Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

A investigação de Dai Fei Elmer Ker é apoiada pelo financiamento dos Serviços de Alimentação e Saúde, RAE de Hong Kong (Fundo de Investigação e Medicina de Saúde: 08190466), Comissão de Inovação e Tecnologia, RAE de Hong Kong (Prémio Tier 3: ITS/090/18; Health@InnoHK programa), Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong, RAE de Hong Kong (Prêmio do Esquema de Início de Carreira: 24201720 e Fundo Geral de Pesquisa: 14213922) e Universidade Chinesa de Hong Kong (Prêmio de Inovação da Faculdade: FIA2018/A/01). A investigação de Dan Wang é apoiada por financiamento do Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK programa) e Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong, RAE de Hong Kong (Fundo Geral de Pesquisa: 14118620 e 14121121).

Todos os procedimentos devem ser realizados com técnica cirúrgica estéril em sala apropriadamente equipada e destinada a cirurgias em animais, de acordo com protocolo aprovado pelo comitê de ética em experimentação animal do instituto. No presente estudo, as cirurgias em coelhos foram realizadas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Chinesa de Hong Kong.
1. Procedimento cirúrgico
<ol><li>Para preparar a área cirúrgica, pré-aqueça uma almofada de aquecimento e sobreponha-a com campos cirúrgicos estéreis para manter a temperatura corporal do coelho. Em seguida, dispor ferramentas e insumos cirúrgicos esterilizados (conforme especificado na Tabela de Materiais) e organizá-los de acordo com a preferência do cirurgião.</li>
	<li>Induzir anestesia através da administração intramuscular de 35 mg/kg de quetamina e 5 mg/kg de xilazina a coelhos brancos da raça Nova Zelândia (pesando entre 3,5 e 4,5 kg, cerca de 5-6,5 meses de idade; dois coelhos machos e uma fêmea foram usados neste estudo). Posteriormente, confirme a anestesia com um teste de pinça de pata e/ou cauda.</li>
	<li>Se houver necessidade de anestesia adicional para sustentar o plano cirúrgico, administrar 10 mg/kg de quetamina e 3 mg/kg de xilazina por via intravenosa através da veia marginal da orelha28 e monitorar a frequência respiratória do animal em intervalos regulares de 5-10 min.</li>
	<li>Para preparar a janela cirúrgica, raspe o local da incisão pretendido (a região da pele superficial à unidade músculo-tendínea do CSC) e limpe com três aplicações alternadas de betadina e álcool a 70%. Use um cotonete para aplicar betadina e álcool 70% em movimentos circulares (de dentro para fora). Use pomada ocular para manter os olhos do coelho úmidos e lubrificados. Administrar 20 mg/kg de cefalexina por via intramuscular como agente anti-infeccioso.</li>
	<li>Realizar incisão cutânea inferior à clavícula de 3 a 4 cm, dividir o intervalo deltopeitoral com bisturi cirúrgico nº 11 e retrair para acesso ao ombro (Figura 1A,B).</li>
	<li>Para localizar a unidade músculo-tendão do CSC, primeiramente, identifique o músculo coracobraquial (como tecido que recobre a fixação do tendão do CSC) e divida-o. Em seguida, identificar o tendão do CSC e inserir uma pinça de ângulo reto para expor todo o tendão do CSC em sua inserção na tuberosidade menor do úmero (Figura 1C).</li>
	<li>Antes da introdução da lesão, isolar o músculo-tendão do CCE (Figura 1D) e administrar anestésico intraoperatório (bupivacaína a 0,5% na dose de 0,2 mg/kg) localmente próximo ao local da transecção. Envolver a unidade músculo-tendão do CSC em tubo penrose à base de silicone (Figura 1E) para evitar a fixação indesejada aos tecidos circundantes e auxiliar a recuperação subsequente do tecido.</li>
	<li>Para induzir a lesão, criar uma transecção de espessura total na junção músculo-tendão usando um bisturi cirúrgico nº 11 (Figura 1F). Quando necessário, pare de sangrar aplicando pressão com um pedaço de gaze e use soro fisiológico para irrigar a ferida conforme necessário.</li>
	<li>Para o fechamento da ferida, utilizar-se fio de ácido poliglicólico (PGA) 4-0 para reaproximação do tecido muscular deltoide (Figura 1G) e fio de náilon 4-0 para fechamento da ferida cutânea (Figura 1H).</li>
