Name: development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration
Uploaded: 2023-03-31T14:50:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Dai Fei Elmer Ker'in araştırması, Gıda ve Sağlık Bürosu, Hong Kong Özel İdari Bölgesi (Sağlık Tıp ve Araştırma Fonu: 08190466), İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu, Hong Kong Özel İdari Bölgesi (Tier 3 Ödülü: ITS/090/18; Health@InnoHK programı), Hong Kong Araştırma Hibeleri Konseyi, Hong Kong ÖİB (Erken Kariyer Programı Ödülü: 24201720 ve Genel Araştırma Fonu: 14213922) ve Hong Kong Çin Üniversitesi (Fakülte İnovasyon Ödülü: FIA2018/A/01). Dan Wang'ın araştırması, Gıda ve Sağlık Bürosu, Hong Kong Özel İdari Bölgesi (Sağlık Tıp ve Araştırma Fonu, 07180686), İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu, Hong Kong Özel İdari Bölgesi (Tier 3 Ödülü: ITS/333/18; Health@InnoHK programı) ve Hong Kong Araştırma Hibeleri Konseyi, Hong Kong ÖİB (Genel Araştırma Fonu: 14118620 ve 14121121).

Tüm işlemler, enstitünün hayvan deneyleri etik kurulu tarafından onaylanan bir protokole göre hayvan ameliyatları için ayrılmış uygun donanımlı bir odada steril cerrahi teknik kullanılarak yapılmalıdır. Bu çalışmada tavşan ameliyatları Hong Kong Çin Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Cerrahi prosedür
<ol><li>Cerrahi alanı hazırlamak için, bir ısıtma yastığını önceden ısıtın ve tavşanın vücut ısısını korumak için steril cerrahi örtülerle kaplayın. Daha sonra, sterilize edilmiş cerrahi alet ve malzemeleri ( Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi) yerleştirin ve bunları cerrahın tercihine göre düzenleyin.</li>
	<li>Yeni Zelanda beyaz tavşanlarına 35 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin intramüsküler uygulaması yoluyla anesteziyi indükleyin (3.5 ila 4.5 kg ağırlığında, yaklaşık 5-6.5 aylık; bu çalışmada iki erkek ve bir dişi tavşan kullanılmıştır). Daha sonra, anesteziyi bir pençe ve/veya kuyruk kıstırma testi ile onaylayın.</li>
	<li>Cerrahi düzlemi sürdürmek için ek anestezi gerekiyorsa, marjinal kulak damarı28 yoluyla intravenöz olarak 10 mg / kg ketamin ve 3 mg / kg ksilazin uygulayın ve hayvanın solunum hızını 5-10 dakikalık düzenli aralıklarla izleyin.</li>
	<li>Ameliyat penceresini hazırlamak için, amaçlanan insizyon bölgesini (SSC kas-tendon ünitesine yüzeysel cilt bölgesi) tıraş edin ve üç alternatif betadin ve% 70 alkol uygulamasıyla temizleyin. Betadin ve% 70 alkolü dairesel hareketlerle (içeriden dışarıya) uygulamak için pamuklu çubuk kullanın. Tavşanın gözlerini nemli ve yağlı tutmak için göz merhemi kullanın. Anti-enfektif ajan olarak intramüsküler olarak 20 mg / kg sefaleksin uygulayın.</li>
	<li>Klavikula inferiorunda 3-4 cm'lik bir cilt insizyonu yapın, 11 numaralı cerrahi neşter kullanarak deltopektoral aralığı ayırın ve omuza erişim sağlamak için geri çekilin (Şekil 1A,B).</li>
	<li>SSC kas-tendon ünitesini bulmak için önce coracobrachialis kasını (SSC tendon ekini kaplayan doku olarak) tanımlayın ve ayırın. Bunu takiben, SSC tendonunu tanımlayın ve humerusun daha az tüberozitesine yerleştirildiğinde tüm SSC tendonunu ortaya çıkarmak için dik açılı bir klemp yerleştirin (Şekil 1C).</li>
	<li>Yaralanmayı başlatmadan önce, SSC kas-tendonunu izole edin (Şekil 1D) ve transeksiyon bölgesinin yakınında lokal olarak intraoperatif anestezik (0.2 mg / kg% 0.5 bupivakain) uygulayın. Çevredeki dokulara istenmeyen yapışmayı önlemek ve daha sonra doku alımına yardımcı olmak için SSC kas-tendon ünitesini silikon bazlı penrose tüpüne (Şekil 1E) sarın.</li>
	<li>Yaralanmayı indüklemek için, cerrahi bir No. 11 neşter kullanarak kas-tendon kavşağında tam kalınlıkta bir transeksiyon oluşturun (Şekil 1F). Gerektiğinde, bir parça gazlı bezle baskı uygulayarak kanamayı durdurun ve gerektiğinde yarayı sulamak için tuzlu su kullanın.</li>
	<li>Yarayı kapatmak için, deltoid kas dokusunu yeniden yaklaştırmak için 4-0 poliglikolik asit (PGA) sütür kullanın (Şekil 1G) ve cilt yarasını kapatmak için 4-0 naylon sütür kullanın (Şekil 1H).</li>
