensjon, står mangelen på signifikant fettakkumulering etter skade i kontrast til den menneskelige tilstanden, og den lille størrelsen gjør gjentatte kirurgiske prosedyrer utfordrende23. Videre, selv om Gerber et al. brukte infraspinatus av sau for å studere muskelatrofi og FD etter kronisk RC-rive24, eksisterer det noen anatomiske ulikheter mellom sau infraspinatus og menneskelig SSP, samt mange logistiske utfordringer for å studere og huse en så stor dyremodell. I tillegg utviklet Gerber et al. en forsinket RC-skademodell hos sauer ved å frigjøre det overfladiske hodet til infraspinatusmuskelen og senen for å etterligne funksjonene til en kronisk RC-tåre, og evaluerte deretter effekten av forskjellige reparasjonsteknikker på senen ved 4 til 6 uker. Dessverre hadde denne kronisk-lignende sauemodellen en begrensning, ved at enden av den frigjorte senen ikke kunne skilles fra arrvev under det andre kirurgiske inngrepet25.
Coleman et al. utviklet også en kronisk RC-tåremodell hos sau ved å dekke den transekterte senenden med en syntetisk membran på tidspunktet for den første operasjonen, noe som tillot næringsdiffusjon og effektivt minimert arrvevsdannelse rundt det skadede vevet, samtidig som diskrimineringen mellom senen og arrvevet ble forbedret26. I mellomtiden foreslo Turner et al. at en forsinket reparasjon skulle utføres innen 4 uker, siden direkte reattachment sjelden skjer i en massiv senetilbaketrekning27. Sammen har disse studiene bidratt til reproduserbare og pålitelige protokoller for vellykket etablering av en kronisk-lignende kanin SSC RC skademodell.
I denne protokollen etableres en kronisk-lignende kanin RC-skademodell ved 4 uker, der patologiske endringer relatert til fibrose og FD-mediert muskelatrofi kan studeres via histologiske vurderinger. Spesielt innpakning av den frie enden av muskel-senekrysset ved hjelp av en silikonbasert penroseslange på tidspunktet for den første operasjonen muliggjør klar identifisering av RC-vevet under den andre kirurgiske prosedyren, og følgelig letter en sikker reparasjon for å studere RC-helbredelse med og uten stillasforstørrelse. Alt i alt kan en kronisk lignende kanin SSC-modell bedre etterligne RC-patofysiologi og stille minimale tekniske og logistiske krav.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

Patofysiologien ved rotatormansjetten hos kanin (RC) kan føre til progressive og svært degenerative endringer i tilhørende muskulatur og sener, noe som negativt påvirker klinisk relevante parametere, som styrke og tilbaketrekning av muskel-senen/myotendinøs enhet, noe som til slutt forårsaker tap av skulderfunksjon og negativt påvirker RC-reparasjonsresultatene. Dyremodeller som etterligner aspekter av human RC-anatomi og patofysiologi er avgjørende for å fremme den konseptuelle forståelsen av skadeprogresjon og utvikle effektiv vevsteknikk og regenerativ medisinbasert terapi.
I denne sammenheng er en kanin subscapularis (SSC) modell egnet på grunn av (i) dens anatomiske likhet med den humane supraspinatus (SSP) bein-sene-muskelenheten, som er det hyppigst skadede RC-stedet; (ii) dens patofysiologiske likhet med mennesker når det gjelder fibrose og muskelfettdegenerasjon (FD); og (iii) dens evne til kirurgiske prosedyrer. Derfor er målet med denne studien å beskrive kirurgiske teknikker for å indusere SSC RC-skade. Kort fortalt innebærer prosedyren isolering av SSC ved å identifisere coracobrachialis-muskelen etterfulgt av en transeksjon i full tykkelse ved muskel-sene-krysset og innpakning av den frie enden av muskel-sene-krysset med et silikonbasert penroserør for å forhindre spontan reattachment. Histologiske evalueringer utføres for å overvåke utviklingen av muskel FD 4 uker etter operasjonen ved bruk av hematoksylin og eosin (H &E) samt Massons trikrome farging.
Tap av muskel og FD ble påvist 4 uker etter transeksjon av SSC muskel-sene-overgangen, tilsvarende humane RC patofysiologiske tilstander. Denne protokollen demonstrerer trinnene for vellykket etablering av en kronisk-lignende kanin SSC RC-skademodell, som kan tjene som et kraftig verktøy for å studere skjelettmuskulaturendringer assosiert med RC-patofysiologi og hjelpe utviklingen av nye terapeutiske strategier for kronisk-lignende RC-tårer.