	<li>Prestar cuidados pós-operatórios através da administração subcutânea de 0,03 mg/kg de buprenorfina como analgésico (uma vez imediatamente após a cirurgia e duas vezes ao dia pelas próximas 48 h29).</li>
	<li>Permitir que os coelhos se recuperem em uma bolsa térmica coberta e aplicar um colar macio para evitar comportamentos indesejados, incluindo automutilação, lambedura de locais cirúrgicos e remoção de suturas (Figura 1I).</li>
	<li>Monitorar os animais quanto ao peso e mudanças comportamentais. Relate qualquer diminuição de mais de 10% do peso corporal e dor intensa que não possa ser controlada (avaliada com base em cinco ações comportamentais: aperto orbital, achatamento das bochechas, mudanças na forma das narinas, mudanças de posição do bigode e mudanças na forma e posição da orelha) ao veterinário para determinar se a intervenção, como a eutanásia precoce, é necessária.</li>
</ol>2. Colheita do espécime
<ol><li>Eutanasiar os coelhos às 4 semanas do momento da lesão. Anestesiar os coelhos e administrar uma dose letal de pentobarbital sódico (mais de 60 mg/kg). Confirmar óbito por toracotomia.</li>
	<li>Identificar a cabeça do úmero e excisá-la cirurgicamente, preservando os tubérculos maiores e menores e todos os anexos de tecidos moles. Fixar com paraformaldeído (PFA) a 4% durante 72 h a 4 °C antes de transferir para uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% durante 1 mês à temperatura ambiente (com troca de meios a cada 72 horas) para descalcificar o osso.</li>
	<li>Após a descalcificação, submeter as amostras ao processamento histológico padrão com desidratação graduada de etanol, inclusão em parafina, corte histológico (cortes de 8 μm) e coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e soluções tricrômicas de Masson30,31,32.</li>
	<li>Capture imagens com um microscópio vertical em aumento de 10x.</li>
	<li>Realizar a semiquantificação das imagens do H&E e tricrômico de Masson medindo a área e a porcentagem de músculo, tecido fibroso e gordura dentro do músculo, como descritoanteriormente33,34, usando um software de design gráfico de escolha. Neste exemplo, o software Adobe Photoshop (https://www.adobe.com) é usado.<ol><li>Selecione uma região de uma cor específica que represente um determinado tipo de tecido usando a ferramenta varinha mágica (vermelho é tecido muscular, azul é fibrose e branco representa gordura).</li>
		<li>Clique nos itens de menu Selecionar | Inverso | Salvar seleção | Nomeie a seção.</li>
		<li>Conte o número de pixels dentro da região marcada clicando em itens de menu Janela | Log de Medição | Registrar medição para registrar esses valores de pixel e calcular manualmente a porcentagem dos tipos de tecido selecionados.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise estatística
<ol><li>Para os dados histológicos, realizar a análise estatística utilizando o software analítico de escolha. Realizar o teste t de Student para a comparação de duas amostras independentes entre os grupos controle e lesionado.</li>
	<li>Expresse os dados como média ± erro padrão da média. Considere-se um valor de p de <0,05 como estatisticamente significativo.</li>
</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.

Um modelo animal reprodutível e fisiologicamente relevante fornece a capacidade de avançar na compreensão da patogênese da doença, avaliar os resultados de terapias clínicas e melhorar e desenvolver tratamentos cirúrgicos35. Neste estudo, um modelo confiável e preciso de CCE em coelhos que mimetiza aspectos da anatomia e fisiopatologia do CR humano foi estabelecido. As rupturas do MR estão relacionadas a alterações degenerativas musculares progressivas e provavelmente irreversíveis, resultando em um potencial de cicatrização reduzido. Por exemplo, Ko et al., mostraram que a reinserção do SSP de coelho em 6 semanas não reverteu atrofia muscular ou DF nas 6 semanas seguintes. Essa atrofia muscular mediada pela DF influencia vários parâmetros clínicos importantes, incluindo a força tendão-muscular e a amplitude de movimento articular, o que pode afetar os resultadoscirúrgicos 36,37.
