Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Dai Fei Elmer Kers forskning stöds av finansiering från Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund: 08190466), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK program), Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (Early Career Scheme Award: 24201720 and General Research Fund: 14213922) och The Chinese University of Hong Kong (Faculty Innovation Award: FIA2018/A/01). Dan Wangs forskning stöds av finansiering från Food and Health Bureau, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK program) och Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (General Research Fund: 14118620 and 14121121).

Alla ingrepp skall utföras med steril kirurgisk teknik i ett lämpligt utrustat rum avsett för djuroperationer i enlighet med ett protokoll som godkänts av institutets etiska kommitté för djurförsök. I den aktuella studien utfördes kaninoperationer i enlighet med ett protokoll som godkänts av The Chinese University of Hong Kong Animal Experimentation Ethics Committee.
1. Kirurgiskt ingrepp
<ol><li>För att förbereda operationsområdet, förvärm en värmedyna och täck den med sterila kirurgiska draperier för att bibehålla kaninens kroppstemperatur. Lägg sedan ut steriliserade kirurgiska verktyg och tillbehör (enligt specifikationen i materialtabellen) och organisera dem enligt kirurgens önskemål.</li>
	<li>Inducera anestesi via intramuskulär administrering av 35 mg/kg ketamin och 5 mg/kg xylazin till vita kaniner från Nya Zeeland (som väger mellan 3,5 och 4,5 kg, cirka 5-6,5 månaders ålder; två hankaniner och en honkanin användes i denna studie). Bekräfta därefter anestesi med ett tass- och/eller svansklämtest.</li>
	<li>Om ytterligare anestesi krävs för att upprätthålla operationsplanet, administrera 10 mg/kg ketamin och 3 mg/kg xylazin intravenöst via den marginella öronvenen28 och övervaka djurets andningsfrekvens med jämna mellanrum på 5-10 minuter.</li>
	<li>För att förbereda operationsfönstret, raka det avsedda snittstället (hudregionen ytlig till SSC-muskelsenan) och rengör med tre alternerande appliceringar av betadin och 70 % alkohol. Använd en bomullspinne för att applicera betadin och 70 % alkohol i cirkulära rörelser (inifrån och ut). Använd ögonsalva för att hålla kaninens ögon fuktiga och smorda. Administrera 20 mg/kg cefalexin intramuskulärt som ett antiinfektivt medel.</li>
	<li>Gör ett 3-4 cm långt hudsnitt som är lägre än nyckelbenet, dela deltopectoral-intervallet med en kirurgisk skalpell nr 11 och dra tillbaka för att komma åt axeln (Figur 1A,B).</li>
	<li>För att lokalisera SSC-muskelsenan, identifiera först coracobrachialis-muskeln (som vävnad som täcker SSC-senfästet) och dela den. Efter detta, identifiera SSC-senan och sätt in en rätvinklig clamp för att exponera hela SSC-senan vid dess införande på den mindre tuberositeten i humerus (Figur 1C).</li>
	<li>Innan skadan introduceras, isolera SSC-muskelsenan (Figur 1D) och administrera intraoperativt bedövningsmedel (0,2 mg/kg 0,5 % bupivakain) lokalt nära transsektionsstället. Linda in SSC-muskelsenan i silikonbaserad penroseslang (Figur 1E) för att förhindra oönskad fastsättning i de omgivande vävnaderna och underlätta efterföljande vävnadsuttag.</li>
