Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke T. Pond, forskningsstøttespecialist ved Institut for Kemiteknik ved Pennsylvania State University (Penn State), Nanofabrication Lab-personalet i Penn State og Dr. J. de Rutte fra Partillion Bioscience for hjælp og diskussion vedrørende nanofabrikationsprocesser. A. Sheikhi anerkender støtten fra Materials Research Institute (MRI) og College of Engineering Materials Matter at the Human Level frøtilskud, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) og Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program og opstartsfonden fra Penn State. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist støttet af National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) af National Institutes of Health (NIH) under tildelingsnummer R56EB032672.

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, instrumenter og reagenser, der anvendes i denne protokol.
1. GelMA syntese
BEMÆRK: GelMA-syntese skal udføres i en kemisk damphætte, og korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) skal bruges hele tiden.
<ol><li>Der tilsættes 200 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS, 1x) til en Erlenmeyerkolbe, og opløsningen opvarmes, indtil den når 50 °C. Dæk...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

Gelatine og dets derivater er de mest almindeligt anvendte proteinbaserede biomaterialer til HMP-fremstilling. Udfordringen med afvejning af gennemstrømning versus partikelstørrelsesmonodispersitet kan overvindes ved hjælp af mikrofluidiske enheder med trinemulgering. Disse enheder er i stand til at danne mere end 40 millioner dråber i timen med en variationskoefficient mindre end 5%27. I denne artikel diskuterede vi mikrofabrikation af dråber indeholdende GelMA-opløsninger efterfulgt af kon...

Montering af HMP-byggesten til dannelse af vævstekniske stilladser har fået enorm opmærksomhed i de sidste par år1. GHS, fremstillet via HMP-samling, har unikke egenskaber sammenlignet med deres bulkmodstykker, herunder mikroporøsitet i celleskala, der stammer fra de tomme rum blandt de diskrete byggesten. Yderligere egenskaber, såsom injicerbarhed, modularitet og afkoblet stivhed fra porøsitet, gør GHS til en lovende platform til forbedring af vævsreparation og regenerering2. Forskellige biomaterialer er blevet anvendt til GHS-fremstilling, herunder syntetiske PEG-baserede polymerer3,4 og polysaccharider, såsom alginat5 og hyaluronsyre 6,7. Blandt naturligt afledte polymerer er den mest almindelige proteinbaserede biopolymer til GHS-fremstilling GelMA 8,9,10,11, et tværbundet, biokompatibelt, bioklæbende og biologisk nedbrydeligt biomateriale 12,13.
HMP'er kan fremstilles via batchemulgering8, flowfokusering 14,15 eller trinemulgering9,11 mikrofluidiske enheder, blanding 16 eller kompleks koacervation17,18. Normalt er der en afvejning mellem fabrikationsgennemstrømningen og HMP-monodispersiteten. For eksempel giver blandingsteknikken uregelmæssigt formede og stærkt polydispergerede HMP'er. Batchemulgering eller kompleks koacervation muliggør produktion af store mængder polydispergerede sfæriske HMP'er. Flowfokuserende mikrofluidiske enheder er blevet brugt til at fremstille stærkt monodispergerede dråber med en variationskoefficient på <5%, men gennemstrømningen er signifikant lav. I mikrofluidiske enheder med trinemulgering muliggør de stærkt paralleliserede trin fremstilling med høj kapacitet af monodispergerede HMP'er19.
Methacryloyl-modificeret gelatine (GelMA) HMP-byggesten er termoresponsive og (foto)kemisk tværbindbare, hvilket muliggør let GHS-fabrikation20. Efter afkøling under den øvre kritiske opløsningstemperatur (UCST)21 (f.eks. ved 4 °C) omdannes dråber indeholdende en GelMA-opløsning til fysisk tværbundne HMP'er. Disse HMP-byggesten pakkes derefter ved hjælp af eksterne kræfter (f.eks. Via centrifugering) for at give fastklemte mikrogelsuspensioner. Interpartikelforbindelser etableres mellem tilstødende HMP'er via (foto)kemisk tværbinding for at danne mekanisk robust GHS14. En af de vigtigste egenskaber ved GHS er mikroporøsitet, der muliggør let cellepenetration in vitro11 og forbedret vævsindvækst in vivo22. Tredimensionel (3D) bioprint af HMP'er udføres konventionelt ved hjælp af tæt pakkede mikrogelsuspensioner, hvilket kompromitterer mikroporøsiteten23.
Vi har for nylig udviklet en ny klasse af granulære bioblæk baseret på grænsefladenanoengineering af GelMA-mikrogeler via adsorption af heterogent ladede nanopartikler efterfulgt af nanopartikelreversibel selvsamling. Denne strategi gør løst pakkede mikrogeler forskydningsgivende og ekstrudering 3D bioprintbare, hvilket bevarer mikroskalaporøsiteten af additivt fremstillet GHS11. Denne artikel præsenterer metoderne til high-throughput GelMA dråbefabrikation, konvertering af disse dråber til fysisk tværbundne HMP'er, fremstilling af GelMA HMP'er ved hjælp af resuspenderbart pulver, GelMA GHS-dannelse, GelMA nanoengineered granulær bioink (NGB) forberedelse og 3D-bioprint.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