O protocolo aqui estabelecido mostrou atributos crônicos significativos após a transecção das unidades músculo-tendíneas do CSC. Especificamente, essas alterações incluem visivelmente diminuição da massa muscular e aumento do conteúdo adiposo e do tecido fibrótico (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). Esses achados são consistentes com alterações degenerativas relatadas em lesões humanas do MR38. Nos últimos anos, o rato emergiu como um dos modelos animais mais intensamente estudados para doença e lesão do MR devido às suas altas semelhanças anatômicas com SSPs humanos e de ratos viajando sob o acrômio38,39,40. Entretanto, deve-se ressaltar que a porção de SSP de ratos que passa sob o arco acromial é muscular e não tendínea, como é o caso emhumanos41. Barton e col. reconheceram a falta de acúmulo significativo de gordura após o descolamento do tendão do SSP em ratos23, o que contrasta com a condição humana42. Como tal, acredita-se que o complexo SSC de coelhos possa fornecer um modelo apropriado para mimetizar a ruptura crônica do MR de humanos.
Para garantir a reprodutibilidade desse modelo, dois pontos merecem destaque na realização desse protocolo. Primeiro, após a transecção das unidades músculo-tendinosas, a extremidade livre do tendão transeccionado pode estar em risco de formar aderências, o que pode tornar a recuperação tendínea desafiadora para manipulações subsequentes. Para evitar esse problema, uma tubulação de silicone não reabsorvível foi usada para envolver a extremidade livre da junção músculo-tendão após a transecção para evitar a adesão espontânea aos tecidos circundantes, bem como a cicatrização espontânea (Figura 1E). Além disso, a unidade músculo-tendínea transeccionada durante um segundo procedimento para intervenção (ou seja, para realizar um reparo seguro; dados não mostrados) pode ser claramente identificada envolvendo a extremidade dos tecidos lesados no momento da cirurgia inicial. Essa técnica é econômica, eficaz e pode ser facilmente implementada emcirurgia43. Em segundo lugar, os coelhos são uma espécie altamente sensível que pode exibir comportamento prejudicial após a cirurgia. Para evitar tais problemas, é altamente recomendável que um colar mole também seja aplicado para prevenir comportamentos indesejados, incluindo automutilação, lambedura de sítios cirúrgicos e remoção de suturas (Figura 1I). Em comparação com os colares E comercialmente convencionais que são feitos de plástico rígido, o colar macio de fabricação própria não causou nenhuma lesão na pele ou outros efeitos colaterais que afetaram o bem-estar animal ou a qualidade da investigação científica. Em conjunto, tais etapas são fundamentais para criar um modelo de lesão do MR de coelho reprodutível com precisão e fornecer a possibilidade de estudar as estratégias de reparo regenerativo.
Para estudar a fisiopatologia e a cicatrização tendínea em modelo animal, uma lesão distinta e reprodutível deve ser criada, e os momentos de estudo devem ser cuidadosamente selecionados. A grande maioria dos estudos sobre lesão e cicatrização tendínea foi realizada em tendões animais totalmentetranseccionados44, pois a transecção é um procedimento simples, altamente reprodutível e capaz de simular adequadamente o cenário clínico45,46. Huegel e col. mostraram que a lesão de um tendão parcialmente transeccionado era menos grave do que a de um tendão totalmente transeccionado, e a imobilização teve um efeito prejudicial na mecânica do tendão, incluindo aumento da rigidez articular47. Para avaliar a atrofia e a DF que se verificam no cenário de ruptura maciça do MR, é essencial definir os momentos característicos observados experimentalmente. validaram um modelo de lesão do MR em coelho macho e observaram atrofia muscular em 2 e 6 semanas, com aumento do conteúdo de gordura em momentos posteriores (menos de 5% de gordura em 2 semanas vs. mais de 10% de gordura em 6 semanas), consistente com o processo patológico observado em rupturas de CR humano11. Neste estudo, uma ruptura maciça do MR foi criada pela transecção da unidade músculo-tendão do CSC em coelhos machos e fêmeas por 4 semanas, o que resultou em DF do músculo SSC (36,5% de gordura). Assim, um período de 4 semanas é apropriado para gerar DF do músculo SSC em coelhos brancos da raça Nova Zelândia, machos e fêmeas.