	<li>Analjezik olarak 0.03 mg / kg buprenorfinin deri altı uygulaması yoluyla ameliyat sonrası bakım sağlayın (ameliyattan hemen sonra bir kez ve sonraki 48 saat boyunca günde iki kez29).</li>
	<li>Tavşanların kapalı bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin ve kendi kendine sakatlanma, cerrahi bölgelerin yalanması ve dikişlerin alınması dahil olmak üzere istenmeyen davranışları önlemek için yumuşak bir tasma uygulayın (Şekil 1I).</li>
	<li>Hayvanları kilo ve davranış değişiklikleri açısından izleyin. Vücut ağırlığının %10'undan fazla herhangi bir azalmayı ve kontrol edilemeyen şiddetli ağrıyı bildirin (beş davranışsal eyleme göre değerlendirilir: yörünge sıkılaştırma, yanak düzleştirme, burun deliği şekli değişiklikleri, bıyık pozisyonu değişiklikleri ve kulak şekli ve pozisyon değişiklikleri) erken ötenazi gibi müdahalelerin gerekli olup olmadığını belirlemek için veterinere başvurun.</li>
</ol>2. Örnek hasadı
<ol><li>Tavşanları yaralanma anından itibaren 4 haftada ötenazi yapın. Tavşanları uyuşturun ve öldürücü dozda sodyum pentobarbital (60 mg / kg'dan fazla) verin. Torakotomi ile ölümü onaylayın.</li>
	<li>Humerus başını tanımlayın ve daha büyük ve daha küçük tüberkülleri ve tüm yumuşak doku eklerini korurken cerrahi olarak çıkarın. Kemiği kireçten arındırmak için oda sıcaklığında 1 ay boyunca (her 72 saatte bir ortam değişikliği ile) %10 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisine aktarmadan önce 4 °C'de 72 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.</li>
	<li>Dekalsifikasyondan sonra, numuneleri kademeli etanol dehidrasyonu, parafin gömme, histolojik kesit alma (8 μm kesitler) ve hematoksilen ve eozin (H & E) ve Masson'un trikrom çözeltileri30,31,32 ile boyama kullanarak standart histolojik işleme tabi tutun.</li>
	<li>Görüntüleri 10x büyütmede dik bir mikroskopla yakalayın.</li>
	<li>Tercih edilen bir grafik tasarım yazılımı kullanarak daha önce33,34 açıklandığı gibi, kas içindeki kas, fibröz doku ve yağ alanını ve yüzdesini ölçerek H&E ve Masson'un trikrom görüntülerinin yarı nicelleştirmesini gerçekleştirin. Bu örnekte Adobe Photoshop yazılımı (https://www.adobe.com) kullanılmıştır.<ol><li>Sihirli değnek aracını kullanarak belirli bir doku tipini temsil eden belirli bir rengin bir bölgesini seçin (kırmızı kas dokusu, mavi fibroz ve beyaz yağı temsil eder).</li>
		<li>Menü öğelerini tıklatın Seç | Ters | Seçimi kaydet | Bölüme bir ad verin.</li>
		<li>Menü öğelerine tıklayarak işaretli bölgedeki piksel sayısını sayın Pencere | Ölçüm Günlüğü | Bu piksel değerlerini kaydetmek ve seçilen doku tiplerinin yüzdesini manuel olarak hesaplamak için Ölçümü Kaydet.</li>
	</ol></li>
</ol>3. İstatistiksel analiz
<ol><li>Histolojik veriler için, tercih edilen analitik yazılımı kullanarak istatistiksel analizi gerçekleştirin. Kontrol ve yaralı gruplar arasında iki bağımsız örneğin karşılaştırılması için bir Öğrenci t-testi yapın.</li>
	<li>Verileri, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak ifade edin. <0.05'lik bir p değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.</li>
</ol>

Yazarların beyan etmek için rekabet eden çıkarları yoktur.

Tekrarlanabilir ve fizyolojik olarak ilgili bir hayvan modeli, hastalık patogenezinin anlaşılmasını ilerletme, klinik tedavilerin sonuçlarını değerlendirme ve cerrahi tedavileri iyileştirme ve daha da geliştirme yeteneği sağlar35. Bu çalışmada, insan RC anatomisi ve patofizyolojisinin özelliklerini taklit eden güvenilir ve doğru bir tavşan SSC modeli oluşturulmuştur. RC yırtıkları, ilerleyici ve muhtemelen geri dönüşü olmayan kas dejeneratif değişikliklerle ilişkilidir ve bu da iyileşme potansiyelinin azalmasına neden olur. Örneğin, Ko ve ark. tavşan SSP'sinin 6 haftada yeniden bağlanmasının sonraki 6 hafta içinde kas atrofisi veya FD'yi tersine çevirmediğini gösterdi. Bu tür FD aracılı kas atrofisi, tendon-kas kuvveti ve eklem hareket açıklığı dahil olmak üzere cerrahi sonuçları etkileyebilecek birçok önemli klinik parametreyi etkiler36,37.
