Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

De auteurs willen T. Pond, onderzoeksondersteuningsspecialist bij de afdeling Chemical Engineering van de Pennsylvania State University (Penn State), de medewerkers van het Nanofabrication Lab van Penn State en Dr. J. de Rutte van Partillion Bioscience bedanken voor de hulp en discussie over nanofabricageprocessen. A. Sheikhi erkent de steun van het Materials Research Institute (MRI) en het College of Engineering Materials Matter at the Human Level seed grants, het Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) en het Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program en het startup-fonds van Penn State. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) van de National Institutes of Health (NIH) onder toekenningsnummer R56EB032672.

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
1. GelMA synthese
OPMERKING: GelMA-synthese moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) moeten altijd worden gebruikt.
<ol><li>Voeg 200 ml dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS, 1x) toe aan een erlenmeyer en verwarm ...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

Gelatine en zijn derivaten zijn de meest gebruikte biomaterialen op basis van eiwitten voor HMP-fabricage. De uitdaging van doorvoer versus deeltjesgrootte monodispersiteit trade-off kan worden overwonnen met behulp van stap-emulsificatie microfluïdische apparaten. Deze apparaten zijn in staat om meer dan 40 miljoen druppels per uur te vormen, met een variatiecoëfficiënt van minder dan 5%27. In dit artikel bespraken we de microfabricage van druppels die GelMA-oplossingen bevatten, gevolgd door ...

Het assembleren van HMP-bouwstenen om tissue engineering-steigers te vormen heeft de afgelopen jaren enorm veel aandacht gekregen1. GHS, vervaardigd via HMP-assemblage, heeft unieke eigenschappen in vergelijking met hun bulktegenhangers, waaronder microporositeit op celschaal afkomstig van de lege ruimtes tussen de discrete bouwstenen. Bijkomende eigenschappen, zoals injecteerbaarheid, modulariteit en ontkoppelde stijfheid van porositeit, maken GHS een veelbelovend platform om weefselherstel en regeneratie te verbeteren2. Verschillende biomaterialen zijn gebruikt voor ghs-fabricage, waaronder synthetische peg-gebaseerde polymeren3,4 en polysacchariden, zoals alginaat5 en hyaluronzuur 6,7. Onder natuurlijk afgeleide polymeren is het meest voorkomende op eiwitten gebaseerde biopolymeer voor GHS-fabricage GelMA 8,9,10,11, een crosslinkable, biocompatibele, bioadhesieve en biologisch afbreekbare biomateriaal 12,13.
HMP's kunnen worden vervaardigd via batch-emulsificatie8, stroomfocussen 14,15 of stap-emulgering9,11 microfluïdische apparaten, blending 16 of complexe coacervatie17,18. Meestal is er een afweging tussen de fabricagedoorvoer en HMP-monodispersiteit. De mengtechniek levert bijvoorbeeld onregelmatig gevormde en sterk gepolydisperseerde HMP's op. Batchemulgering of complexe coacervatie maakt de productie van grote volumes polydispersed bolvormige HMP's mogelijk. Stroomgerichte microfluïdische apparaten zijn gebruikt om sterk monodisperse druppels te fabriceren met een variatiecoëfficiënt van <5%, maar de doorvoer is aanzienlijk laag. In microfluïdische apparaten met stap-emulsificatie maken de sterk geparallelliseerde stappen de high-throughput fabricage van monodispersed HMP'smogelijk 19.
Methacryloyl-gemodificeerde gelatine (GelMA) HMP-bouwstenen zijn thermoresponsief en (foto)chemisch verknoopbaar, waardoor gemakkelijke GHS-fabricage mogelijk is20. Bij afkoeling onder de temperatuur van de bovenste kritische oplossing (UCST)21 (bv. bij 4 °C) worden druppels die een GelMA-oplossing bevatten, omgezet in fysiek verknoopte HMP's. Deze HMP-bouwstenen worden vervolgens verpakt met behulp van externe krachten (bijvoorbeeld via centrifugatie) om vastgelopen microgel-suspensies te verkrijgen. Tussendeeltjeskoppelingen worden via (foto)chemische crosslinking tussen aangrenzende HMP's tot stand gebracht om mechanisch robuust GHS14 te vormen. Een van de belangrijkste eigenschappen van GHS is microporositeit, waardoor gemakkelijke celpenetratie in vitro11 en verbeterde weefselingroei in vivo22 mogelijk is. Driedimensionaal (3D) bioprinten van HMP's wordt conventioneel uitgevoerd met behulp van dicht opeengepakte microgel-suspensies, waardoor de microporositeit23 in het gedrang komt.
We hebben onlangs een nieuwe klasse van granulaire bioinks ontwikkeld op basis van de interfaciale nano-engineering van GelMA-microgels via de adsorptie van heterogeen geladen nanodeeltjes, gevolgd door nanodeeltjes reversibele zelfassemblage. Deze strategie maakt los verpakte microgels afschuif- en extrusie-3D-bioprintbaar, waardoor de porositeit op microschaal van additief vervaardigd GHS11 behouden blijft. Dit artikel presenteert de methoden voor high-throughput GelMA-druppelfabricage, het omzetten van deze druppels in fysiek gekruiste HMP's, het fabriceren van GelMA HMP's met behulp van reusbaar poeder, GelMA GHS-formatie, GelMA nanoengineered granular bioink (NGB) -voorbereiding en 3D-bioprinting.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