Existem várias limitações para este estudo. Estes incluem: (i) etapas associadas à geração de modelos animais, como um ponto de tempo relativamente curto e materiais potencialmente inflamatórios (tubos de penrose à base de silicone) para geração de lesões crônicas; (ii) caracterização e análise de modelos animais, como falta de análise da marcha e eletromiografia para avaliar a cinemática articular e a geração de força contrátil muscular; e (iii) comparação de modelos animais, como falta de comparação com outros sítios de lesão do MR.
Em termos de geração de modelo, as lesões do MR humano tipicamente envolvem atrofia progressiva e DF que podem ocorrer ao longo de vários anos, o que é relativamente mais longo do que o ponto de tempo de 4 semanas relatado aqui. Isso é considerado aceitável, uma vez que um modelo animal que gera cerca de 36,5% de gordura intramuscular em um período de tempo relativamente curto será logisticamente conveniente e pode ser prolongado se necessário. Além disso, a biocompatibilidade de implantes à base de silicone, como o tubo de penrose, tem sido fonte de controvérsia de longa data devido a relatos de resposta imune celular e inflamação47; portanto, um material inerte alternativo, como o polietilenoglicol (PEG), pode ser substituído para envolver o tendão ressecado se prosseguir estudos de CR associados à inflamação.
Em termos de caracterização e análise de modelos animais, a falta de análise da marcha49 e de estudos eletromiográficos50 pode limitar os achados do estudo a dados histológicos qualitativos. Esses aspectos poderão ser abordados em estudos futuros utilizando a análise de movimento por vídeo51 e a eletromiografia desuperfície50 para gerar dados quantitativos sobre a cinemática do ombro e o desempenho muscular do MR.
Em termos de comparação de modelos, uma vez que os tendões SSP e infraespinal em coelhos também têm sido amplamente utilizados para estudos de MR, comparar a gravidade da lesão, incluindo a DF entre esses diferentes sítios de lesão no futuro, identificará locais adicionais para otimização do modelo.
Em resumo, este estudo desenvolveu um protocolo para modelagem de lesões crônicas do MR em coelhos machos e fêmeas. Esse modelo é conveniente para os investigadores devido à sua simplicidade (transecção) e período relativamente curto para induzir cronicidade (4 semanas), gerando um grande grau (36,5%) de DF intramuscular. Dessa forma, espera-se que este protocolo auxilie os investigadores no estudo da fisiopatologia do MR, bem como facilite o desenvolvimento de novas terapêuticas para o reparo e regeneração músculo-tendíneo.

As roturas crônicas do manguito rotador (MR) são caracterizadas por alterações degenerativas da musculatura e dos tendões, incluindo atrofia muscular, acúmulo de tecido adiposo e fibrose, que podem comprometer o resultado do reparo do MR e, em última instância, causar dor e disfunção no ombro1,2,3,4,5 . Para melhor compreender a patogênese da lágrima do MR e melhorar os resultados cirúrgicos, é crucial desenvolver modelos animais apropriados que possam mimetizar aspectos da anatomia e fisiopatologia do MR humano. Especificamente, os modelos de lesão do MR devem atender aos seguintes critérios: (i) ausência de cicatrização espontânea após a lesão; (ii) conter presença significativa de fibrose, atrofia muscular e acúmulo de tecido adiposo; e (iii) ser de tamanho adequado para permitir a aproximação das técnicas cirúrgicas utilizadas em humanos6.