Burada oluşturulan protokol, SSC kas-tendon ünitelerinin transeksiyonundan sonra önemli kronik benzeri özellikler gösterdi. Spesifik olarak, bu değişiklikler gözle görülür şekilde azalmış kas kütlesi ve artmış yağ içeriği ve fibrotik dokuyu içerir (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4). Bu bulgular, insan RC gözyaşlarında bildirilen dejeneratif değişikliklerletutarlıdır 38. Son yıllarda, sıçan,akromion 38,39,40 altında seyahat eden hem insan hem de sıçan SSP'leri ile yüksek anatomik benzerlikleri nedeniyle RC hastalığı ve yaralanması için en yoğun olarak çalışılan hayvan modellerinden biri olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, sıçan SSP'sinin akromiyal arkın altından geçen kısmının, insanlarda olduğu gibi tendinöz olanın aksine kaslı olduğuna dikkat edilmelidir41. En önemlisi, Barton ve ark. sıçanlarda23 SSP tendon dekolmanından sonra, insan durumunun42 aksine önemli bir yağ birikimi eksikliğini fark ettiler. Bu nedenle, tavşan SSC kompleksinin, insanların kronik RC yırtılmasını taklit etmek için uygun bir model sağlayabileceğine inanılmaktadır.
Bu modelin tekrarlanabilirliğini sağlamak için, bu protokolü gerçekleştirirken iki noktaya dikkat etmek önemlidir. İlk olarak, kas-tendon ünitelerinin transeksiyonundan sonra, kesilen tendonun serbest ucu, sonraki manipülasyonlar için tendon alımını zorlaştırabilecek adezyonlar oluşturma riski altında olabilir. Bu sorunu önlemek için, çevre dokulara spontan yapışmayı ve spontan iyileşmeyi önlemek için transeksiyonu takiben kas-tendon bileşkesinin serbest ucunu sarmak için emilemeyen bir silikon tüp kullanıldı (Şekil 1E). Ayrıca, müdahale için ikinci bir prosedür sırasında kesilen kas-tendon ünitesi (yani, güvenli bir onarım yapmak için; veriler gösterilmemiştir), ilk ameliyat sırasında yaralı dokuların ucunun sarılmasıyla açıkça tanımlanabilir. Bu teknik ekonomik, etkili ve cerrahide rahatlıkla uygulanabilir43. İkincisi, tavşanlar, ameliyattan sonra zararlı davranışlar sergileyebilen oldukça hassas bir türdür. Bu tür sorunlardan kaçınmak için, kendini yaralama, ameliyat bölgelerinin yalanması ve dikişlerin alınması dahil olmak üzere istenmeyen davranışları önlemek için yumuşak bir yaka da uygulanması şiddetle tavsiye edilir (Şekil 1I). Sert plastikten yapılmış ticari olarak geleneksel E-tasmalarla karşılaştırıldığında, kendi kendine yapılan yumuşak yaka, hayvan refahını veya bilimsel araştırmanın kalitesini etkileyen herhangi bir cilt yaralanmasına veya diğer yan etkilere neden olmamıştır. Birlikte, bu tür adımlar, doğru bir şekilde tekrarlanabilir bir tavşan RC yaralanma modeli oluşturmak için kritik öneme sahiptir ve rejeneratif onarım stratejilerini inceleme imkanı sağlar.
Bir hayvan modelinde tendon patofizyolojisini ve iyileşmesini incelemek için, belirgin ve tekrarlanabilir bir yaralanma yaratılmalı ve çalışma zaman noktaları dikkatlice seçilmelidir. Tendon yaralanması ve iyileşmesi ile ilgili çalışmaların büyük çoğunluğu tamamen kesilen hayvan tendonları üzerinde gerçekleştirilmiştir44, çünkü transeksiyon yüksek oranda tekrarlanabilir ve klinik senaryoyu yeterince simüle edebilen basit bir prosedürdür45,46. Huegel ve ark. kısmen kesilen bir tendonun yaralanmasının, tamamen kesilen bir tendonunkinden daha az şiddetli olduğunu ve immobilizasyonun artmış eklem sertliği de dahil olmak üzere tendon mekaniği üzerinde zararlı bir etkisi olduğunu göstermiştir47. Masif RC yırtığı ortamında görülen atrofi ve FD'yi değerlendirmek için, deneysel olarak gözlenen karakteristik zaman noktalarını tanımlamak önemlidir. Gupta ve ark. erkek tavşanda bir RC yaralanma modelini doğruladılar ve 2 ve 6 haftalık zaman noktalarında kas atrofisi gözlemlediler, daha sonraki zaman noktalarında artan yağ içeriği ile (2 haftada% 5'ten az yağ içeriği ve 6 haftada% 10'dan fazla yağ içeriği), insan RC gözyaşlarında gözlenen patolojik süreçle tutarlı11. Bu çalışmada, erkek ve dişi tavşanlarda 4 hafta boyunca SSC kas-tendon ünitesinin transeksiyonu ile masif bir RC yırtığı oluşturuldu ve bu da SSC kas FD (%36.5 yağ içeriği) ile sonuçlandı. Bu nedenle, erkek ve dişi Yeni Zelanda beyaz tavşanlarında SSC kas FD oluşturmak için 4 haftalık bir zaman noktası uygundur.