	<li>För att framkalla skada, skapa en fullhudstranssektion vid muskel-senförbindelsen med hjälp av en kirurgisk skalpell nr 11 (Figur 1F). Vid behov, stoppa blödningen genom att applicera tryck med en bit gasbinda och använd koksaltlösning för att skölja såret vid behov.</li>
	<li>För att stänga såret, använd en 4-0 polyglykolsyra (PGA) sutur för att närma sig deltoideusmuskelvävnaden (Figur 1G) och en 4-0 nylonsutur för att stänga hudsåret (Figur 1H).</li>
	<li>Ge postoperativ vård genom subkutan administrering av 0,03 mg/kg buprenorfin som smärtstillande medel (en gång omedelbart efter operationen och två gånger dagligen under de kommande 48 timmarna29).</li>
	<li>Låt kaninerna återhämta sig på en täckt värmedyna och sätt på en mjuk krage för att förhindra oönskat beteende, inklusive självstympning, slickning av operationsställen och avlägsnande av suturer (Figur 1I).</li>
	<li>Övervaka djuren med avseende på vikt och beteendeförändringar. Rapportera varje minskning av kroppsvikten med mer än 10 % och svår smärta som inte kan kontrolleras (bedömd baserat på fem beteendeåtgärder: orbital åtstramning, kindtillplattning, förändringar i näsborrens form, förändringar i morrhårens position och förändringar i öronens form och position) till veterinären för att avgöra om ingripande som tidig avlivning krävs.</li>
</ol>2. Skörd av prov
<ol><li>Avliva kaninerna 4 veckor efter skadetillfället. Bedöva kaninerna och ge en dödlig dos natriumpentobarbital (mer än 60 mg/kg). Bekräfta dödsfall genom torakotomi.</li>
	<li>Identifiera humerushuvudet och operera bort det, samtidigt som du bevarar de större och mindre knölarna och alla mjukvävnadsfästen. Fixera med 4 % paraformaldehyd (PFA) i 72 timmar vid 4 °C innan du överför till en lösning av 10 % etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 1 månad vid rumstemperatur (med byte av media var 72:e timme) för att avkalka benet.</li>
	<li>Efter avkalkning, utsätt proverna för standardiserad histologisk bearbetning med graderad etanoldehydrering, paraffininbäddning, histologisk snittning (8 μm snitt) och färgning med hematoxylin och eosin (H&E) och Massons trikromlösningar30,31,32.</li>
	<li>Ta bilder med ett upprätt mikroskop med 10x förstoring.</li>
	<li>Utför semi-kvantifiering av H&E och Massons trikroma bilder genom att mäta arean och procentandelen av muskler, fibrös vävnad och fett i muskeln, som tidigare beskrivits33,34 med hjälp av ett grafiskt designprogram. I det här exemplet används programvaran Adobe Photoshop (https://www.adobe.com).<ol><li>Välj ett område av en viss färg som representerar en viss vävnadstyp med hjälp av trollstavsverktyget (rött är muskelvävnad, blått är fibros och vitt representerar fett).</li>
		<li>Klicka på menyalternativen Välj | Omvänt | Spara markering | Namnge avsnittet.</li>
		<li>Räkna antalet pixlar inom det markerade området genom att klicka på menyalternativen Fönster | Mätning logg | Spela in mätning för att registrera dessa pixelvärden och manuellt beräkna procentandelen av de valda vävnadstyperna.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Statistisk analys
<ol><li>För histologiska data, utför den statistiska analysen med hjälp av valfri analysprogramvara. Utför ett studenttest för jämförelse av två oberoende prover mellan kontrollgruppen och den skadade gruppen.</li>
	<li>Uttryck data som medelvärde ± medelvärde för medelvärdet. Betrakta ett p-värde på <0,05 som statistiskt signifikant.</li>
</ol>

