Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Исследование Дай Фэй Элмер Кер финансируется Бюро по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Гонконга (Фонд здравоохранения, медицины и исследований: 08190466), Комиссии по инновациям и технологиям, САР Гонконг (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK программы), Совет по исследовательским грантам Гонконга, САР Гонконг (Early Career Scheme Award: 24201720 и General Research Fund: 14213922) и Китайский университет Гонконга (Faculty Innovation Award: FIA2018/A/01). Исследование Дэна Вана финансируется Бюро по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Гонконга (Health Medical and Research Fund, 07180686), Комиссии по инновациям и технологиям САР Гонконг (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK программы) и Совет по исследовательским грантам Гонконга, САР Гонконг (Общий исследовательский фонд: 14118620 и 14121121).

Все процедуры должны проводиться с использованием стерильной хирургической техники в соответствующим образом оборудованном помещении, предназначенном для операций на животных, в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по этике экспериментов на животных института. В настоящем исследовании операции на кроликах проводились в соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по этике экспериментов на животных Китайского университета Гонконга.
1. Хирургическое вмешательство
<ol><li>Для подготовки операционного поля предварительно разогрейте грелку и наложите на нее стерильные хирургические простыни, чтобы поддерживать температуру тела кролика. Затем разложите стерилизованные хирургические инструменты и расходные материалы (как указано в таблице материалов) и организуйте их в соответствии с предпочтениями хирурга.</li>
	<li>Индуцировать анестезию путем внутримышечного введения 35 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина новозеландским белым кроликам (массой от 3,5 до 4,5 кг, возраст около 5-6,5 месяцев; в этом исследовании использовались два самца и одна самка). Затем подтвердите анестезию с помощью теста на сжатие лапы и/или хвоста.</li>
	<li>Если требуется дополнительная анестезия для поддержания хирургической плоскости, вводят внутривенно 10 мг/кг кетамина и 3 мг/кг ксилазина через краевую ушную вену28 и контролируют частоту дыхания животного через регулярные промежутки времени в 5-10 мин.</li>
	<li>Чтобы подготовить операционное окно, побрейте предполагаемое место разреза (участок кожи, поверхностный от мышечно-сухожильного блока SSC) и очистите его тремя чередующимися аппликациями бетадина и 70% спирта. С помощью ватного тампона нанесите бетадин и 70% спирт круговыми движениями (изнутри наружу). Используйте глазную мазь, чтобы глаза кролика оставались влажными и смазанными. Вводят 20 мг/кг цефалексина внутримышечно в качестве противоинфекционного средства.</li>
	<li>Сделайте разрез кожи на 3-4 см ниже ключицы, разделите дельтопекторальный интервал с помощью хирургического скальпеля No 11 и втяните, чтобы получить доступ к плечу (рис. 1А,Б).</li>
	<li>Чтобы найти мышечно-сухожильный блок SSC, сначала определите коракобрахиальную мышцу (как ткань, покрывающую прикрепление сухожилия SSC) и разделите ее. После этого определите сухожилие SSC и вставьте зажим под прямым углом, чтобы обнажить все сухожилие SSC в месте его установки на меньшую бугристость плечевой кости (рис. 1C).</li>
	<li>Перед нанесением травмы изолируют мышцу-сухожилие SSC (рис. 1D) и вводят интраоперационный анестетик (0,2 мг/кг 0,5% бупивакаина) локально вблизи места рассечения. Оберните мышечно-сухожильный блок SSC в трубку Пенроуза на основе силикона (Рисунок 1E), чтобы предотвратить нежелательное прикрепление к окружающим тканям и облегчить последующее извлечение тканей.</li>