Bu çalışmanın çeşitli sınırlamaları mevcuttur. Bunlar şunları içerir: (i) nispeten kısa bir zaman noktası ve kronik benzeri yaralanma oluşumu için potansiyel olarak enflamatuar malzemeler (silikon bazlı penrose boru) gibi hayvan modeli üretimi ile ilişkili adımlar; (ii) eklem kinematiğini ve kas kasılma kuvveti üretimini değerlendirmek için yürüyüş analizi ve elektromiyografi eksikliği gibi hayvan modeli karakterizasyonu ve analizi; ve (iii) diğer RC yaralanma bölgeleriyle karşılaştırma eksikliği gibi hayvan modeli karşılaştırması.
Model oluşturma açısından, insan RC yaralanmaları tipik olarak, burada bildirilen 4 haftalık zaman noktasından nispeten daha uzun olan birkaç yıl boyunca ortaya çıkabilen ilerleyici atrofi ve FD'yi içerir. Nispeten kısa bir süre içinde yaklaşık% 36.5 kas içi yağ üreten bir hayvan modeli lojistik olarak uygun olacağından ve gerekli görülürse uzatılabileceğinden, bu kabul edilebilir olarak kabul edilir. Ayrıca, penrose tüpü gibi silikon bazlı implantların biyouyumluluğu, hücresel bağışıklık tepkisi ve inflamasyon raporları nedeniyle uzun süredir devam eden bir tartışma kaynağı olmuştur47; bu nedenle, inflamasyonla ilişkili RC çalışmaları sürdürülüyorsa, rezeke edilen tendonun sarılması için polietilen glikol (PEG) gibi alternatif bir inert malzeme ikame edilebilir.
Hayvan modeli karakterizasyonu ve analizi açısından, yürüyüş analizinin49 ve elektromiyograf çalışmalarının50 olmaması, çalışmanın bulgularını nitel histolojik verilerle sınırlayabilir. Bu hususlar, omuz kinematiği ve RC kas performansı hakkında nicel veriler oluşturmak için video hareket analizi51 ve yüzey elektromiyografisi50 kullanılarak gelecekteki çalışmalarda ele alınabilir.
Model karşılaştırması açısından, tavşanlardaki SSP ve infraspinatus tendonları da RC çalışmaları için yaygın olarak kullanıldığından, gelecekte bu farklı yaralanma bölgeleri arasında FD de dahil olmak üzere yaralanma şiddetinin karşılaştırılması, model optimizasyonu için ek bölgeler belirleyecektir.
Özetle, bu çalışma erkek ve dişi tavşanlarda kronik benzeri RC yaralanmalarını modellemek için bir protokol geliştirmiştir. Bu model, basitliği (transeksiyon) ve kronikliği (4 hafta) indüklemek için nispeten kısa süresi ve büyük derecede (%36.5) intramüsküler FD üretmesi nedeniyle araştırmacılar için uygundur. Bu nedenle, bu protokolün RC patofizyolojisi çalışmasında araştırmacılara yardımcı olması ve kas-tendon onarımı ve rejenerasyonu için yeni terapötiklerin geliştirilmesini kolaylaştırması beklenmektedir.

Kronik rotator manşet (RC) yırtıkları, kas sistemi ve tendonlarda kasların atrofisi, yağ dokusu birikimi ve fibroz dahil olmak üzere dejeneratif değişikliklerle karakterizedir, bu da RC onarımının sonucunu tehlikeye atabilir ve sonuçta omuz ağrısına ve disfonksiyonuna neden olabilir 1,2,3,4,5 . RC yırtığı patogenezini daha iyi anlamak ve cerrahi sonuçları iyileştirmek için, insan RC anatomisi ve patofizyolojisinin özelliklerini taklit edebilecek uygun hayvan modelleri geliştirmek çok önemlidir. Spesifik olarak, RC yaralanma modelleri aşağıdaki kriterleri karşılamalıdır: (i) yaralanmadan sonra kendiliğinden iyileşme eksikliği; (ii) önemli miktarda fibroz, kas atrofisi ve yağ dokusu birikimi içerir; ve (iii) insanlarda kullanılan cerrahi tekniklerin yaklaşmasına izin verecek yeterli büyüklükte olmalıdır6.