Författarna har inga motstridiga intressen att deklarera.

En reproducerbar och fysiologiskt relevant djurmodell ger möjlighet att öka förståelsen för sjukdomspatogenes, utvärdera resultaten av kliniska behandlingar och förbättra och vidareutveckla kirurgiska behandlingar35. I denna studie etablerades en tillförlitlig och exakt kanin-SSC-modell som efterliknar aspekter av mänsklig RC-anatomi och patofysiologi. RC-bristningar är relaterade till progressiva och sannolikt irreversibla muskeldegenerativa förändringar, vilket resulterar i en minskad läkningspotential. Till exempel visade Ko et al. att återinfästning av kanin-SSP vid 6 veckor inte reverserade muskelatrofi eller FD under de följande 6 veckorna. Sådan FD-medierad muskelatrofi påverkar flera viktiga kliniska parametrar, inklusive senmuskelstyrka och ledrörelseomfång, vilket kan påverka de kirurgiska resultaten36,37.
Protokollet som upprättades här visade signifikanta kronliknande egenskaper efter transsektion av SSC-muskelsenor. Specifikt inkluderar dessa förändringar synligt minskad muskelmassa och ökat fettinnehåll och fibrotisk vävnad (Figur 2, Figur 3 och Figur 4). Dessa fynd överensstämmer med degenerativa förändringar som rapporterats i RC-tårarhos människa 38. Under de senaste åren har råttan framstått som en av de mest intensivt studerade djurmodellerna för RC-sjukdom och skada på grund av dess höga anatomiska likheter med både mänskliga och råttor SSP:er som färdas under acromion38,39,40. Det bör dock noteras att den del av SSP hos råtta som passerar under den akromiala bågen är muskulös i motsats till senös, vilket är fallet hos människor41. Viktigast av allt är att Barton et al. erkände en brist på signifikant fettansamling efter SSP-senavlossning hos råttor23, vilket står i kontrast till det mänskliga tillståndet42. Som sådan tror man att kanin-SSC-komplexet kan ge en lämplig modell för att efterlikna den kroniska RC-tåren hos människor.
För att säkerställa reproducerbarheten av denna modell är två punkter värda att notera när du utför detta protokoll. För det första, efter transsektionen av muskel-senenheter, kan den fria änden av den transekterade senan riskera att bilda sammanväxningar, vilket kan göra det svårt att hämta senan för efterföljande manipulationer. För att undvika detta problem användes en icke-resorberbar silikonslang för att linda den fria änden av muskel-senan efter transsektion för att undvika spontan vidhäftning till omgivande vävnader samt spontan läkning (Figur 1E). Vidare kan den transekterade muskelsenan under ett andra ingrepp för intervention (dvs. för att utföra en säker reparation; data visas inte) tydligt identifieras genom att linda änden av skadade vävnader vid tidpunkten för den första operationen. Denna teknik är ekonomisk, effektiv och kan enkelt implementeras i kirurgi43. För det andra är kaniner en mycket känslig art som kan uppvisa skadligt beteende efter operation. För att undvika sådana problem rekommenderas det starkt att en mjuk krage också appliceras för att förhindra oönskat beteende, inklusive självstympning, slickning av kirurgiska områden och borttagning av suturer (Figur 1I). Jämfört med kommersiellt konventionella E-halsband som är gjorda av styv plast, orsakade den egentillverkade mjuka kragen inga hudskador eller andra biverkningar som påverkade djurens välbefinnande eller kvaliteten på vetenskapliga undersökningar. Tillsammans är sådana steg avgörande för att skapa en exakt reproducerbar RC-skademodell för kanin och ge möjlighet att studera de regenerativa reparationsstrategierna.