	<li>Чтобы вызвать травму, создайте рассечение на всю толщину в месте соединения мышцы и сухожилия с помощью хирургического скальпеля No 11 (рис. 1F). При необходимости остановите кровотечение, надавливая куском марли, и используйте физиологический раствор для орошения раны по мере необходимости.</li>
	<li>Чтобы закрыть рану, используйте шов из полигликолевой кислоты (PGA) 4-0, чтобы приблизить мышечную ткань дельтовидной мышцы (Рисунок 1G), и нейлоновый шовный материал 4-0, чтобы закрыть рану кожи (Рисунок 1H).</li>
	<li>Послеоперационный уход путем подкожного введения 0,03 мг/кг бупренорфина в качестве анальгетика (один раз сразу после операции и два раза в день в течение следующих 48 ч29).</li>
	<li>Дайте кроликам прийти в себя на закрытой грелке и наложите мягкий ошейник, чтобы предотвратить нежелательное поведение, включая членовредительство, облизывание хирургических участков и снятие швов (рисунок 1I).</li>
	<li>Следите за изменениями в весе и поведении животных. Сообщайте ветеринарному врачу о любом снижении массы тела более чем на 10% и сильной боли, которую невозможно контролировать (оценивается на основе пяти поведенческих действий: стягивание орбиты, уплощение щек, изменение формы ноздрей, изменение положения усов, а также изменение формы и положения ушей), чтобы определить, требуется ли вмешательство, такое как ранняя эвтаназия.</li>
</ol>2. Сбор образцов
<ol><li>Усыпляют кроликов в 4 недели с момента травмы. Обезболивают кроликов и дают смертельную дозу пентобарбитала натрия (более 60 мг/кг). Подтвердите смерть с помощью торакотомии.</li>
	<li>Определите головку плечевой кости и хирургически иссеките ее, сохранив при этом большой и малый бугорки и все прикрепления мягких тканей. Зафиксировать 4% параформальдегидом (PFA) в течение 72 ч при 4 °C, прежде чем перенести в раствор 10% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 1 месяца при комнатной температуре (со сменой среды каждые 72 ч) для декальцинации кости.</li>
	<li>После декальцинации образцы подвергают стандартной гистологической обработке с использованием дифференцированного обезвоживания этанола, введения парафина, гистологического среза (срезы по 8 мкм) и окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и трихромными растворами Массона30,31,32.</li>
	<li>Получение изображений с помощью вертикального микроскопа с 10-кратным увеличением.</li>
	<li>Выполните полуколичественную оценку трихромных изображений H&E и Masson, измерив площадь и процентное содержание мышц, фиброзной ткани и жира в мышцах, как описано ранее33,34 с помощью программного обеспечения для графического дизайна по выбору. В этом примере используется программное обеспечение Adobe Photoshop (https://www.adobe.com).<ol><li>Выделите область определенного цвета, представляющую определенный тип ткани, с помощью инструмента «Волшебная палочка » (красный — мышечная ткань, синий — фиброз, белый — жир).</li>
		<li>Щелкните пункты меню Выбрать | Инверсия | Сохранить выделенную область | Назовите раздел.</li>
		<li>Подсчитайте количество пикселей в отмеченной области, щелкнув пункты меню Окно | Журнал измерений | Record Measurement (Измерение записи ), чтобы записать эти значения пикселей и вручную рассчитать процентное соотношение выбранных типов тканей.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Статистический анализ
<ol><li>Для получения гистологических данных выполните статистический анализ с помощью выбранного аналитического программного обеспечения. Выполните t-критерий Стьюдента для сравнения двух независимых образцов между контрольной и пострадавшей группами.</li>
	<li>Выразите данные в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения. Значение p , равное <0,05, считать статистически значимым.</li>
</ol>

У авторов нет конкурирующих интересов, которые они могли бы декларировать.