Bu bağlamda, tavşan subskapularis (SSC) kası, benzersiz anatomisi, patofizyolojik yanıtı ve biyomekanik özellikleri göz önüne alındığında, RC patofizyolojisinin incelenmesi için doğru ve güvenilir bir hayvan modeli olarak kullanılabilir7. Gerçekten de, tavşan SSC RC anatomisi, aşırı kullanımdan kaynaklanan yaralanma ile en sık ilişkili kas-tendon ünitesi olan insan supraspinatus (SSP) RC'ye benzer 8,9. Spesifik olarak, tavşan SSC tendon kompleksi kemikli bir tünelden ve korakobrachialis kasının altından geçer, bu da SSP tendon kompleksinin subakromiyal kemik tünelinden ve korakoakromiyal ligamanın7 altından geçtiği insanlardaki duruma benzer. Bu anatomik benzerlik, tavşan SSC'sinin, humerusun yükselmesi ve abdüksiyonu sırasında tendonun akromion altında hareket ettiği insan SSP'si ile benzer kas-iskelet hareketleri geçirmesine neden olur 7,10.
Ayrıca, SSC yırtılmasından sonra tavşanda insan RC yırtıklarına11 benzer patohistolojik değişiklikler gözlenmiştir. Spesifik olarak, kas göbeği, önemli bir kas kütlesi kaybı, kas-lif kesit alanının azalması ve yağlanmanın artması ile şiddetli FD'ye maruz kalır. Ek olarak, Otarodifard ve ark. (1) tek sıralı, (2) çift sıralı ve (3) transosseöz eşdeğer RC onarım tekniklerinden sonra tavşan SSC'nin biyomekanik özelliklerini değerlendirdi ve bu onarımların ilk biyomekanik özelliklerinin kadavra örneklerinde gerçekleştirilen insan SSP RC onarımlarına benzer olduğunu buldu12. Bu nedenle, tavşan SSC'sinin insan SSP'si ile anatomik, fizyolojik ve biyomekanik benzerliği, RC yaralanmalarını modellemek için kullanışlı hale getirir.
Sıçanlar, fareler, köpekler ve koyunlar dahil olmak üzere birçok hayvan türü, RC hastalığı ve onarımıçalışmasında kullanılmış olsa da 6,13,14,15, yaralanma kronikliğinin derecesi önemli bir husustur. Bunun nedeni, RC yırtıklarının asemptomatik olabilmesi ve genellikle çok daha sonra, yırtık büyüdüğünde ve doğada kronik hale geldiğinde, hem tendon hem de kasın ciddi dejenerasyon göstermesiyle teşhis edilebilmesidir16,17,18. Bununla birlikte, çoğu RC onarım modeli, sağlıklı tendonun kesildiği ve daha sonra hemen onarıldığı akut yaralanma modellerini kullanır 19,20,21,22. Bu, büyük ölçüde lojistik uygunluk ve teknik kolaylık nedenleriyle ortaya çıkar ve RC patofizyolojisini kronik benzeri bir ortamda inceleyen az sayıda çalışma ile sonuçlanır. Ayrıca, birkaç hayvan modeli, kronik RC çalışmaları için kullanımlarını engelleyen özelliklere sahip olabilir.
Örneğin, sıçan RC yırtılmasını ve müdahalesini modellemek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, yaralanmayı takiben önemli yağ birikiminin olmaması insan durumuyla çelişmektedir ve küçük boyutu tekrarlanan cerrahi prosedürleri zorlaştırmaktadır23. Ayrıca, Gerber ve ark. kronik RC yırtılmasından sonra kas atrofisi ve FD'yi incelemek için koyun infraspinatusunu kullanmış olsa da24, koyun infraspinatusu ile insan SSP'si arasında bazı anatomik farklılıkların yanı sıra bu kadar büyük bir hayvan modelini incelemek ve barındırmak için çok sayıda lojistik zorluk vardır. Ek olarak, Gerber ve ark. kronik bir RC yırtığının özelliklerini taklit etmek için infraspinatus kasının ve tendonun yüzeysel başını serbest bırakarak koyunlarda gecikmiş bir RC yaralanma modeli geliştirdiler ve daha sonra 4 ila 6 haftada tendon üzerinde farklı onarım tekniklerinin etkinliğini değerlendirdiler. Ne yazık ki, bu kronik benzeri koyun modeli, serbest bırakılan tendonun ucunun ikinci cerrahi prosedür sırasında skar dokusundan ayırt edilemez hale gelmesi nedeniyle bir sınırlamaya sahipti25.