För att studera senpatofysiologi och läkning i en djurmodell måste en distinkt och reproducerbar skada skapas, och studietidpunkterna måste väljas noggrant. De allra flesta studier av senskada och läkning har utförts på helt transekterade djursenor44, eftersom transsektion är en enkel procedur som är mycket reproducerbar och kan simulera det kliniska scenariot på ett adekvat sätt45,46. Huegel et al. visade att skadan på en delvis transekterad sena var mindre allvarlig än på en helt transekterad sena, och immobilisering hade en skadlig effekt på senmekaniken, inklusive ökad ledstelhet47. För att utvärdera atrofi och FD som ses i samband med massiv RC-tår är det viktigt att definiera de experimentellt observerade karakteristiska tidpunkterna. Gupta et al. har validerat en RC-skademodell hos hankaninen och observerat muskelatrofi vid 2 och 6 veckors tidpunkter, med ökat fettinnehåll vid senare tidpunkter (mindre än 5 % fettinnehåll vid 2 veckor jämfört med mer än 10 % fettinnehåll vid 6 veckor), i överensstämmelse med den patologiska process som observerats i humana RC-tårar11. I denna studie skapades en massiv RC-bristning genom transsektion av SSC-muskelsenan hos han- och honkaniner under 4 veckor, vilket resulterade i SSC-muskel-FD (36,5 % fetthalt). Således är en 4 veckors tidpunkt lämplig för att generera SSC-muskel FD hos hanar och honor Nya Zeeland vita kaniner.
Det finns flera begränsningar i denna studie. Dessa inkluderar: (i) steg som är förknippade med generering av djurmodeller, såsom en relativt kort tidsperiod och potentiellt inflammatoriska material (silikonbaserade penroseslangar) för kronisk-liknande skadegenerering; (ii) karakterisering och analys av djurmodeller, såsom analys av avsaknad av gång och elektromyografi för att bedöma ledkinematik och generering av muskelkontraktila krafter; och (iii) jämförelse av djurmodeller, t.ex. brist på jämförelse med andra RC-skadeställen.
När det gäller modellgenerering involverar mänskliga RC-skador vanligtvis progressiv atrofi och FD som kan inträffa under flera år, vilket är relativt längre än den 4-veckorstidpunkt som rapporteras här. Detta anses vara acceptabelt, eftersom en djurmodell som genererar cirka 36,5 % intramuskulärt fett på relativt kort tid kommer att vara logistiskt bekväm och kan förlängas om det anses nödvändigt. Dessutom har biokompatibiliteten hos silikonbaserade implantat, såsom penroseslangar, varit en källa till långvarig kontrovers på grund av rapporter om cellulärt immunsvar och inflammation47; därför kan ett alternativt inert material, såsom polyetylenglykol (PEG), ersättas för att linda den resekerade senan om man bedriver inflammationsassocierade RC-studier.
När det gäller karakterisering och analys av djurmodeller kan bristen på gånganalys49 och elektromyografstudier50 begränsa studiens resultat till kvalitativa histologiska data. Dessa aspekter kan komma att behandlas i framtida studier genom att använda videorörelseanalys51 och ytelektromyografi50 för att generera kvantitativa data om axelkinematik och RC-muskelprestanda.
När det gäller modelljämförelse, eftersom SSP- och infraspinatussenorna hos kaniner också har använts i stor utsträckning för RC-studier, kommer jämförelse av skadans svårighetsgrad, inklusive FD mellan dessa olika skadeställen i framtiden, att identifiera ytterligare platser för modelloptimering.
Sammanfattningsvis har denna studie utvecklat ett protokoll för modellering av kronisk-liknande RC-skador hos han- och honkaniner. Denna modell är bekväm för utredare på grund av dess enkelhet (transsektion) och relativt korta period för att inducera kronicitet (4 veckor) samtidigt som den genererar en hög grad (36,5%) av intramuskulär FD. Som sådant förväntas detta protokoll hjälpa utredare i studien av RC-patofysiologi, samt underlätta utvecklingen av nya terapier för reparation och regenerering av muskelsenor.