De opkomst van granulaire hydrogelsteigers (GHS), vervaardigd via het assembleren van hydrogelmicrodeeltjes (HMP's), heeft microporeuze steigervorming in situ mogelijk gemaakt. In tegenstelling tot conventionele bulkhydrogels, vergemakkelijken onderling verbonden poriën op microschaal in GHS degradatie-onafhankelijke celinfiltratie en overdracht van zuurstof, voedingsstoffen en cellulaire bijproducten. Methacryloyl-gemodificeerde gelatine (GelMA), een (foto)chemisch crosslinkable, op eiwitten gebaseerd biopolymeer dat cellijm en biologisch afbreekbare stoffen bevat, is op grote schaal gebruikt als een celresponsief / instructief biomateriaal. Het omzetten van bulk GelMA naar GHS kan een overvloed aan mogelijkheden bieden voor tissue engineering en regeneratie. In dit artikel demonstreren we de procedures van high-throughput GelMA microgel fabricage, conversie naar resususdable droge microgels (micro-aerogels), GHS-vorming via de chemische assemblage van microgels en granulaire bioinkfabricage voor extrusie bioprinting. We laten zien hoe een sequentiële fysisch-chemische behandeling via koeling en fotocrosslinking de vorming van mechanisch robuust GHS mogelijk maakt. Wanneer licht ontoegankelijk is (bijvoorbeeld tijdens diepe weefselinjectie), kunnen individueel verknoopte GelMA HMP's bioorthogonaal worden geassembleerd via enzymatische crosslinking met behulp van transglutaminasen. Ten slotte wordt driedimensionaal (3D) bioprinten van microporeus GHS bij lage HMP-verpakkingsdichtheid gedemonstreerd via de interfaciale zelfassemblage van heterogeen geladen nanodeeltjes.

GelMA werd gesynthetiseerd door de reactie van gelatine met MA, zoals weergegeven in figuur 1A. Door de reactiecondities, zoals MA-concentratie, aan te passen, werden verschillende gradaties van MA-substitutie verkregen. Om de mate van MA-substitutie te kwantificeren, werd GelMA beoordeeld via 1H NMR-spectroscopie (figuur 1B). Vinyl functionele groepen met representatieve pieken bij de chemische verschuivingen van ~5-6 ppm bevestigden de succ...

Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Dit artikel beschrijft protocollen voor high-throughput gelatine methacryloyl microgel fabricage met behulp van microfluïdische apparaten, het omzetten van microgels in resususpensable poeder (micro-aerogels), de chemische assemblage van microgels om granulaire hydrogel scaffolds te vormen, en het ontwikkelen van granulaire hydrogel bioinks met behoud van microporositeit voor 3D bioprinting.