Coleman ve ark. ayrıca, ilk ameliyat sırasında kesilen tendon ucunu sentetik bir zarla kaplayarak koyunlarda kronik bir RC yırtık modeli geliştirdiler, bu da besin difüzyonuna izin verdi ve yaralı doku çevresinde skar dokusu oluşumunu verimli bir şekilde en aza indirirken, tendon ve skar dokusu arasındaki ayrımı iyileştirdi26. Bu arada, Turner ve ark. büyük bir tendon retraksiyonunda doğrudan yeniden bağlanma nadiren gerçekleştiğinden, gecikmiş bir onarımın 4 hafta içinde yapılması gerektiğini önermiştir27. Birlikte, bu çalışmalar, kronik benzeri bir tavşan SSC RC yaralanma modelinin başarılı bir şekilde kurulması için tekrarlanabilir ve güvenilir protokollere katkıda bulunmuştur.
Bu protokolde, 4. haftada fibrozis ve FD aracılı kas atrofisi ile ilgili patolojik değişikliklerin histolojik değerlendirmelerle incelenebildiği kronik benzeri bir tavşan RC yaralanma modeli oluşturulmuştur. Özellikle, ilk ameliyat sırasında kas-tendon bileşkesinin serbest ucunun silikon bazlı bir penrose tüpü kullanılarak sarılması, ikinci cerrahi prosedür sırasında RC dokularının net bir şekilde tanımlanmasını sağlar ve sonuç olarak, iskele büyütme ile ve iskele büyütme olmadan RC iyileşmesini incelemek için güvenli bir onarımı kolaylaştırır. Toplamda, kronik benzeri bir tavşan SSC modeli, RC patofizyolojisini daha iyi taklit edebilir ve minimum teknik ve lojistik gereksinimler oluşturabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Poly glycolic acid (PGA)</td>
			<td>e-Sutures</td>
			<td>GBK884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with teeth</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors&#160;</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel with handle</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (4-0 Silk)</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td>19054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical heating pad</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needles</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>0.12 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Tin Hang Tech</td>
			<td>b5274-5g</td>
			<td>1-2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (Genetimes)</td>
			<td>sc-487556</td>
			<td>20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>35 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>more than 60 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>LASEC, CUHK</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 20.01</td>
			<td>Adobe Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Easy Thru, China</td>
			<td>ISO13485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Taobao, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological staining reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Stain Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R03040</td>
			<td>5% Aqueous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome Stain&#160;(Masson)&#160;Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a rabbit chronic-like rotator cuff injury model for study of fibrosis and muscular fatty degeneration

Tavşan rotator manşet (RC) patofizyolojisi, ilişkili kas ve tendonlarında ilerleyici ve oldukça dejeneratif değişikliklere yol açabilir, bu da kas-tendon/miyotendinöz ünitenin gücü ve retraksiyonu gibi klinik olarak ilgili parametreleri olumsuz etkiler, sonuçta omuz fonksiyon kaybına neden olur ve RC onarım sonuçlarını olumsuz etkiler. İnsan RC anatomisi ve patofizyolojisinin yönlerini taklit eden hayvan modelleri, yaralanma ilerlemesinin kavramsal anlayışını ilerletmek ve etkili doku mühendisliği ve rejeneratif tıp tabanlı terapötikler geliştirmek için çok önemlidir.
Bu bağlamda, bir tavşan subskapularis (SSC) modeli, (i) en sık yaralanan RC bölgesi olan insan supraspinatus (SSP) kemik-tendon-kas ünitesine anatomik benzerliği; (ii) fibroz ve kas yağ dejenerasyonu (FD) açısından insanlara patofizyolojik benzerliği; ve (iii) cerrahi prosedürlere uygunluğu. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, SSC RC yaralanmasını indüklemek için kullanılan cerrahi teknikleri tanımlamaktır. Kısaca prosedür, korakobrachialis kasının tanımlanması ve ardından kas-tendon bileşkesinde tam kalınlıkta bir transeksiyon yapılması ve spontan yeniden bağlanmayı önlemek için kas-tendon bileşkesinin serbest ucunun silikon bazlı bir penrose tüpü ile sarılması yoluyla SSC'nin izolasyonunu içerir. Ameliyattan 4 hafta sonra hematoksilen ve eozin (H&E) ve Masson'un trikrom boyaması kullanılarak kas FD'sinin ilerlemesini izlemek için histolojik değerlendirmeler yapılır.
Kas kaybı ve FD, insan RC patofizyolojik koşullarına benzer şekilde, SSC kas-tendon bileşkesinin transeksiyonundan 4 hafta sonra belirgindi. Bu protokol, RC patofizyolojisi ile ilişkili iskelet kası değişikliklerini incelemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilecek ve kronik benzeri RC yırtıkları için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olabilecek kronik benzeri bir tavşan SSC RC yaralanma modelini başarılı bir şekilde oluşturma adımlarını göstermektedir.