For å vurdere kronisiteten til RC-patologi etter transeksjon av SSC-muskel-seneenheter, ble total vevsmorfologi og cellulære forandringer karakterisert via grov evaluering og histologisk analyse (henholdsvis H&E og Massons trichrome-farging) 4 uker etter skade (figur 2, figur 3 og figur 4). Representative bilder av grov vevsmorfologi viste forekomst av hvitt fettlignende vev i skadet SSC-muskulatur, noe som manglet i kontrollgruppen (figur 2). H&E-farging bekreftet tap av muskelcellularitet og organisering, som ble erstattet med et stort antall adipocytter (tomme rom omgitt av tynne kanter av cytoplasma som inneholdt komprimerte kjerner) i skadede SSC-muskler i forhold til kontrollgruppen (figur 3A).
Semi-kvantitativ vurdering av H&E-bilder viste en høy grad av intramuskulære adipocytter tilstede i skadede SSC-muskler (36,5 % ± 8,5 %) i forhold til kontrollgruppen (0,69 % ± 0,18 %) (figur 3B). Massons trikrome farging bekreftet også muskelatrofi og uorganiserte kollagenfiberarrangementer i skadede SSC-muskler i forhold til kontrollgruppen (figur 4A). Semi-kvantitativ vurdering av Massons trichrome-bilder viste en reduksjon i muskelcellularitet for skadede SSC-muskler (41,3 % ± 2,6 %) i forhold til kontrollgruppen (99,2 % ± 0,16 %) (figur 4B). Selv om ytterligere semi-kvantitativ vurdering ikke viste noen signifikant forskjell for fibrotisk vevsdannelse mellom skadet SSC-muskulatur (22,3 % ± 13,1 %) og kontrollgruppen (0,07 % ± 0,05 %), ble det observert høy grad av fibrose i skadet SSC-muskulatur (figur 4C). Sammen viste grov vevsmorfologi og histologisk analyse at skadet kanin SSC muskelsene viste alvorlig muskelatrofi, fettakkumulering og fibrose, som er kjente kjennetegn på kronisk RC-patofysiologi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> Figur 1 Kirurgisk prosedyre ved kronisk-liknende SSC muskel-seneskademodell. (A) Et kirurgisk vindu ble opprettet og anatomiske landemerker som humerus, humeral hode og kragebenet ble identifisert ved palpasjon. (B) Et 3,0 cm hudsnitt ble gjort dårligere enn kragebenet. (C) Coracobrachialis muskelen ble delt for å eksponere SSC-muskelen. (D) SSC muskel-sene-enheten ble isolert. (E) Et silikonbasert penrosedren ble brukt til å pakke inn SSC-muskel-senevevet. (F) SSC-muskelsenen ble transektert. (G) Coracobrachialis-muskelen ble retilnærmet ved hjelp av PGA-suturer. (H) Hudsnittet ble lukket ved hjelp av nylonsuturer. (I) Etter operasjonen fikk kaninene en myk krage å ha på seg. Forkortelser: SSC = subscapularis; PGA = polyglykolsyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> Figur 2 Brutto morfologi av representative SSC-muskler. Svarte piler representerer hvitt fettvev. Forkortelse: SSC = subscapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> Figur 3 Histologisk analyse av kronisk liknende RC-skademodell ved 4 uker. (A) Representative H&E-fargede histologibilder viste atrofiske muskelfibre og akkumulering av adipocytter. (B) Kvantifisering av skadet muskelfettakkumuleringsprosent. n = 3 kaniner. Feilfelt angir SEM. *, statistisk signifikant (s≤ 0,05). Skalastenger = 5000 μm (A, venstre kolonne), 600 μm (A, høyre kolonne). Forkortelser: SSC = subscapularis; RC = rotator mansjett; H&E = hematoksylin og eosin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> Figur 4 Histologisk analyse av kronisk liknende RC-skademodell ved 4 uker. (A) Massons trikromefargede bilder viste betydelig fibrose. Fibrøst bindevev er farget blått. (B) Kvantifisering av andelen muskler og (C) fibrotisk vev. n = 3 kaniner. Feilfelt angir SEM. *, statistisk signifikant (s≤ 0,05). Skalastolper = 5000 μm (A, venstre kolonne), 200 μm (A, høyre kolonne). Forkortelser: SSC = subscapularis; RC = rotator mansjett. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

Denne studien beskriver prosedyrer for å etablere en kronisk lignende kaninrotatormansjett (RC) skade. Spesielt er skaden opprettet i subscapularis (SSC) muskel-sene / myotendinøs enhet for å etterligne human RC-anatomi og patofysiologi, inkludert alvorlig muskelfettdegenerasjon (FD). Denne protokollen kan brukes til å studere RC-skader og vurdere regenerative terapier.