Fremkomsten af granulære hydrogelstilladser (GHS), fremstillet via samling af hydrogelmikropartikler (HMP'er), har muliggjort mikroporøs stilladsdannelse in situ. I modsætning til konventionelle bulkhydrogeler letter sammenkoblede mikroskalaporer i GHS nedbrydningsuafhængig celleinfiltration samt overførsel af ilt, næringsstoffer og cellulære biprodukter. Methacryloylmodificeret gelatine (GelMA), en (foto)kemisk tværbindbar, proteinbaseret biopolymer indeholdende celleklæbemiddel og biologisk nedbrydelige dele, er i vid udstrækning blevet anvendt som et celleresponsivt/instruktivt biomateriale. Konvertering af bulk GelMA til GHS kan åbne en overflod af muligheder for vævsteknik og regenerering. I denne artikel demonstrerer vi procedurerne for GelMA-mikrogelfremstilling med høj kapacitet, konvertering til resuspenderbare tørre mikrogeler (mikroaerogeler), GHS-dannelse via kemisk samling af mikrogeler og granulær bioblækfabrikation til ekstruderingsbioprint. Vi viser, hvordan en sekventiel fysisk-kemisk behandling via køling og fototværbinding muliggør dannelsen af mekanisk robust GHS. Når lys er utilgængeligt (f.eks. under dyb vævsinjektion), kan individuelt tværbundne GelMA HMP'er samles bioortogonalt via enzymatisk tværbinding ved hjælp af transglutaminaser. Endelig demonstreres tredimensionel (3D) bioprint af mikroporøs GHS ved lav HMP-pakningstæthed via grænseflade-selvsamling af heterogent ladede nanopartikler.

GelMA blev syntetiseret gennem reaktionen af gelatine med MA, som præsenteret i figur 1A. Ved at skræddersy reaktionsbetingelserne, såsom MA-koncentration, blev der opnået forskellige grader af MA-substitution. For at kvantificere graden af MA-substitution blev GelMA vurderet via 1H NMR-spektroskopi (figur 1B). Vinylfunktionelle grupper med repræsentative toppe ved de kemiske skift på ~ 5-6 ppm bekræftede den vellykkede GelMA-syntese f...

Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Denne artikel beskriver protokoller til gelatine-methacryloyl-mikrogelfremstilling med høj kapacitet ved hjælp af mikrofluidiske enheder, konvertering af mikrogeler til resuspenderbart pulver (mikroaerogeler), den kemiske samling af mikrogeler til dannelse af granulære hydrogelstilladser og udvikling af granulært hydrogelbioblæk med bevaret mikroporøsitet til 3D-bioprint.

Gelatine methacryloyl granulære hydrogelstilladser: Mikrogelfabrikation med høj kapacitet, frysetørring, kemisk samling og 3D-bioprint