Kroniska rotatorkuffen (RC) tårar karakteriseras av degenerativa förändringar i muskulatur och senor, inklusive atrofi av muskler, ackumulering av fettvävnad och fibros, vilket kan äventyra resultatet av RC-reparation och i slutändan orsaka axelsmärta och dysfunktion 1,2,3,4,5 . För att bättre förstå RC-tårpatogenesen och förbättra kirurgiska resultat är det avgörande att utveckla lämpliga djurmodeller som kan efterlikna aspekter av mänsklig RC-anatomi och patofysiologi. Specifikt bör RC-skademodeller uppfylla följande kriterier: (i) saknar spontan läkning efter skada; ii) innehåller en betydande förekomst av fibros, muskelatrofi och ansamling av fettvävnad, iii) vara tillräckligt stora för att möjliggöra tillnärmning av kirurgiska tekniker som används på människor6.
I detta sammanhang kan muskeln rabbit subscapularis (SSC) användas som en exakt och tillförlitlig djurmodell för studier av RC-patofysiologi, med tanke på dess unika anatomi, patofysiologiska svar och biomekaniska egenskaper7. Faktum är att kaninens SSC RC-anatomi liknar människans supraspinatus (SSP) RC, som är den muskelsenenhet som oftast förknippas med skador som härrör från överanvändning 8,9. Specifikt passerar kaninens SSC-senkomplex genom en bentunnel och under coracobrachialis-muskeln, vilket är analogt med situationen hos människor där SSP-senkomplexet passerar genom den subacromiala bentunneln och under coracoacromialligamentet7. Denna anatomiska likhet resulterar i att kanin-SSC genomgår liknande muskuloskeletala rörelser som mänsklig SSP, där senan rör sig under acromion under höjning och abduktion av humerus 7,10.
Dessutom har patohistologiska förändringar, liknande RC-tårar hos människa11, observerats hos kanin efter SSC-bristning. Specifikt genomgår muskelmagen svår FD, med en betydande förlust av muskelmassa, minskad tvärsnittsarea för muskelfibrer och ökad fetma. Dessutom bedömde Otarodifard et al. de biomekaniska egenskaperna hos kanin-SSC efter (1) enradiga, (2) dubbelradiga och (3) transosseös-ekvivalenta RC-reparationstekniker, och fann att de initiala biomekaniska egenskaperna hos dessa reparationer liknade mänskliga SSP RC-reparationer utförda i kadaverprover12. Som sådan gör den anatomiska, fysiologiska och biomekaniska likheten mellan kanin SSC och mänsklig SSP den användbar för modellering av RC-skador.
Även om många djurarter, inklusive råttor, möss, hundar och får, har använts i studien av RC-sjukdom och reparation 6,13,14,15, är graden av skadekronicitet en nyckelfaktor. Detta beror på att RC-bristningar kan vara asymtomatiska och ofta kan diagnostiseras mycket senare när bristningen har förstorats och blivit kronisk till sin natur, med både senan och muskeln som uppvisar allvarlig degeneration16,17,18. De flesta RC-reparationsmodeller använder dock akuta skademodeller, där den friska senan transekteras och sedan omedelbart repareras 19,20,21,22. Detta sker till stor del av logistiska skäl och teknisk lätthet, vilket resulterar i få studier som undersöker RC-patofysiologin i en kronliknande miljö. Dessutom kan flera djurmodeller ha egenskaper som hindrar deras användning för kroniska RC-studier.
Till exempel, även om råttan har använts i stor utsträckning för att modellera RC-rivning och ingrepp, står bristen på betydande fettansamling efter skada i kontrast till det mänskliga tillståndet, och dess lilla storlek gör upprepade kirurgiska ingrepp utmanande23. Vidare, även om Gerber et al. använde infraspinatus från får för att studera muskelatrofi och FD efter kronisk RC tår24, finns det en viss anatomisk olikhet mellan fårinfraspinatus och mänsklig SSP, liksom många logistiska utmaningar för att studera och hysa en så stor djurmodell. Dessutom utvecklade Gerber et al. en modell för fördröjd RC-skada hos får genom att släppa det ytliga huvudet på infraspinatusmuskeln och senan för att efterlikna egenskaperna hos en kronisk RC-bristning, och utvärderade sedan effekten av olika reparationstekniker på senan vid 4 till 6 veckor. Dessvärre hade denna kronliknande fårmodell en begränsning, i och med att änden av den frigjorda senan blev omöjlig att skilja från ärrvävnad under det andra kirurgiskaingreppet.
Coleman et al. utvecklade också en modell för kronisk RC-bristning hos får genom att täcka den transekterade senänden med ett syntetiskt membran vid tidpunkten för den första operationen, vilket möjliggjorde näringsdiffusion och effektivt minimerade ärrvävnadsbildning runt den skadade vävnaden, samtidigt som diskrimineringen mellan senan ochärrvävnaden förbättrades.. Samtidigt föreslog Turner et al. att en fördröjd reparation bör utföras inom 4 veckor, eftersom direkt återinfästning sällan sker vid en massiv senindragning27. Tillsammans har dessa studier bidragit till reproducerbara och tillförlitliga protokoll för en framgångsrik etablering av en kronisk-liknande kanin SSC RC-skademodell.
I detta protokoll etableras en kronliknande kanin-RC-skademodell vid 4 veckor, där patologiska förändringar relaterade till fibros och FD-medierad muskelatrofi kan studeras via histologiska bedömningar. I synnerhet lindning av den fria änden av muskel-senan med hjälp av en silikonbaserad penroseslang vid tidpunkten för den första operationen möjliggör tydlig identifiering av RC-vävnaderna under det andra kirurgiska ingreppet och underlättar följaktligen en säker reparation för att studera RC-läkning med och utan ställningsförstärkning. Sammantaget kan en kronisk-liknande kanin-SSC-modell bättre efterlikna RC-patofysiologi och ställa minimala tekniska och logistiska krav.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