Utvikling av en kanin kronisk-lignende rotator mansjett skade modell for studier av fibrose og muskelfett degenerasjon

Rabbit rotator cuff (RC) pathophysiology can lead to progressive and highly degenerative changes in its associated musculature and tendons, which ...

Denne protokollen demonstrerer en kompleks kirurgisk teknikk for å indusere en kronisk-lignende rotatormansjettskade hos kaniner, og er nyttig for å studere patogenesen for rotatormansjett og utvikle regenerative terapier. Kaniner er middels til store dyremodeller som er enkle å huse logistisk, manipulere kirurgisk og viser høye nivåer av rotatormansjettmuskelfettdegenerasjon når de er skadet, i likhet med mennesker. Subscapularis skademodellen vist her er anatomisk analog med supraspinatus bensenemuskelkompleks, en av de hyppigst skadede rotatormansjettenhetene.For å begynne, klargjør det kirurgiske vinduet ved å barbere det tiltenkte snittstedet til en bedøvet kanin. Bruk bomullspinner og rengjør området med tre vekslende påføringer av Betadin og 70 % alkohol i sirkulære bevegelser. Administrer 20 milligram per kilo cephalexin intramuskulært som et profylaktisk antiinfeksjonsmiddel.Gjør et tre til fire centimeter hudsnitt dårligere enn kragebenet, del deltopectoral intervallet med en saks, og trekk inn for å få tilgang til skulderen. For å finne subscapularis muskelsene, må du først identifisere coracobrachialis muskelen. Identifiser deretter subscapularissenen og sett inn en rettvinklet klemme for å eksponere hele senen ved innføringen på humerusens mindre tuberositet.Isoler subscapularis muskelsenen. Etter administrering av smertestillende middel før kirurgi lokalt nær transeksjonsstedet, pakk subscapularis muskelseneenheten i silikonbasert penroseslange for å forhindre uønsket vedlegg til det omkringliggende vevet og hjelpe påfølgende vevhenting. For å indusere skade, opprett en full tykkelse transeksjon ved muskel sene krysset ved hjelp av en kirurgisk nummer 11 skalpell.Stopp blødningen ved å påføre trykk med et stykke gasbind og bruk saltvann for å irrigere såret etter behov. For å lukke såret, bruk en 4-0 polyglykolsyresutur for å reapproximere deltoidmuskelvevet og en 4-0 nylon- eller silkessutur for å lukke hudsåret, etterfulgt av sårrengjøring. Administrer 0,03 milligram per kilo buprenorfin subkutant som smertestillende middel én gang umiddelbart etter operasjonen, og to ganger daglig de neste 48 timene.Den histologiske analysen av den kronisk-lignende rotatormansjettskademodellen ved fire uker er vist i denne figuren. H&E-fargingen bekreftet tap av muskelcellularitet og organisering, som ble erstattet med et stort antall adipocytter i skadede subskapularismuskler i forhold til kontrollgruppen. Kvantifiseringen av den skadede muskelfettakkumuleringsprosenten er presentert i denne figuren.Massons trichrome-farging bekreftet også muskelatrofi og uorganiserte kollagenfiberarrangementer i skadede subscapularis-muskler i forhold til kontrollgruppen. Kvantifiseringen av andelen muskel og fibrotisk vev er vist i denne figuren. Vurderingen viste en reduksjon i muskelcellularitet for skadde subscapularismuskler i forhold til kontrollgruppen.Det ble også observert høy grad av fibrose i skadde subscapularis-muskler. Identifisering av subscapularis-senen og innpakning av subscapularis muskelseneenhet i penroserør er de viktigste trinnene i denne prosedyren. Etter denne prosedyren kan en terapeutisk inngrep brukes.I dette tilfellet kan analysene som er beskrevet her, sammen med ytterligere myografi eller ganganalyse, brukes til å vurdere intervensjonsutfallet. Denne teknikken er avgjørende for å hjelpe forskere i studiet av patofysiologi med rotatormansjetten, samt legge til rette for utvikling av nye terapier for reparasjon og regenerering av muskelsener.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolasjon, Kultur, og Transplantasjon av Muscle satellitt celler

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Tilskudd av flerumettede fettsyrer i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...