Воспроизводимая и физиологически релевантная животная модель дает возможность углубить понимание патогенеза заболевания, оценить результаты клинической терапии, а также усовершенствовать и развить хирургические методы лечения35. В этом исследовании была создана надежная и точная модель SSC кролика, которая имитирует аспекты анатомии и патофизиологии RC человека. Разрывы RC связаны с прогрессирующими и, вероятно, необратимыми мышечно-дегенеративными изменениями, приводящими к снижению потенциала заживления. Например, Ko et al. показали, что повторное прикрепление ТКП кролика через 6 недель не обратило вспять мышечную атрофию или ФД в последующие 6 недель. Такая FD-опосредованная мышечная атрофия влияет на несколько важных клинических параметров, включая силу сухожилий и диапазон движений суставов, что может повлиять на исходы хирургического вмешательства36,37.
Протокол, установленный здесь, показал значимые хронические признаки после рассечения мышечно-сухожильных единиц SSC. В частности, эти изменения включают заметное уменьшение мышечной массы и увеличение содержания жира и фиброзной ткани (Рисунок 2, Рисунок 3 и Рисунок 4). Эти результаты согласуются с дегенеративными изменениями, зарегистрированными при разрывах РЦ у человека38. В последние годы крыса стала одной из наиболее интенсивно изучаемых животных моделей РЦ и травм из-за ее высокого анатомического сходства как с человеческими, так и с крысиными SSP, путешествующими под акромионом38,39,40. Тем не менее, следует отметить, что часть ТКП крысы, которая проходит под акромиальной дугой, является мышечной, а не сухожильной, как у человека41. Самое главное, что Barton et al. обнаружили отсутствие значительного накопления жира после отслоения сухожилий SSP у крыс23, что контрастирует с состоянием человека42. Таким образом, считается, что комплекс SSC кролика может обеспечить подходящую модель для имитации хронического разрыва RC у людей.
Чтобы обеспечить воспроизводимость этой модели, при выполнении данного протокола стоит отметить два момента. Во-первых, после пересечения мышечно-сухожильных единиц свободный конец пересеченного сухожилия может подвергаться риску образования спаек, что может затруднить извлечение сухожилия для последующих манипуляций. Чтобы избежать этой проблемы, была использована нерассасывающаяся силиконовая трубка для обмотки свободного конца соединения мышцы и сухожилия после рассечения, чтобы избежать спонтанного прилипания к окружающим тканям, а также спонтанного заживления (рис. 1E). Кроме того, во время второй процедуры вмешательства (т.е. для выполнения надежной репарации; данные не показаны) можно четко идентифицировать путем обертывания конца поврежденных тканей во время первоначальной операции. Эта методика экономична, эффективна и может быть легко применена в хирургии43. Во-вторых, кролики являются очень чувствительным видом, который может демонстрировать пагубное поведение после операции. Чтобы избежать таких проблем, настоятельно рекомендуется также использовать мягкий ошейник, чтобы предотвратить нежелательное поведение, включая членовредительство, облизывание хирургических участков и снятие швов (рисунок 1I). По сравнению с коммерчески обычными электронными ошейниками, изготовленными из жесткого пластика, самодельный мягкий ошейник не вызывал никаких повреждений кожи или других побочных эффектов, которые влияли бы на благополучие животных или качество научных исследований. В совокупности такие шаги имеют решающее значение для создания точно воспроизводимой модели RC-травмы кролика и дают возможность для изучения стратегий регенеративной репарации.