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Ekstracellulære matrix- eller ECM-numeriske hydrogelmikropartikler kan anvendes som byggesten til fremstilling af stilladser. Denne protokol demonstrerer fremstilling, oprensning, frysetørring, fotosamling og 3D-bioprint af gelatinemethacryloyl eller GelMA hydrogelmikropartikler. GelMA er en fotokemisk, tværbindbar, proteinbaseret biopolymer indeholdende celleklæbemiddel og biologisk nedbrydelige dele, der har været meget udbredt som et celleresponsivt og lærerigt biomateriale.Sammenlignet med konventionel bulkhydrogel er GelMA granulære hydrogelstilladser mikroporøse, hvilket muliggør hurtig celleinfiltration, der kan skræddersys efter byggestenens størrelse. GelMA granulære hydrogelstilladser kan åbne nye muligheder for 3D-bioprint af tykt væv, organer og sygdomme på billige platforme og regenerativ teknik. Til at begynde med tilsættes 10 milligram LAP til 10 ml DPBS for at forberede en 0,1% fotoinitiatoropløsning.Beskyt opløsningen mod lys ved at pakke den ind med aluminiumsfolie, og mærk den. Derefter opløses den ønskede mængde GelMA i fotoinitiatoropløsningen. Anbring den aluminiumsfolieindpakkede opløsning i ovnen med 37 grader Celsius i en time for at få en klar opløsning.For at forberede oliefasen fremstilles en 2% biokompatibel overfladeaktiv opløsning i ingeniørvæsken. Indsæt Tygon-slangen i PDMS-enhedens indløb og udløb, og indsæt derefter en 25-gauge stump nål i den anden ende af Tygon-slangen til indløb. Placer enheden under mikroskopet, og hold miljøet varmt ved ca. 40 grader Celsius ved hjælp af en hårtørrer eller en rumvarmer.Læg de vandige opløsninger og olieopløsningerne i separate sprøjter, der er tilsluttet enheden. Start sprøjtepumpen til oliefasen med en strømningshastighed på 160 mikroliter pr. Minut. Når olie har fyldt kanalen, skal du starte den vandige fase ved 80 mikroliter pr. Minut.Kontroller dråbedannelsen under mikroskopet. Saml dråberne i en beholder, og evaluer dem i billeddannelseskammeret ved optisk mikroskopibilleddannelse. Hold dråberne ved fire grader Celsius natten over, mens du beskytter dem mod lys for at starte GelMA mikrogelens fysiske tværbinding og omdanne dråberne til stabile mikrogeler.For at implementere den mikrokonstruerede emulsion-til-pulver, MEtoP, metode, indsamle de fysisk tværbundne mikrogeler i ingeniørvæsken ved hjælp af termisk holdbare mikrocentrifugerør eller kryoialer. Forsegl det åbne rør med en laboratorieserviet og tape. Dybfrys de fysisk tværbundne mikrogeler i flydende nitrogen i 10 minutter for at fortsætte med frysetørring.Efter frysetørring opnås et fast pulver. Tilsæt en milliliter afkølet, 0,1% fotoinitiatoropløsning ved fire grader Celsius til det frysetørrede pulver for at fremstille mikrogelsuspensioner. Centrifuger den hvirvelformede blanding ved 3.000 g i 15 sekunder.Efter kassering af supernatanten overføres den pakkede mikrogelsuspension til en form ved hjælp af en positiv fortrængningspipette og udsættes for lys ved 400 nanometer bølgelængde med en intensitet på 15 milliwatt pr. kvadratcentimeter i 60 sekunder for at danne granulære hydrogelstilladser eller GHS. Til 400 mikroliter mikrogelsuspension tilsættes en tilsvarende mængde iskold PFO-opløsning, 20% i ingeniørvæske til de fysisk tværbundne GelMA-mikrogeler. Derefter centrifugeres hvirvelblandingen ved 300 g i 15 sekunder, og oliefasen fjernes fra GelMA-mikrogelerne ved pipettering.Derefter tilsættes 400 mikroliter iskold 0,1% fotoinitiatoropløsning til mikrogelsuspensionen. Efter centrifugering af hvirvelopløsningen ved 300 g i 15 sekunder kasseres olien. Gentag trinnene med tilsætning af fotoinitiatoropløsning og centrifugering, men centrifuger ved 3.000 g denne gang og kassér supernatanten af pakkede GelMA-mikrogeler.Overfør de pakkede GelMA-mikrogeler til en form, efterfulgt af lyseksponering for at danne GHS. Tilsæt 100 milligram nanoplatelet pulver til tre milliliter iskoldt, ultrarent vand for at danne en 3.33% nanopartikel dispersion. Vortex dispersionen kraftigt inde i et køleskab på fire grader Celsius i 15 minutter for at eksfoliere de aggregerede nanopartikler.Korrekt eksfolierede nanopartikler giver en klar spredning. Opløs 50 mg LAP i fem ml iskoldt, ultrarent vand for at forberede en 1% fotoinitiatorstamopløsning. Derefter tilsættes 333 mikroliter 1% fotoinitiatoropløsning til den eksfolierede nanopartikeldispersion, og pakk den ind i aluminiumsfolie for at beskytte mod det omgivende lys.Vortex blandingen i et minut for at blande nanopartikeldispersionen og fotoinitiatoren. Tilføj iskold PFO, 20% i ingeniørvæske til de