Rabbit rotatorkuffen (RC) patofysiologi kan leda till progressiva och mycket degenerativa förändringar i dess associerade muskulatur och senor, vilket negativt påverkar kliniskt relevanta parametrar, såsom styrka och indragning av muskelsenan/myotendinös enhet, vilket i slutändan orsakar förlust av axelfunktion och negativt påverkar RC-reparationsresultat. Djurmodeller som efterliknar aspekter av mänsklig RC-anatomi och patofysiologi är avgörande för att främja den konceptuella förståelsen av skadeprogression och utveckla effektiv vävnadsteknik och regenerativ medicinbaserad terapi.
I detta sammanhang är en modell av kanin subscapularis (SSC) lämplig på grund av (i) dess anatomiska likhet med den mänskliga supraspinatus (SSP) ben-sen-muskelenheten, som är den oftast skadade RC-platsen; ii) dess patofysiologiska likhet med människor i fråga om fibros och muskelfettdegeneration (FD), och (iii) dess lämplighet för kirurgiska ingrepp. Därför är målet med denna studie att beskriva de kirurgiska teknikerna för att inducera SSC RC-skada. I korthet innebär proceduren isolering av SSC genom att identifiera coracobrachialis-muskeln följt av en fullhudstranssektion vid muskel-senkorsningen och linda in den fria änden av muskelsenan med en silikonbaserad penrose-slang för att förhindra spontan återfastsättning. Histologiska utvärderingar utförs för att övervaka progressionen av muskel-FD 4 veckor efter operationen med hjälp av hematoxylin och eosin (H&E) samt Massons trikromfärgning.
Förlust av muskler och FD var uppenbar 4 veckor efter transsektion av SSC-muskelsenövergången, liknande humana RC-patofysiologiska tillstånd. Detta protokoll visar stegen för att framgångsrikt etablera en kronisk-liknande kanin SSC RC-skademodell, som kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att studera skelettmuskelförändringar associerade med RC-patofysiologi och hjälpa till att utveckla nya terapeutiska strategier för kronisk-liknande RC-tårar.