Gelatine Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, en 3D Bioprinting

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Extracellulaire matrix of ECM numerieke hydrogel microdeeltjes kunnen worden gebruikt als de bouwstenen voor steigerfabricage. Dit protocol demonstreert de fabricage, zuivering, lyofilisatie, fotoassemblage en 3D-bioprinting van gelatinemethacryloyl of GelMA-hydrogelmicrodeeltjes. GelMA is een fotochemisch, crosslinkable, op eiwitten gebaseerd biopolymeer dat cellijm en biologisch afbreekbare stoffen bevat en dat op grote schaal is gebruikt als een celresponsief en leerzaam biomateriaal.In vergelijking met conventionele bulkhydrogel zijn GelMA granulaire hydrogelsteigers microporeus, waardoor snelle celinfiltratie mogelijk is die kan worden aangepast aan de grootte van de bouwsteen. GelMA granulaire hydrogel steigers kunnen nieuwe mogelijkheden bieden voor het 3D bioprinten van dikke weefsels, organen en ziekten op goedkope platforms en regeneratieve engineering. Voeg om te beginnen 10 milligram LAP toe aan 10 milliliter DPBS om een 0,1% foto-initiatoroplossing te bereiden.Bescherm de oplossing tegen licht door deze in te pakken met aluminiumfolie en te labelen. Los vervolgens de gewenste hoeveelheid GelMA op in de foto-initiatoroplossing. Plaats de met aluminiumfolie omwikkelde oplossing een uur in de oven van 37 graden Celsius om een heldere oplossing te krijgen.Om de oliefase voor te bereiden, maakt u een 2% biocompatibele oppervlakteactieve oplossing in de technische vloeistof. Plaats de Tygon-slang in de inlaten en uitlaat van het PDMS-apparaat en steek vervolgens een 25-gauge stompe naald in het andere uiteinde van de Tygon-buis voor inlaten. Plaats het apparaat onder de microscoop en houd de omgeving warm bij ongeveer 40 graden Celsius met behulp van een haardroger of een ruimteverwarming.Laad de waterige en olie-oplossingen in afzonderlijke spuiten die op het apparaat zijn aangesloten. Start de spuitpomp voor de oliefase met een debiet van 160 microliter per minuut. Nadat olie het kanaal heeft gevuld, start u de waterige fase met 80 microliter per minuut.Controleer de druppelvorming onder de microscoop. Verzamel de druppels in een container en evalueer ze in de beeldvormingskamer door optische microscopiebeeldvorming. Houd de druppels een nacht op vier graden Celsius terwijl ze worden beschermd tegen licht om de fysieke crosslinking van GelMA microgel te initiëren en de druppels om te zetten in stabiele microgels.Om de microengineered emulsie-naar-poeder, MEtoP, methode te implementeren, verzamelt u de fysiek verknoopte microgels in de technische vloeistof met behulp van thermisch duurzame microcentrifugebuizen of cryovials. Sluit de open buis af met een laboratoriumdoekje en tape. Vries de fysiek verknoopte microgels in vloeibare stikstof gedurende 10 minuten in om door te gaan met lyofilisatie.Na lyofilisatie wordt een vast poeder verkregen. Voeg een milliliter gekoelde, 0,1% foto-initiatoroplossing bij vier graden Celsius toe aan het gelyofiliseerde poeder om microgelsuspensies te maken. Centrifugeer het vortexed mengsel op 3.000g gedurende 15 seconden.Nadat u het supernatant hebt weggegooid, brengt u de verpakte microgelsuspensie over naar een mal met behulp van een pipet met positieve verplaatsing en stelt u deze gedurende 60 seconden bloot aan licht op een golflengte van 400 nanometer met een intensiteit van 15 milliwatt per vierkante centimeter om korrelige hydrogelsteigers of GHS te vormen. Voeg voor 400 microliter microgelsuspensie een gelijke hoeveelheid ijskoude PFO-oplossing, 20% in technische vloeistof, toe aan de fysiek verknoopte GelMA-microgels. Centrifugeer vervolgens het vortexed mengsel op 300 g gedurende 15 seconden en verwijder de oliefase uit de GelMA-microgels door pipetteren.Voeg vervolgens 400 microliter ijskoude, 0,1% foto-initiatoroplossing toe aan de microgelsuspensie. Nadat u de vortexoplossing gedurende 15 seconden op 300 g hebt gecentrifugeerd, gooit u de olie weg. Herhaal de stappen van toevoeging van de foto-initiatoroplossing en centrifugatie, maar centrifugeer deze keer op 3.000 g en gooi het supernatant van verpakte GelMA-microgels weg.Breng de verpakte GelMA-microgels over in een mal, gevolgd door blootstelling aan licht om het GHS te vormen. Voeg 100 milligram nanoplaatjespoeder toe aan drie milliliter ijskoud, ultrazuiver water om een nanodeeltjesdispersie van 3,33% te vormen. Draai de dispersie krachtig in een koelkast van vier graden Celsius gedurende 15 minuten om de geaggregeerde nanodeeltjes te exfoliëren.Goed geëxfolieerde nanodeeltjes leveren een duidelijke dispersie op. Los 50 milligram LAP op in vijf milliliter ijskoud, ultrazuiver