Dentro desse contexto, o músculo subescapular de coelho (SSC) pode ser utilizado como um modelo animal preciso e confiável para o estudo da fisiopatologia do MR, dada sua anatomia, resposta fisiopatológica e propriedades biomecânicasúnicas7. De fato, a anatomia do CR do CC do coelho é semelhante ao do supraespinhal humano (SSP), que é a unidade músculo-tendínea mais frequentemente associada à lesão decorrente do uso excessivo 8,9. Especificamente, o complexo tendíneo SSC do coelho passa através de um túnel ósseo e sob o músculo coracobraquial, o que é análogo à situação em humanos em que o complexo tendíneo SSP passa através do túnel ósseo subacromial e sob o ligamento coracoacromial7. Essa semelhança anatômica resulta em SSC de coelhos submetidos a movimentos musculoesqueléticos semelhantes aos do SSP humano, em que o tendão viaja sob o acrômio durante a elevação e abdução do úmero 7,10.
Além disso, alterações histopatológicas, semelhantes às rupturas do MR humano11, foram observadas no coelho após a ruptura do CSC. Especificamente, o ventre muscular sofre DF severa, com perda significativa de massa muscular, diminuição da área de secção transversa das fibras musculares e aumento da adiposidade. Além disso, Otarodifard e col. avaliaram as características biomecânicas do CSC de coelhos após (1) técnicas de reparo com uma fileira, (2) dupla fileira e (3) equivalente transósseo do MR, e verificaram que as características biomecânicas iniciais desses reparos foram semelhantes aos reparos do SSP humano realizados em espécimescadavéricos12. Dessa forma, a semelhança anatômica, fisiológica e biomecânica da SSC de coelhos com a SSP humana a torna útil para a modelagem de lesões do MR.
Embora muitas espécies de animais, incluindo ratos, camundongos, cães e ovelhas, tenham sido utilizadas no estudo da doença e reparo do MR 6,13,14,15, o grau de cronicidade da lesão é uma consideração fundamental. Isso ocorre porque as rupturas do MR podem ser assintomáticas e muitas vezes podem ser diagnosticadas muito mais tarde, quando a ruptura aumentou e se tornou crônica por natureza, com tanto o tendão quanto o músculo exibindo degeneração grave16,17,18. Entretanto, a maioria dos modelos de reparo do MR emprega modelos de lesão aguda, em que o tendão normal é transeccionado e imediatamente reparado 19,20,21,22. Isso ocorre, em grande parte, por razões de conveniência logística e facilidade técnica, resultando em poucos estudos que examinam a fisiopatologia do MR em um cenário crônico. Além disso, vários modelos animais podem possuir atributos que dificultam sua utilização para estudos crônicos de CR.
Por exemplo, embora o rato tenha sido extensivamente usado para modelar a ruptura e intervenção do MR, a falta de acúmulo adiposo significativo após a lesão contrasta com a condição humana, e seu pequeno tamanho torna os procedimentos cirúrgicos repetidosdesafiadores23. Além disso, embora Gerber e col. tenham utilizado o infraespinhal de ovinos para estudar atrofia muscular e DF após ruptura crônica do MR24, existe alguma dissimilaridade anatômica entre o infraespinhal ovino e o SSP humano, bem como inúmeros desafios logísticos para estudar e abrigar um modelo animal tão grande. Além disso, Gerber e col. desenvolveram um modelo de lesão tardia do MR em ovelhas, liberando a cabeça superficial do músculo infraespinhal e tendão para mimetizar as características de uma ruptura crônica do MR, e então avaliaram a eficácia de diferentes técnicas de reparo no tendão em 4 a 6 semanas. Infelizmente, esse modelo de carneiro crônico possuía uma limitação, na medida em que o final do tendão liberado tornou-se indistinguível do tecido cicatricial durante o segundo procedimentocirúrgico25.