Для изучения патофизиологии и заживления сухожилий на животной модели необходимо создать отчетливую и воспроизводимую травму, а также тщательно выбрать точки времени исследования. Подавляющее большинство исследований повреждений и заживления сухожилий было выполнено на полностью пересеченных сухожилиях животных44, поскольку рассечение является простой процедурой, которая обладает высокой воспроизводимостью и может адекватно имитировать клинический сценарий45,46. Huegel et al. показали, что повреждение частично пересеченного сухожилия было менее серьезным, чем повреждение полностью пересеченного сухожилия, а иммобилизация оказывала пагубное влияние на механику сухожилия, включая увеличениежесткости сустава. Для оценки атрофии и ФД, которые наблюдаются при массивном разрыве RC, необходимо определить экспериментально наблюдаемые характерные моменты времени. Гупта и др. валидировали модель RC-травмы у самцов кроликов и наблюдали мышечную атрофию через 2 и 6 недель, с повышенным содержанием жира в более поздние моменты времени (менее 5% содержания жира через 2 недели по сравнению с более чем 10% содержанием жира через 6 недель), что согласуется с патологическим процессом, наблюдаемым приразрывах RC у человека. В этом исследовании массивный разрыв RC был создан путем рассечения мышечно-сухожильной единицы SSC у самцов и самок кроликов в течение 4 недель, что привело к SSC muscle FD (содержание жира 36,5%). Таким образом, 4-недельная временная точка подходит для генерации SSC мышечного FD у самцов и самок новозеландских белых кроликов.
У этого исследования есть несколько ограничений. К ним относятся: (i) этапы, связанные с созданием модели на животных, такие как относительно короткий период времени и потенциально воспалительные материалы (трубки Пенроуза на основе силикона) для получения хронической травмы; (ii) характеристика и анализ моделей животных, например, отсутствие анализа походки и электромиографии для оценки кинематики суставов и создания сократительной силы мышц; и (iii) сравнение моделей животных, например, отсутствие сравнения с другими местами RC-травм.
С точки зрения генерации модели, травмы РК у человека обычно включают прогрессирующую атрофию и ФД, которые могут возникать в течение нескольких лет, что относительно дольше, чем 4-недельный временной отметка, описанный здесь. Это считается приемлемым, так как животная модель, которая генерирует около 36,5% внутримышечного жира за относительно короткий промежуток времени, будет удобной с точки зрения логистики и может быть продлена при необходимости. Кроме того, биосовместимость имплантатов на основе силикона, таких как трубки Пенроуза, была источником давних споров из-за сообщений о клеточном иммунном ответе и воспалении47; таким образом, альтернативный инертный материал, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), может быть заменен для обмотки резецированного сухожилия при проведении исследований RC, связанных с воспалением.
С точки зрения характеристики и анализа животных моделей, отсутствие анализа походки49 и электромиографических исследований50 может ограничить результаты исследования качественными гистологическими данными. Эти аспекты могут быть рассмотрены в будущих исследованиях с использованием видеоанализа движения51 и поверхностной электромиографии50 для получения количественных данных о кинематике плечевого сустава и работе RC-мышц.
С точки зрения сравнения моделей, поскольку сухожилия SSP и подостной мышцы у кроликов также широко использовались для исследований RC, сравнение тяжести травмы, включая FD среди этих различных участков травмы, в будущем позволит выявить дополнительные участки для оптимизации модели.
Таким образом, в этом исследовании был разработан протокол моделирования хроноподобных травм РЦ у самцов и самок кроликов. Данная модель удобна для исследователей своей простотой (транссекция) и относительно коротким периодом индуцирования хроники (4 недели) при формировании большой степени (36,5%) внутримышечной ФД. Таким образом, ожидается, что этот протокол поможет исследователям в изучении патофизиологии РК, а также будет способствовать разработке новых терапевтических средств для восстановления и регенерации мышц и сухожилий.