SSC kas-tendon ünitelerinin transeksiyonunu takiben RC patolojisinin kronikliğini değerlendirmek için, genel doku morfolojisi ve hücresel değişiklikler, yaralanmadan 4 hafta sonra brüt değerlendirme ve histolojik analiz (sırasıyla H&E ve Masson'un trikrom boyaması) ile karakterize edildi (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4). Brüt doku morfolojisinin temsili görüntüleri, kontrol grubunda bulunmayan yaralı SSC kaslarında beyaz yağ benzeri doku görünümünü gösterdi (Şekil 2). H&E boyama, kontrol grubuna göre yaralı SSC kaslarında çok sayıda adiposit (sıkıştırılmış çekirdekler içeren ince sitoplazma kenarları ile çevrili boş alanlar) ile değiştirilen kas hücreselliği ve organizasyonu kaybını doğruladı (Şekil 3A).
H&E görüntülerinin yarı kantitatif değerlendirmesi, kontrol grubuna (%0.6±9 ± %0.18) göre yaralı SSC kaslarında (%36.5 %8.5) yüksek derecede kas içi adiposit bulunduğunu gösterdi (Şekil 3B). Masson'un trikrom boyaması, kontrol grubuna göre yaralı SSC kaslarında kas atrofisi ve düzensiz kollajen lif düzenlemelerini de doğruladı (Şekil 4A). Masson'un trikrom görüntülerinin yarı kantitatif değerlendirmesi, kontrol grubuna (%99.2 ± %0.16) göre yaralı SSC kasları için kas hücreselliğinde (%41.±3 %2.6) bir azalma gösterdi (Şekil 4B). Daha ileri yarı kantitatif değerlendirme, yaralanan SSC kasları (%22.3 ± %13.1) ile kontrol grubu (%0.07 ± %0.05) arasında fibrotik doku oluşumu açısından anlamlı bir fark göstermese de, yaralı SSC kaslarında yüksek derecede fibrozis gözlendi (Şekil 4C). Brüt doku morfolojisi ve histolojik analiz birlikte, yaralı tavşan SSC kas-tendonunun, kronik RC patofizyolojisinin bilinen özellikleri olan şiddetli kas atrofisi, yağ birikimi ve fibroz sergilediğini gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig01.jpg"> Şekil 1: Kronik benzeri SSC kas-tendon yaralanması modeli için cerrahi prosedür. (A) Bir cerrahi pencere oluşturuldu ve humerus, humerus başı ve klavikula gibi anatomik işaretler palpasyonla tanımlandı. (B) Klavikula inferiline inferiordan 3.0 cm'lik bir cilt insizyonu yapıldı. (C) Coracobrachialis kası, SSC kasını ortaya çıkarmak için bölündü. (D) SSC kas-tendon ünitesi izole edildi. (E) SSC kas-tendon dokusunu sarmak için silikon bazlı bir penroz dren kullanıldı. (F) SSC kas-tendon kesildi. (G) Coracobrachialis kası PGA sütürleri kullanılarak yeniden yaklaştırıldı. (H) Cilt kesisi naylon dikişlerle kapatıldı. (I) Ameliyattan sonra, tavşanlara giymeleri için yumuşak bir tasma verildi. Kısaltmalar: SSC = subscapularis; PGA = poli glikolik asit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig02.jpg"> Şekil 2: Temsili SSC kaslarının brüt morfolojisi. Siyah oklar beyaz yağ dokularını temsil eder. Kısaltma: SSC = subscapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig03.jpg"> Şekil 3: 4. haftada kronik benzeri RC yaralanma modelinin histolojik analizi. (A) Temsili H & E boyalı histoloji görüntüleri, atrofik kas lifleri ve adiposit birikimi gösterdi. (B) Yaralı kas yağ birikimi yüzdesinin ölçülmesi. n = 3 tavşan. Hata çubukları SEM. *, istatistiksel olarak anlamlı (p≤ 0.05). Ölçek çubukları = 5.000 μm (A, sol sütun), 600 μm (A, sağ sütun). Kısaltmalar: SSC = subscapularis; RC = döndürücü manşet; H&E = hematoksilen ve eozin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64828/64828fig04.jpg"> Şekil 4: 4. haftada kronik benzeri RC yaralanma modelinin histolojik analizi. (A) Masson'un trikrom boyalı görüntüleri önemli fibrozis gösterdi. Fibröz bağ dokusu mavi renktedir. (B) Kas ve (C) fibrotik doku oranının ölçülmesi. n = 3 tavşan. Hata çubukları SEM'i gösterir. *, istatistiksel olarak anlamlı (p≤ 0.05). Ölçek çubukları = 5.000 μm (A, sol sütun), 200 μm (A, sağ sütun). Kısaltmalar: SSC = subscapularis; RC = döndürücü manşet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64828/64828fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration at JoVE.com

Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration

Bu çalışma, kronik benzeri bir tavşan rotator manşet (RC) yaralanması oluşturma prosedürlerini detaylandırmaktadır. Spesifik olarak, yaralanma, şiddetli kas yağ dejenerasyonu (FD) dahil olmak üzere insan RC anatomisini ve patofizyolojisini taklit etmek için subskapularis (SSC) kas-tendon/miyotendinöz ünitede oluşturulur. Bu protokol, RC yaralanmalarını incelemek ve rejeneratif tedavileri değerlendirmek için uygulanabilir.