Coleman e col. também desenvolveram um modelo de ruptura crônica do MR em ovelhas, cobrindo a extremidade do tendão transeccionado com uma membrana sintética no momento da cirurgia inicial, o que permitiu a difusão de nutrientes e minimizou eficientemente a formação de tecido cicatricial ao redor do tecido lesado, melhorando a discriminação entre o tecido tendíneo e cicatricial26. Turner e col. sugeriram que um reparo tardio deveria ser realizado dentro de 4 semanas, uma vez que a reinserção direta raramente ocorre em uma retração tendínea maciça27. Em conjunto, esses estudos contribuíram para protocolos reprodutíveis e confiáveis para o estabelecimento bem-sucedido de um modelo de lesão crônica do CR do coelho.
Neste protocolo, um modelo de lesão crônica do MR de coelho é estabelecido em 4 semanas, no qual alterações patológicas relacionadas à fibrose e atrofia muscular mediada por DF podem ser estudadas por meio de avaliações histológicas. Em particular, o envolvimento da extremidade livre da junção músculo-tendão usando um tubo penrose à base de silicone no momento da cirurgia inicial permite a identificação clara dos tecidos do MR durante o segundo procedimento cirúrgico e, consequentemente, facilita um reparo seguro para estudar a cicatrização do MR com e sem aumento do scafold. Em conjunto, um modelo de CSC de coelho semelhante ao crônico pode mimetizar melhor a fisiopatologia do MR e apresentar requisitos técnicos e logísticos mínimos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

A fisiopatologia do manguito rotador (MR) de coelhos pode levar a alterações progressivas e altamente degenerativas em sua musculatura e tendões associados, o que influencia negativamente parâmetros clinicamente relevantes, como força e retração da unidade músculo-tendão/miotendíneo, causando perda da função do ombro e afetando negativamente os resultados do reparo do MR. Modelos animais que mimetizam aspectos da anatomia e fisiopatologia humana do CR são cruciais para avançar na compreensão conceitual da progressão da lesão e desenvolver engenharia tecidual eficaz e terapêutica baseada em medicina regenerativa.
Nesse contexto, um modelo de subescapular de coelho (SSC) é adequado devido (i) à sua semelhança anatômica com a unidade osso-tendão-músculo do supraespinhal humano (SSP), que é o sítio mais frequentemente lesado do MR; (ii) sua semelhança fisiopatológica com o homem em termos de fibrose e degeneração gordurosa muscular (DF); e (iii) sua facilidade para procedimentos cirúrgicos. Portanto, o objetivo deste estudo é descrever as técnicas cirúrgicas para indução da lesão do CR do CSC. Resumidamente, o procedimento envolve o isolamento do CSC por meio da identificação do músculo coracobraquial, seguido de uma transecção de espessura total na junção músculo-tendão e envolvendo a extremidade livre da junção músculo-tendão com um tubo penrose à base de silicone para evitar a reconexão espontânea. Avaliações histológicas são realizadas para monitorar a progressão da DF muscular 4 semanas após a cirurgia usando hematoxilina e eosina (H&E), bem como a coloração tricrômico de Masson.
A perda de músculo e DF foi evidente 4 semanas após a transecção da junção músculo-tendão do CSC, semelhante às condições fisiopatológicas do MR humano. Este protocolo demonstra os passos para o estabelecimento bem-sucedido de um modelo de lesão crônica do CR de coelhos SSC, que pode servir como uma ferramenta poderosa para estudar as alterações musculares esqueléticas associadas à fisiopatologia do MR e auxiliar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para as lesões crônicas do MR.

Para avaliar a cronicidade da patologia do MR após a transecção das unidades músculo-tendinosas do CSC, a morfologia tecidual global e as alterações celulares foram caracterizadas por meio de avaliação macroscópica e análise histológica (coloração H&E e tricrômico de Masson, respectivamente), 4 semanas após a lesão (Figura 2, Figura 3 e Figura 4 ). Imagens representativas da morfologia tecidual macroscópica mostraram o aparecimento de tecido adiposo branco nos músculos lesados do CSC, que estava ausente no grupo controle (Figura 2). A coloração H&E confirmou a perda da celularidade e organização muscular, que foi substituída por grande número de adipócitos (espaços vazios circundados por finas bordas de citoplasma que continham núcleos comprimidos) nos músculos lesados da SSC em relação ao grupo controle (Figura 3A).