Хронические разрывы вращательной манжеты плеча характеризуются дегенеративными изменениями в мускулатуре и сухожилиях, включая атрофию мышц, накопление жировой ткани и фиброз, которые могут поставить под угрозу исход восстановления РК и, в конечном итоге, вызвать боль и дисфункцию плеча 1,2,3,4,5 . Чтобы лучше понять патогенез RC-разрыва и улучшить результаты хирургического вмешательства, крайне важно разработать соответствующие модели животных, которые могут имитировать аспекты анатомии и патофизиологии RC человека. В частности, модели RC-травм должны соответствовать следующим критериям: (i) отсутствие спонтанного заживления после травмы; (ii) содержат значительное присутствие фиброза, мышечной атрофии и накопления жировой ткани; и (iii) иметь достаточный размер, позволяющий приблизиться к хирургическим методам, используемым у людей6.
В этом контексте подлопаточная мышца кролика (SSC) может быть использована в качестве точной и надежной животной модели для изучения патофизиологии RC, учитывая ее уникальную анатомию, патофизиологический ответ и биомеханические свойства7. Действительно, анатомия SSC RC кролика похожа на человеческую надостную мышцу (SSP) RC, которая является мышечно-сухожильной единицей, наиболее часто связанной с травмами, возникающими в результате чрезмерной нагрузки 8,9. В частности, сухожильный комплекс SSC кролика проходит через костный туннель и под коракобрахиальной мышцей, что аналогично ситуации у человека, когда сухожильный комплекс SSP проходит через субакромиальный костный туннель и под коракоакромиальной связкой7. Это анатомическое сходство приводит к тому, что у кролика ССК происходят те же движения опорно-двигательного аппарата, что и у человека, при котором сухожилие проходит под акромионом во время подъема и отведения плечевой кости 7,10.
Кроме того, патогистологические изменения, сходные с человеческими RCtears 11, наблюдались у кроликов после разрыва SSC. В частности, мышечный живот подвергается тяжелой ФД со значительной потерей мышечной массы, уменьшением площади поперечного сечения мышечных волокон и повышенным ожирением. Кроме того, Otarodifard et al. оценили биомеханические характеристики ССК кроликов после (1) однорядной, (2) двухрядной и (3) чрескостно-эквивалентной РК-репарации и обнаружили, что первоначальные биомеханические характеристики этих репараций были аналогичны РК-репарациям ТКП человека, выполненной на трупных образцах12. Таким образом, анатомическое, физиологическое и биомеханическое сходство КСК кролика с человеческим ТКП делает его полезным для моделирования травм РК.
Несмотря на то, что многие виды животных, включая крыс, мышей, собак и овец, были использованы для изучения РЦ-заболевания и восстановления 6,13,14,15, степень хронизации травмы является ключевым фактором. Это связано с тем, что разрывы RC могут протекать бессимптомно и часто могут быть диагностированы гораздо позже, когда разрыв увеличился и стал хроническим по своей природе, при этом как сухожилие, так и мышца демонстрируют тяжелую дегенерацию16,17,18. Тем не менее, в большинстве моделей восстановления RC используются модели острой травмы, при которых здоровое сухожилие пересекается, а затем немедленно восстанавливается 19,20,21,22. Это происходит в основном из соображений логистической целесообразности и технической простоты, что приводит к небольшому количеству исследований, которые изучают патофизиологию РК в хронических условиях. Более того, некоторые животные модели могут обладать свойствами, которые препятствуют их использованию в исследованиях хронического РК.
Например, несмотря на то, что крыса широко использовалась для моделирования разрыва РЦ и вмешательства, отсутствие значительного накопления жира после травмы контрастирует с состоянием человека, а ее небольшой размерзатрудняет повторные хирургические процедуры. Кроме того, несмотря на то, что Gerber et al. использовали подостную мышцу овец для изучения мышечной атрофии и ФД после хронического разрыва RC24, существует некоторое анатомическое сходство между подостной мышцей овец и человеческим SSP, а также многочисленные логистические проблемы для изучения и размещения такой крупной модели животного. Кроме того, Gerber et al. разработали модель отсроченной RC-травмы у овец, освободив поверхностную головку подостной мышцы и сухожилия, чтобы имитировать особенности хронического RC-разрыва, а затем оценили эффективность различных методов восстановления сухожилия через 4-6 недель. К сожалению, эта хроническая модель овцы обладала ограничением, заключающимся в том, что конец высвобожденного сухожилия стал неотличим от рубцовой ткани во время второй хирургическойпроцедуры.
Coleman et al. также разработали модель хронического разрыва RC у овец, покрыв пересеченный конец сухожилия синтетической мембраной во время первоначальной операции, что позволило диффузировать питательные вещества и эффективно свести к минимуму образование рубцовой ткани вокруг поврежденной ткани, одновременно улучшая различение между сухожилием и рубцовой тканью26. Между тем, Turner et al. предположили, что отсроченное восстановление должно быть проведено в течение 4 недель, поскольку прямое повторное прикрепление редко происходит при массивнойретракции сухожилия. В совокупности эти исследования способствовали созданию воспроизводимых и надежных протоколов для успешного создания хронической модели травмы ССК у кроликов.
В этом протоколе установлена хроническая модель RC-травмы кроликов на 4-й неделе, при которой патологические изменения, связанные с фиброзом и FD-опосредованной атрофией мышц, могут быть изучены с помощью гистологических оценок. В частности, обертывание свободного конца мышечно-сухожильного соединения с помощью трубки Пенроуза на силиконовой основе во время первичной операции позволяет четко идентифицировать ткани РК во время второй хирургической процедуры и, следовательно, способствует безопасному восстановлению для изучения заживления РК с аугментацией каркаса и без нее. В целом, хроническая модель SSC кролика может лучше имитировать патофизиологию РК и предъявлять минимальные технические и логистические требования.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