Fibrozis ve Kas Yağ Dejenerasyonunun İncelenmesi için Tavşan Kronik Benzeri Rotator Manşet Yaralanma Modelinin Geliştirilmesi

Rabbit rotator cuff (RC) pathophysiology can lead to progressive and highly degenerative changes in its associated musculature and tendons, which ...

Bu protokol, tavşanlarda kronik benzeri bir rotator manşet yaralanmasını indüklemek için karmaşık bir cerrahi teknik gösterir ve rotator manşet patogenezinin incelenmesinde ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesinde yararlıdır. Tavşanlar, insanlara benzer şekilde, lojistik olarak barındırılması, cerrahi olarak manipüle edilmesi ve yaralandığında yüksek düzeyde rotator manşet kası yağ dejenerasyonu göstermesi kolay orta ila büyük hayvan modelleridir. Burada gösterilen subskapularis yaralanma modeli, anatomik olarak en sık yaralanan rotator manşet ünitelerinden biri olan supraspinatus kemik tendon kas kompleksine benzer.Başlamak için, anestezi uygulanmış bir tavşanın amaçlanan insizyon bölgesini tıraş ederek cerrahi pencereyi hazırlayın. Pamuklu çubuklar kullanarak, alanı dairesel hareketlerle üç alternatif Betadine ve% 70 alkol uygulamasıyla temizleyin. Profilaktik bir anti-enfektif ajan olarak intramüsküler olarak kilogram başına 20 miligram sefaleksin uygulayın.Köprücük kemiğinden aşağı üç ila dört santimetrelik bir cilt kesisi yapın, deltopektoral aralığı bir makas kullanarak bölün ve omuza erişmek için geri çekin. Subskapularis kas tendon ünitesini bulmak için önce coracobrachialis kasını tanımlayın. Daha sonra subskapularis tendonunu tanımlayın ve humerusun daha az tüberozitesine yerleştirildiğinde tüm tendonu ortaya çıkarmak için dik açılı bir kelepçe yerleştirin.Subskapularis kas tendonunu izole edin. Ameliyat öncesi analjezik lokal olarak transeksiyon bölgesinin yakınında uygulandıktan sonra, çevre dokulara istenmeyen yapışmayı önlemek ve sonraki doku alımına yardımcı olmak için subskapularis kas tendon ünitesini silikon bazlı penrose tüpüne sarın. Yaralanmaya neden olmak için, 11 numaralı cerrahi neşter kullanarak kas tendon kavşağında tam kalınlıkta bir transeksiyon oluşturun.Gerektiğinde, bir parça gazlı bezle baskı uygulayarak kanamayı durdurun ve gerektiğinde yarayı sulamak için tuzlu su kullanın. Yarayı kapatmak için, deltoid kas dokusunu yeniden yaklaştırmak için 4-0 poliglikolik asit sütür ve cilt yarasını kapatmak için 4-0 naylon veya ipek sütür kullanın, ardından yara temizliği yapın. Ameliyattan hemen sonra bir kez ve sonraki 48 saat boyunca günde iki kez analjezik olarak deri altına kilogram buprenorfin başına 0.03 miligram uygulayın.Dört haftalık kronik benzeri rotator manşet yaralanma modelinin histolojik analizi bu şekilde gösterilmiştir. H&E boyaması, kontrol grubuna göre yaralı subskapularis kaslarında çok sayıda adiposit ile değiştirilen kas hücreselliği ve organizasyonunun kaybını doğruladı. Yaralı kas yağ birikim yüzdesinin nicelleştirilmesi bu şekilde sunulmuştur.Masson'un trikrom boyaması, kontrol grubuna göre yaralı subskapularis kaslarında kas atrofisi ve düzensiz kollajen lifi düzenlemelerini de doğruladı. Kas ve fibrotik doku oranının ölçülmesi bu şekilde gösterilmiştir. Değerlendirme, kontrol grubuna göre yaralı subskapularis kasları için kas hücreselliğinde bir azalma olduğunu gösterdi.Yaralı subskapularis kaslarında da yüksek derecede fibroz gözlendi. Subskapularis tendonunun tanımlanması ve subskapularis kas tendon ünitesinin penrose tüpüne sarılması bu işlemin en önemli adımlarıdır. Bu işlemi takiben terapötik bir müdahale uygulanabilir.Bu durumda, burada açıklanan analizler, ek miyografi veya yürüme analizi ile birlikte müdahale sonucunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik, rotator manşet patofizyolojisi çalışmasında araştırmacılara yardımcı olmak ve kas tendon onarımı ve rejenerasyonu için yeni terapötiklerin geliştirilmesini kolaylaştırmak için çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...