A avaliação semiquantitativa das imagens de H&E mostrou um alto grau de adipócitos intramusculares presentes nos músculos lesados do CSC (36,5% ± 8,5%) em relação ao grupo controle (0,69% ± 0,18%) (Figura 3B). A coloração tricrômico de Masson também confirmou atrofia muscular e desorganização do arranjo das fibras colágenas nos músculos lesados do CSC em relação ao grupo controle (Figura 4A). A avaliação semiquantitativa das imagens tricrômicas de Masson mostrou redução da celularidade muscular dos músculos SSC lesados (41,3% ± 2,6%) em relação ao grupo controle (99,2% ± 0,16%) (Figura 4B). Embora a avaliação semiquantitativa posterior não tenha mostrado diferença significativa para a formação de tecido fibrótico entre os músculos SSC lesados (22,3% ± 13,1%) e o grupo controle (0,07% ± 0,05%), um alto grau de fibrose foi observado nos músculos lesados SSC (Figura 4C). Em conjunto, a morfologia do tecido macroscópico e a análise histológica mostraram que o músculo-tendão do CSC do coelho lesado exibiu atrofia muscular grave, acúmulo de gordura e fibrose, que são características conhecidas da fisiopatologia crônica do CR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> Figura 1: Procedimento cirúrgico para modelo de lesão músculo-tendínea crônica do CSC. (A) Uma janela cirúrgica foi criada e pontos anatômicos como úmero, cabeça umeral e clavícula foram identificados por palpação. (B) Uma incisão cutânea de 3,0 cm foi inferior à clavícula. (C) O músculo coracobraquial foi bipartido para expor o músculo SSC. (D) A unidade músculo-tendão do CCE foi isolada. (E) Um dreno penrose à base de silicone foi usado para envolver o tecido músculo-tendão do CSC. (F) O músculo-tendão do CCS foi transeccionado. (G) O músculo coracobraquial foi reaproximado com sutura de PGA. (H) A incisão da pele foi fechada com fio de náilon. (I) No pós-operatório, os coelhos receberam um colar macio para usar. Abreviações: SSC = subescapular; PGA = ácido poliglicólico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> Figura 2: Morfologia macroscópica dos músculos representativos do CSC. As setas pretas representam tecidos adiposos brancos. Abreviação: SSC = subescapular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> Figura 3: Análise histológica do modelo de lesão crônica do MR com 4 semanas. (A) Imagens histológicas representativas coradas com H&E mostraram fibras musculares atróficas e acúmulo de adipócitos. (B) Quantificação do percentual de acúmulo de gordura muscular lesada. n = 3 coelhos. Barras de erro indicam MEV.*, estatisticamente significante (p≤ 0,05). Barras de escala = 5.000 μm (A, coluna da esquerda), 600 μm (A, coluna da direita). Abreviações: SSC = subescapular; CR = manguito rotador; H&E = hematoxilina e eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> Figura 4: Análise histológica do modelo de lesão crônica do MR com 4 semanas. (A) As imagens tricrômicos coradas por Masson mostraram fibrose substancial. O tecido conjuntivo fibroso é corado de azul. (B) Quantificação da proporção de tecido muscular e (C) fibrótico. n = 3 coelhos. Barras de erro indicam MEV.*, estatisticamente significante (p≤ 0,05). Barras de escala = 5.000 μm (A, coluna da esquerda), 200 μm (A, coluna da direita). Abreviações: SSC = subescapular; CR = manguito rotador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

Este estudo detalha os procedimentos para o estabelecimento de uma lesão crônica do manguito rotador (MR) de coelhos. Especificamente, a lesão é criada na unidade músculo-tendão/miotendíneo subescapular (SSC) para mimetizar a anatomia e fisiopatologia do MR humano, incluindo degeneração gordurosa muscular (DF) grave. Este protocolo pode ser aplicado para estudar lesões do MR e avaliar terapias regenerativas.