Патофизиология вращательной манжеты плеча кролика (RC) может привести к прогрессирующим и высокодегенеративным изменениям в связанной с ней мускулатуре и сухожилиях, что отрицательно влияет на клинически значимые параметры, такие как прочность и втягивание мышечно-сухожильного/миотендинного блока, что в конечном итоге приводит к потере функции плеча и отрицательно влияет на результаты восстановления RC. Животные модели, которые имитируют аспекты анатомии и патофизиологии РК человека, имеют решающее значение для продвижения концептуального понимания прогрессирования травмы и разработки эффективных терапевтических средств на основе тканевой инженерии и регенеративной медицины.
В этом контексте модель подлопаточной мышцы кролика (SSC) подходит из-за (i) ее анатомического сходства с костно-сухожильно-мышечной единицей человека (SSP), которая является наиболее часто повреждаемым участком RC; (ii) его патофизиологическое сходство с человеком с точки зрения фиброза и мышечно-жировой дистрофии (ФД); и (iii) его пригодность к хирургическим процедурам. Таким образом, целью данного исследования является описание хирургических техник индуцирования повреждения ССК RC. Вкратце, процедура включает в себя изоляцию SSC путем идентификации коракобрахиальной мышцы с последующим рассечением по всей толщине в месте соединения мышцы и сухожилия и обертыванием свободного конца мышечно-сухожильного соединения трубкой Пенроуза на силиконовой основе для предотвращения спонтанного повторного прикрепления. Гистологические оценки проводятся для мониторинга прогрессирования мышечной ФД через 4 недели после операции с использованием гематоксилина и эозина (H&E), а также трихромного окрашивания по Массону.
Потеря мышечной массы и ФД были очевидны через 4 недели после рассечения мышечно-сухожильного соединения SSC, как и при патофизиологических состояниях РК человека. Этот протокол демонстрирует шаги для успешного создания хронической модели травмы РК у кроликов, которая может служить мощным инструментом для изучения изменений скелетных мышц, связанных с патофизиологией РК, и помочь в разработке новых терапевтических стратегий при хроноподобных разрывах РК.