fysisk tværbundne GelMA-mikrogeler i et en-til-en-volumenforhold. Efter centrifugering af hvirvelblandingen ved 300 g i 15 sekunder kasseres oliefasen indeholdende det overfladeaktive stof.Tilsæt den iskolde, LAP-supplerede nanopartikeldispersion til de vaskede GelMA-mikrogeler. Efter centrifugering ved 3.000 g i 15 sekunder kasseres den resterende bundolie og supernatantdispersionen. Opbevar suspensionen ved fire grader Celsius, mens den beskyttes mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie i en dag for at give produktet GelMA nanoengineered granulært bioblæk eller NGB.Den følgende dag lægges NGB i en sprøjte på tre milliliter. Forsegl den fyldte sprøjte med en hætte og parafilm, og lav en pulscentrifugering ved 200 g for at fjerne den fangede luft. Overfør bioblækket til en tre-milliliters patron ved hjælp af et hun-hun Luer-låsestik.Centrifuger cylinderampullen kortvarigt ved 200 g igen for at fjerne den indespærrede luft, og hold NGB ved fire grader Celsius før brug. Derefter lægges den tilberedte murine fibroblastcellesuspension i en sprøjte på tre milliliter. Kombiner NGB og de cellefyldte sprøjter ved hjælp af et Luer-låsestik mellem hun og hun, og bland indholdet forsigtigt ved at skubbe frem og tilbage 40 gange.Udskriv NGB eller cellebelastet NGB ved hjælp af en ordentlig bioprinter med en standard konisk dyse ved at lægge dysen i tre-milliliter skrivehovedet. Hold printlejetemperaturen under 10 grader Celsius, og optimer parametre som hastighed og modtryk. Vælg den ønskelige gcode- eller STL-fil.Vælg derefter substratet og dysetypen til en pneumatisk tre-milliliter sprøjte udstyret med en standard konisk dyse. Kalibrer bioprinteren ved hjælp af enhedens retningslinjer, og start udskrivningen for at få 3D-strukturerne. MEtoP-teknologien gav resuspenderbart tørret mikrogelpulver ved frysetørring ved lavt tryk, samtidig med at mikrogelerne blev beskyttet mod aggregering og alvorlig deformation.SEM-billederne viste, at de tørrede GelMA-mikropartikler ved hjælp af denne teknologi bevarer deres sfæriske form efter frysetørring sammenlignet med aggregeringen observeret med konventionel frysetørring. Mikroporekarakteriseringen af GelMA, GHS og NGB med et fluorescensfarvestof med høj molekylvægt viste de sammenkoblede mikroskala tomrum. Også fluorescensbilledet vurderet ved hjælp af et specialskrevet MATLAB-script detekterede porerne.Målingerne af tomrumsfraktionen og medianporeækvivalenten viste ingen signifikant forskel, hvilket attesterer tilgængeligheden og sammenkoblingen af mikroskalaporer i de 3D-printede stilladser ved hjælp af NGB. NGB-stilladsets overlegenhed i forhold til tæt og løst pakkede GelMA-mikrogeler ved måling af hængende filamentlængde afslørede, at NGB havde en større længde end de pakkede mikrogeler. De løst pakkede mikrogeler gav ikke filamenter.En hul cylinder blev 3D-printet, og hele konstruktionen blev udsat for lys til fototværbinding. Den trykte struktur blev fysisk holdt for at vise formen, troskaben og den strukturelle integritet. Hvis stilladset bruges til biologisk vurdering, for eksempel i cellebelastet bioprint, skal du huske at udføre alle trin under visse betingelser under det biologiske sikkerhedsskab.Vi håber at afmarkedsføre brugen af granulære hydrogelstilladser som en nyligt opstået biomaterialeplatform inden for biomedicin.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel stillads til Artikulære chondrocyt Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstruerer Ved hjælp af en Tissue-specifik Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting af brusk og huden væv analoger udnytter en roman passiv blanding enhed teknik for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable calciumalginat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemer fremkalde celle klumpformet dannelse

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stilladser

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller af 3D Bioprinting af gelatine Methacryloyl hydrogel baserede Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Forberedelse og karakterisering af grafenbaseret 3D biohybrid hydrogel bioink til perifer neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Indbyrdes forbundne makroporøse 3D-stilladser fra Microgel-stænger

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Syntese af stærk klæbemiddelhydrogel, gelatine O-nitrosobenzaldehyd

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

Agarosevæskegeler dannet ved forskydningsbehandling under gelering til suspenderet 3D-bioprint

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...