Desenvolvimento de um modelo de lesão crônica do manguito rotador de coelhos para estudo de fibrose e degeneração gordurosa muscular

Rabbit rotator cuff (RC) pathophysiology can lead to progressive and highly degenerative changes in its associated musculature and tendons, which ...

Este protocolo demonstra uma técnica cirúrgica complexa para induzir uma lesão crônica do manguito rotador em coelhos, sendo útil no estudo da patogênese do manguito rotador e no desenvolvimento de terapias regenerativas. Os coelhos são modelos animais de médio a grande porte, fáceis de alojar logisticamente, manipulados cirurgicamente e apresentarem altos níveis de degeneração gordurosa do músculo do manguito rotador quando lesionados, semelhante aos humanos. O modelo de lesão subescapular mostrado aqui é anatomicamente análogo ao complexo muscular do tendão ósseo do supraespinal, uma das unidades do manguito rotador mais frequentemente lesadas.Para começar, prepare a janela cirúrgica raspando o local de incisão pretendido de um coelho anestesiado. Usando cotonetes, limpe a área com três aplicações alternadas de Betadine e álcool 70% em movimentos circulares. Administrar 20 miligramas por quilograma de cefalexina por via intramuscular como agente anti-infeccioso profilático.Faça uma incisão cutânea de três a quatro centímetros inferior à clavícula, divida o intervalo deltopeitoral com uma tesoura e retraia para ter acesso ao ombro. Para localizar a unidade tendínea do músculo subescapular, primeiro identifique o músculo coracobraquial. Em seguida, identifique o tendão subescapular e insira uma pinça de ângulo reto para expor todo o tendão em sua inserção na tuberosidade menor do úmero.Isolar o tendão do músculo subescapular. Após a administração de analgésico pré-cirúrgico localmente próximo ao local da transecção, envolva a unidade tendínea do músculo subescapular em tubo penrose à base de silicone para evitar a fixação indesejada aos tecidos circundantes e auxiliar a recuperação subsequente do tecido. Para induzir a lesão, crie uma transecção de espessura total na junção do tendão muscular usando um bisturi cirúrgico número 11.Quando necessário, pare de sangrar aplicando pressão com um pedaço de gaze e use soro fisiológico para irrigar a ferida conforme necessário. Para fechar a ferida, utilizar sutura com ácido poliglicólico 4-0 para reaproximar o tecido muscular deltoide e fio de náilon ou seda 4-0 para fechar a ferida cutânea, seguida de limpeza da ferida. Administrar 0,03 miligramas por quilograma de buprenorfina por via subcutânea como analgésico uma vez imediatamente após a cirurgia e duas vezes ao dia nas próximas 48 horas.A análise histológica do modelo de lesão crônica do manguito rotador com quatro semanas é mostrada nesta figura. A coloração de H&E confirmou a perda da celularidade e organização muscular, que foi substituída por grande número de adipócitos nos músculos subescapulares lesados em relação ao grupo controle. A quantificação do percentual de acúmulo de gordura muscular lesada é apresentada nesta figura.A coloração tricrômico de Masson também confirmou atrofia muscular e desorganização dos arranjos das fibras colágenas nos músculos subescapulares lesados em relação ao grupo controle. A quantificação da proporção de tecido muscular e fibrótico é mostrada nesta figura. A avaliação mostrou redução da celularidade muscular dos músculos subescapulares lesados em relação ao grupo controle.Um alto grau de fibrose também foi observado nos músculos subescapulares lesados. A identificação do tendão subescapular e o envolvimento da unidade tendínea do músculo subescapular na tubulação penrose são as etapas mais importantes desse procedimento. Após este procedimento, uma intervenção terapêutica pode ser aplicada.Nesse caso, as análises aqui descritas, juntamente com miografia adicional ou análise da marcha, podem ser usadas para avaliar o resultado da intervenção. Esta técnica é crucial para auxiliar os pesquisadores no estudo da fisiopatologia do manguito rotador, bem como facilitar o desenvolvimento de novas terapêuticas para o reparo e regeneração do tendão muscular.

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