Для оценки хронизации патологии РК после рассечения мышечно-сухожильных единиц ССК была охарактеризована общая морфология тканей и клеточные изменения с помощью общей оценки и гистологического анализа (H&E и трихромное окрашивание по Массону, соответственно) через 4 недели после травмы (рис. 2, рис. 3 и рис. 4 ). Репрезентативные изображения грубой морфологии тканей показали появление белой жировой ткани в поврежденных мышцах SSC, которая отсутствовала в контрольной группе (рис. 2). Окрашивание H&E подтвердило потерю мышечной клеточности и организации, которая была заменена большим количеством адипоцитов (пустые пространства, окруженные тонкими краями цитоплазмы, содержащими сжатые ядра) в поврежденных мышцах SSC по сравнению с контрольной группой (рис. 3A).
Полуколичественная оценка изображений H&E показала высокую степень внутримышечного присутствия адипоцитов в поврежденных мышцах SSC (36,5% ± 8,5%) по сравнению с контрольной группой (0,69% ± 0,18%) (рис. 3B). Трихромное окрашивание по Массону также подтвердило мышечную атрофию и дезорганизованное расположение коллагеновых волокон в поврежденных мышцах SSC по сравнению с контрольной группой (рис. 4A). Полуколичественная оценка трихромных изображений Массона показала снижение мышечной клеточности поврежденных мышц ССК (41,3% ± 2,6%) по сравнению с контрольной группой (99,2% ± 0,16%) (рис. 4Б). Несмотря на то, что дальнейшая полуколичественная оценка не показала каких-либо существенных различий в формировании фиброзной ткани между поврежденными мышцами SSC (22,3% ± 13,1%) и контрольной группой (0,07% ± 0,05%), в поврежденных мышцах SSC наблюдалась высокая степень фиброза (рис. 4C). В совокупности общая морфология тканей и гистологический анализ показали, что у травмированного кролика наблюдалась тяжелая мышечная атрофия, накопление жира и фиброз, которые являются известными признаками хронической патофизиологии РК.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> Рисунок 1: Хирургическая процедура при хронической модели повреждения мышцы и сухожилия SSC. (А) Было создано хирургическое окно, и анатомические ориентиры, такие как плечевая кость, головка плечевой кости и ключица, были идентифицированы путем пальпации. (Б) Разрез кожи диаметром 3,0 см был сделан ниже ключицы. (C) Коракобрахиальная мышца была расщеплена, чтобы обнажить мышцу SSC. (D) Мышечно-сухожильная единица SSC была изолирована. (E) Для обертывания мышечно-сухожильной ткани SSC использовали дренаж пенроуза на основе силикона. (F) Пересечение мышцы-сухожилия SSC. (G) Коракобрахиальная мышца была реаппроксимирована с помощью швов PGA. (H) Разрез кожи был закрыт нейлоновыми швами. (I) После операции кроликам дали мягкий ошейник. Сокращения: SSC = subscapularis; PGA = полигликолевая кислота. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> Рисунок 2: Общая морфология репрезентативных мышц SSC. Черные стрелки обозначают белые жировые ткани. Аббревиатура: SSC = subscapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> Рисунок 3: Гистологический анализ модели хронического РЦ через 4 недели. (A) Репрезентативные гистологические изображения, окрашенные H&E, показали атрофические мышечные волокна и скопление адипоцитов. (B) Количественная оценка процента накопления поврежденного мышечного жира. n = 3 кролика. Столбцы погрешности указывают на SEM.*, статистически значимое (p≤ 0,05). Масштабные линейки = 5 000 мкм (А, левый столбец), 600 мкм (А, правый столбец). Сокращения: SSC = subscapularis; RC = вращательная манжета плеча; H&E = гематоксилин и эозин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> Рисунок 4: Гистологический анализ хронической модели РЦ-травмы через 4 недели. (А) На изображениях Массона, окрашенных трихромом, был обнаружен значительный фиброз. Волокнистая соединительная ткань окрашивается в синий цвет. (B) Количественная оценка доли мышечной и (C) фиброзной ткани. n = 3 кролика. Столбцы погрешности указывают на SEM.*, статистически значимое (p≤ 0,05). Масштабные линейки = 5 000 мкм (А, левый столбец), 200 мкм (А, правый столбец). Сокращения: SSC = subscapularis; RC = вращательная манжета плеча. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