water om een 1% foto-initiator stockoplossing te bereiden. Voeg vervolgens 333 microliter 1% foto-initiatoroplossing toe aan de geëxfolieerde nanodeeltjesdispersie en wikkel deze in aluminiumfolie om te beschermen tegen het omgevingslicht.Draai het mengsel gedurende één minuut om de dispersie van nanodeeltjes en de foto-initiator te mengen. Voeg ijskoude PFO, 20% in technische vloeistof, toe aan de fysiek verknoopte GelMA-microgels met een één-op-één volumeverhouding. Nadat u het vortexmengsel gedurende 15 seconden bij 300 g hebt gecentrifugeerd, gooit u de oliefase met de oppervlakteactieve stof weg.Voeg de ijskoude, lap-aangevulde nanodeeltjesdispersie toe aan de gewassen GelMA-microgels. Na het centrifugeren op 3.000 g gedurende 15 seconden, gooit u de resterende olie op de bodem en de supernatantdispersie weg. Bewaar de suspensie bij vier graden Celsius terwijl u deze beschermt tegen licht met aluminiumfolie gedurende één dag om het product GelMA nanoengineered granular bioink of NGB te produceren.Laad de volgende dag de NGB in een spuit van drie milliliter. Sluit de geladen spuit af met een dop en parafilm en voer een pulscentrifugatie uit bij 200 g om de ingesloten lucht te verwijderen. Breng de bioink over naar een cartridge van drie milliliter met behulp van een vrouwelijke-vrouwelijke Luer-vergrendelingsconnector.Centrifugeer de cartridge nogmaals kort op 200 g om de ingesloten lucht te verwijderen en houd de NGB voor gebruik op vier graden Celsius. Laad vervolgens de voorbereide murine fibroblast celsuspensie in een spuit van drie milliliter. Koppel de NGB en de met cellen geladen spuiten met behulp van een vrouwelijk-vrouwelijk Luer-slotconnector en meng de inhoud voorzichtig door 40 keer heen en weer te duwen.Print de NGB of met cellen beladen NGB met behulp van een goede bioprinter met een standaard conisch mondstuk door het mondstuk in de printkop van drie milliliter te laden. Houd de temperatuur van het printbed onder de 10 graden Celsius en optimaliseer parameters zoals snelheid en tegendruk. Selecteer het gewenste gcode- of STL-bestand.Selecteer vervolgens het substraat en het type mondstuk voor een pneumatische spuit van drie milliliter die is uitgerust met een standaard conisch mondstuk. Kalibreer de bioprinter met behulp van de apparaatrichtlijnen en begin met afdrukken om de 3D-structuren te verkrijgen. De MEtoP-technologie leverde oplosbaar gedroogd microgelpoeder door vriesdrogen onder lage druk en beschermde microgels tegen aggregatie en ernstige vervorming.De SEM-beelden toonden aan dat de gedroogde GelMA-microdeeltjes met behulp van deze technologie hun bolvorm behouden na lyofilisatie in vergelijking met de aggregatie waargenomen bij conventionele lyofilisatie. De microporiënkarakterisering van GelMA, GHS en NGB met een fluorescentiekleurstof met een hoog molecuulgewicht toonde de onderling verbonden lege ruimtes op microschaal. Ook detecteerde het fluorescentiebeeld dat werd beoordeeld met behulp van een op maat geschreven MATLAB-script de poriën.De metingen van de lege fractie en de mediane porie-equivalente diameter toonden geen significant verschil dat getuigt van de beschikbaarheid en interconnectiviteit van poriën op microschaal in de 3D-geprinte steigers met behulp van de NGB. De superioriteit van NGB-steigers ten opzichte van strak en los verpakte GelMA-microgels door de hangende filamentlengtemeting onthulde dat NGB een grotere lengte had dan de verpakte microgels. De los verpakte microgels leverden geen filamenten op.Een holle cilinder werd 3D-geprint en de hele constructie werd blootgesteld aan licht voor fotocrosslinking. De gedrukte structuur werd fysiek vastgehouden om de vorm, getrouwheid en structurele integriteit te tonen. Als de steiger wordt gebruikt voor biologische beoordeling, bijvoorbeeld bij met cellen beladen bioprinting, vergeet dan niet om alle stappen onder bepaalde omstandigheden uit te voeren, onder de biologische veiligheidskast.We hopen het gebruik van granulaire hydrogelsteigers als een nieuw ontwikkeld biomateriaalplatform in de biogeneeskunde op de markt te brengen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting van kraakbeen en huid weefsel analogen met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek voor Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D afgedrukt poreuze Cellulose nanocomposietmaterialen Hydrogel steigers

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Synthese van sterke kleefhydrogel, gelatine O-nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

Agarose vloeibare gels gevormd door afschuifverwerking tijdens gelation voor gesuspendeerde 3D-bioprinting

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...