För att bedöma kroniciteten av RC-patologi efter transsektion av SSC-muskelsenenheter, karakteriserades övergripande vävnadsmorfologi och cellulära förändringar via bruttoutvärdering och histologisk analys (H&E respektive Massons trikromfärgning), 4 veckor efter skada (Figur 2, Figur 3 och Figur 4 ). Representativa bilder av grov vävnadsmorfologi visade uppkomsten av vit fettliknande vävnad i skadade SSC-muskler, vilket saknades i kontrollgruppen (Figur 2). H&E-färgning bekräftade förlust av muskelcellularitet och organisation, vilket ersattes med ett stort antal adipocyter (tomma utrymmen omgivna av tunna kanter av cytoplasma som innehöll komprimerade kärnor) i skadade SSC-muskler i förhållande till kontrollgruppen (Figur 3A).
Semikvantitativ bedömning av H&E-bilder visade en hög grad av intramuskulära fettceller i skadade SSC-muskler (36,5 % ± 8,5 %) jämfört med kontrollgruppen (0,69 % ± 0,18 %) (Figur 3B). Massons trikromfärgning bekräftade också muskelatrofi och oorganiserade kollagenfiberarrangemang i skadade SSC-muskler i förhållande till kontrollgruppen (Figur 4A). Semikvantitativ bedömning av Massons trikrombilder visade en minskning av muskelcellulariteten för skadade SSC-muskler (41,3 % ± 2,6 %) jämfört med kontrollgruppen (99,2 % ± 0,16 %) (Figur 4B). Även om ytterligare semikvantitativ bedömning inte visade någon signifikant skillnad för fibrotisk vävnadsbildning mellan skadade SSC-muskler (22,3 % ± 13,1 %) och kontrollgruppen (0,07 % ± 0,05 %), observerades en hög grad av fibros i skadade SSC-muskler (Figur 4C). Sammantaget visade grov vävnadsmorfologi och histologisk analys att skadad SSC-muskelsena uppvisade allvarlig muskelatrofi, fettansamling och fibros, vilket är kända kännetecken för kronisk RC-patofysiologi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> Figur 1: Kirurgiskt ingrepp för kronisk-liknande SSC-muskelsenskademodell. (A) Ett kirurgiskt fönster skapades och anatomiska landmärken som överarmsbenet, överarmsbenet och nyckelbenet identifierades genom palpation. (B) Ett 3,0 cm långt hudsnitt gjordes lägre än nyckelbenet. (C) Coracobrachialis-muskeln delades för att exponera SSC-muskeln. (D) SSC-muskelsenan isolerades. (E) Ett silikonbaserat penrosedränage användes för att linda in SSC-muskelsenvävnaden. (F) SSC-muskelsenan transekterades. (G) Coracobrachialis-muskeln approximerades med hjälp av PGA-suturer. (H) Hudsnittet stängdes med nylonsuturer. (I) Efter operationen fick kaninerna ett mjukt halsband att bära. Förkortningar: SSC = subscapularis; PGA = polyglykolsyra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> Figur 2: Grov morfologi för representativa SSC-muskler. Svarta pilar representerar vit fettvävnad. Förkortning: SSC = subscapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> Figur 3: Histologisk analys av kronliknande RC-skademodell vid 4 veckor. (A) Representativa H&E-färgade histologibilder visade atrofiska muskelfibrer och ansamling av adipocyter. (B) Kvantifiering av procentuell ackumulering av skadat muskelfett. n = 3 kaniner. Felstaplar indikerar SEM. *, statistiskt signifikant (s≤ 0,05). Skalstaplar = 5 000 μm (A, vänster kolumn), 600 μm (A, höger kolumn). Förkortningar: SSC = subscapularis; RC = rotatorkuffen; H&E = hematoxylin och eosin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> Figur 4: Histologisk analys av kronisk-liknande RC-skademodell vid 4 veckor. (A) Massons trikromfärgade bilder visade betydande fibros. Fibrös bindväv färgas blå. (B) Kvantifiering av andelen muskelvävnad och (C) fibrotisk vävnad. n = 3 kaniner. Felstaplar indikerar SEM. *, statistiskt signifikant (p≤ 0,05). Skalstreck = 5 000 μm (A, vänster kolumn), 200 μm (A, höger kolumn). Förkortningar: SSC = subscapularis; RC = rotatorkuff. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