В этом исследовании подробно описаны процедуры установления хронической травмы вращательной манжеты плеча (RC) кролика. В частности, повреждение создается в подлопаточной мышце/миотендозном отделе, чтобы имитировать анатомию и патофизиологию РК человека, включая тяжелую мышечно-жировую дегенерацию (ФД). Этот протокол может быть применен для изучения травм РК и оценки регенеративной терапии.

Разработка модели хронической травмы вращательной манжеты плеча у кролика для изучения фиброза и мышечно-жировой дегенерации

Rabbit rotator cuff (RC) pathophysiology can lead to progressive and highly degenerative changes in its associated musculature and tendons, which ...

Этот протокол демонстрирует сложную хирургическую технику индуцирования хронического повреждения вращательной манжеты плеча у кроликов и полезен для изучения патогенеза вращательной манжеты плеча и разработки регенеративной терапии. Кролики - это модели животных среднего и крупного размера, которых легко содержать с точки зрения логистики, манипулировать хирургическим путем и которые демонстрируют высокий уровень жировой дегенерации мышц вращательной манжеты плеча при травме, как и люди. Показанная здесь модель травмы подлопаточной мышцы анатомически аналогична сухожильному комплексу надостной кости, одной из наиболее часто травмируемых единиц вращательной манжеты плеча.Для начала подготовьте операционное окно, сбрив предполагаемое место разреза кролика, находящегося под наркозом. Используя ватные палочки, очистите область тремя чередующимися аппликациями бетадина и 70% спирта круговыми движениями. Вводят 20 миллиграмм на килограмм цефалексина внутримышечно в качестве профилактического противоинфекционного средства.Сделайте трех-четырехсантиметровый разрез кожи ниже ключицы, разделите дельтопекторальный промежуток с помощью ножниц и втяните, чтобы получить доступ к плечу. Чтобы найти сухожилие подлопаточной мышцы, сначала определите сухожилие коракобрахиальной мышцы. Затем определите сухожилие подлопаточной кости и вставьте зажим под прямым углом, чтобы обнажить все сухожилие в месте его прикрепления к малой бугристости плечевой кости.Изолируйте сухожилие подлопаточной мышцы. После локального введения предоперационного анальгетика рядом с местом рассечения оберните сухожилие подлопаточной мышцы трубкой пенроуза на силиконовой основе, чтобы предотвратить нежелательное прикрепление к окружающим тканям и облегчить последующее извлечение тканей. Чтобы вызвать травму, создайте рассечение на всю толщину в месте соединения сухожилий мышцы с помощью хирургического скальпеля No 11.При необходимости остановите кровотечение, надавливая куском марли, и используйте физиологический раствор для орошения раны по мере необходимости. Чтобы закрыть рану, используйте шовный материал из полигликолевой кислоты 4-0 для восстановления дельтовидной мышечной ткани и нейлоновый или шелковый шов 4-0 для закрытия кожной раны с последующей очисткой раны. Вводите 0,03 мг на килограмм бупренорфина подкожно в качестве анальгетика один раз сразу после операции и два раза в день в течение следующих 48 часов.На рисунке показан гистологический анализ хронической модели повреждения вращательной манжеты плеча через четыре недели. Окрашивание H&E подтвердило потерю мышечной клеточности и организации, которая была заменена большим количеством адипоцитов в поврежденных подлопаточных мышцах по сравнению с контрольной группой. Количественная оценка процента накопления поврежденного мышечного жира представлена на этом рисунке.Трихромное окрашивание по Массону также подтвердило мышечную атрофию и дезорганизацию расположения коллагеновых волокон в поврежденных подлопаточных мышцах по сравнению с контрольной группой. Количественная оценка доли мышечной и фиброзной ткани показана на этом рисунке. Оценка показала снижение мышечной клеточности поврежденных подлопаточных мышц по сравнению с контрольной группой.Высокая степень фиброза наблюдалась и в травмированных подлопаточных мышцах. Идентификация сухожилия подлопаточной мышцы и обертывание сухожилия подлопаточной мышцы в трубку Пенроуза являются наиболее важными этапами этой процедуры. После этой процедуры может быть применено терапевтическое вмешательство.В этом случае описанные здесь анализы, наряду с дополнительной миографией или анализом походки, могут быть использованы для оценки результата вмешательства. Этот метод имеет решающее значение для помощи исследователям в изучении патофизиологии вращательной манжеты плеча, а также для содействия разработке новых терапевтических средств для восстановления и регенерации мышечных сухожилий.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Компьютерные Стимулы животной модели

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Применение допамина Элеганс C. Анализ дегенерация нейронов для проверки потенциальных болезни Паркинсона Гены

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Подготовка мозга крысы Совокупный культур для Нейрон и исследований Глия развития

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Разработка автоматизированной обработки изображений и анализа для экранов данио химических веществ.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Внутривенно микроинъекции данио рерио Личинки по изучению Острое повреждение почек

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Метод грызунов Всего культуры эмбрионов использованием Rotator типа бутылки культуры система

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Изоляция, культура, и трансплантация мышечных сателлитных клеток

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Диетических добавок полиненасыщенных жирных кислот в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...