Denna studie beskriver procedurer för att fastställa en kronisk-liknande kanin rotatorkuff (RC) skada. Specifikt skapas skadan i subscapularis (SSC) muskelsena/myotendinös enhet för att efterlikna mänsklig RC-anatomi och patofysiologi, inklusive allvarlig muskelfettdegeneration (FD). Detta protokoll kan användas för att studera RC-skador och utvärdera regenerativa terapier.

Utveckling av en kaninkronisk-liknande rotatorkuffskademodell för studier av fibros och muskelfettdegeneration

Rabbit rotator cuff (RC) pathophysiology can lead to progressive and highly degenerative changes in its associated musculature and tendons, which ...

Detta protokoll demonstrerar en komplex kirurgisk teknik för att inducera en kronisk-liknande rotatorkuffskada hos kaniner, och är användbar för att studera rotatorkuffpatogenes och utveckla regenerativa terapier. Kaniner är medelstora till stora djurmodeller som är lätta att hysa logistiskt, manipulera kirurgiskt och visar höga nivåer av rotatorkuffmuskelfettdegeneration när de skadas, liknande människor. Den subscapularis skademodell som visas här är anatomiskt analog med supraspinatus bensenan muskelkomplex, en av de oftast skadade rotatorkuffenheterna.Till att börja med, förbered det kirurgiska fönstret genom att raka det avsedda snittstället på en sövd kanin. Använd bomullspinnar och rengör området med tre alternerande appliceringar av Betadine och 70 % alkohol i cirkulära rörelser. Administrera 20 milligram per kilo cefalexin intramuskulärt som ett profylaktiskt antiinfektivt medel.Gör ett tre till fyra centimeter långt hudsnitt som är lägre än nyckelbenet, dela deltopektorsintervallet med en sax och dra tillbaka för att komma åt axeln. För att lokalisera subscapularis-muskelsenan, identifiera först coracobrachialis-muskeln. Identifiera sedan subscapularis-senan och sätt in en rätvinklig klämma för att exponera hela senan vid dess införande på den mindre tuberositeten i humerus.Isolera muskelsenan subscapularis. Efter administrering av smärtstillande medel före operationen lokalt nära transsektionsstället, linda in subscapularis-muskelsenenheten i silikonbaserad penroseslang för att förhindra oönskad fastsättning i de omgivande vävnaderna och underlätta efterföljande vävnadshämtning. För att framkalla skada, skapa en fullhudstranssektion vid muskelsenans korsning med hjälp av en kirurgisk skalpell nummer 11.Vid behov, stoppa blödningen genom att applicera tryck med en bit gasbinda och använd koksaltlösning för att skölja såret vid behov. För att stänga såret, använd en 4-0 polyglykolsyrasutur för att närma sig deltoideusmuskelvävnaden och en 4-0 nylon- eller silkessutur för att stänga hudsåret, följt av sårrengöring. Administrera 0,03 milligram per kilo buprenorfin subkutant som smärtstillande medel en gång omedelbart efter operationen och två gånger dagligen under de kommande 48 timmarna.Den histologiska analysen av den kronisk-liknande rotatorkuffskademodellen vid fyra veckor visas i denna figur. H&E-färgningen bekräftade förlusten av muskelcellularitet och organisation, som ersattes med ett stort antal adipocyter i skadade subscapularismuskler i förhållande till kontrollgruppen. Kvantifieringen av den skadade muskelfettansamlingen i procent presenteras i denna figur.Massons trikromfärgning bekräftade också muskelatrofi och oorganiserade kollagenfiberarrangemang i skadade subscapularismuskler i förhållande till kontrollgruppen. Kvantifieringen av andelen muskel- och fibrotisk vävnad visas i denna figur. Bedömningen visade en minskning av muskelcellulariteten för skadade subscapularismuskler i förhållande till kontrollgruppen.En hög grad av fibros observerades också i skadade subscapularismuskler. Att identifiera subscapularis-senan och linda subscapularis-muskelsenan i penroseslang är de viktigaste stegen i denna procedur. Efter denna procedur kan en terapeutisk intervention tillämpas.I detta fall kan de analyser som beskrivs här, tillsammans med ytterligare myografi eller gånganalys, användas för att bedöma interventionsresultatet. Denna teknik Ã¤r avgörande fÃ¶r att hjÃ¤lpa fÃ¶rrÃ¤rkningar i fÃ¶rjan av rotatorkuffen patofysiologi, samt fÃ¶rjÃ¤nda utvecklingen av nya terapier fÃ¶r muskelsenor reparation och regenerering.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Tillämpning av en C. elegans Dopamin Neuron Degeneration-analys för validering av potentiella Parkinsons sjukdomsgener

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Beredning av Aggregate råtthjärna kulturer för Neuron och Glia utvecklingsstudier

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Utveckling av automatiserad bildbehandling och analys för zebrafisk kemiska skärmar.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Intravenös Microinjections av Zebrafish Larver att studera akut njurskada

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Metoden för Gnagare Hela Embryo Culture med Rotator-typ System Bottle Kultur

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolering, kultur, och transplantation av muskelsatellitceller

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Kosttillskott av fleromättade fettsyror i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...