Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Les auteurs aimeraient remercier T. Pond, spécialiste du soutien à la recherche au département de génie chimique de la Pennsylvania State University (Penn State), le personnel du laboratoire de nanofabrication de Penn State et le Dr J. de Rutte de Partillion Bioscience pour leur aide et leur discussion concernant les processus de nanofabrication. A. Sheikhi remercie le soutien du Materials Research Institute (MRI) et du College of Engineering Materials Matter at the Human Level Seed Grants, du Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) et du Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program, ainsi que du fonds de démarrage de Penn State. La recherche rapportée dans cette publication a été partiellement soutenue par le National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro d’attribution R56EB032672.

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.
1. Synthèse de GelMA
REMARQUE: La synthèse de GelMA doit être effectuée dans une hotte chimique et un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être utilisé tout le temps.
<ol><li>Ajouter 200 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS, 1x) ...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

La gélatine et ses dérivés sont les biomatériaux à base de protéines les plus couramment utilisés pour la fabrication de HMP. Le défi du compromis entre le débit et la monodispersité granulométrique peut être surmonté à l’aide de dispositifs microfluidiques à émulsification par étapes. Ces appareils sont capables de former plus de 40 millions de gouttelettes par heure, avec un coefficient de variation inférieur à 5%27. Dans cet article, nous avons discuté de la microfabricati...

L’assemblage de blocs de construction HMP pour former des échafaudages d’ingénierie tissulaire a suscité une attention considérable au cours des dernières années1. Les SGH, fabriqués par assemblage HMP, ont des propriétés uniques par rapport à leurs homologues en vrac, y compris la microporosité à l’échelle de la cellule provenant des espaces vides entre les blocs de construction discrets. Des propriétés supplémentaires, telles que l’injectabilité, la modularité et la rigidité découplée de la porosité, font de GHS une plate-forme prometteuse pour améliorer la réparation et la régénérationdes tissus 2. Différents biomatériaux ont été utilisés pour la fabrication du SGH, y compris les polymères synthétiques à base de PEG3,4 et les polysaccharides, tels que l’alginate5 et l’acide hyaluronique 6,7. Parmi les polymères d’origine naturelle, le biopolymère à base de protéines le plus courant pour la fabrication du SGH est le GelMA 8,9,10,11, un biomatériau réticulable, biocompatible, bioadhésif et biodégradable12,13.
Les HMP peuvent être fabriqués par émulsification discontinue8, focalisation en flux 14,15 ou émulsification par étapes9,11 par mélange, mélange 16, ou coacervation complexe 17,18. Habituellement, il y a un compromis entre le débit de fabrication et la monodispersité HMP. Par exemple, la technique de mélange donne des HMP de forme irrégulière et hautement polydispersées. L’émulsification discontinue ou la coacervation complexe permet la production de grands volumes de HMP sphériques polydispersés. Des dispositifs microfluidiques focalisant l’écoulement ont été utilisés pour fabriquer des gouttelettes hautement monodispersées avec un coefficient de variation de <5%, mais le débit est significativement faible. Dans les dispositifs microfluidiques à émulsification par étapes, les étapes hautement parallélisées permettent la fabrication à haut débit de HMP monodispersés19.
Les blocs de construction HMP de gélatine modifiée au méthacryloyl (GelMA) sont thermoréactifs et (photo)chimiquement réticulables, ce qui facilite la fabrication du SGH20. Lors du refroidissement en dessous de la température supérieure de la solution critique (UCST)21 (par exemple, à 4 °C), les gouttelettes contenant une solution GelMA sont converties en HMP physiquement réticulés. Ces blocs de construction HMP sont ensuite emballés en utilisant des forces externes (par exemple, par centrifugation) pour produire des suspensions de microgel coincées. Des liaisons interparticulaires sont établies entre les HMP adjacentes par réticulation (photo)chimique pour former le SGH14 mécaniquement robuste. L’une des propriétés les plus importantes du SGH est la microporosité, qui permet une pénétration cellulaire facile in vitro11 et une croissance tissulaire améliorée in vivo22. La bio-impression tridimensionnelle (3D) des HMP est classiquement réalisée à l’aide de suspensions de microgel serrées, compromettant la microporosité23.
Nous avons récemment développé une nouvelle classe de bio-encres granulaires basées sur la nano-ingénierie interfaciale des microgels GelMA via l’adsorption de nanoparticules chargées hétérogènement, suivie d’un auto-assemblage réversible de nanoparticules. Cette stratégie rend les microgels emballés en vrac bioimprimables en cisaillement et en extrusion 3D, ce qui préserve la porosité à l’échelle microscopique du GHS11 fabriqué de manière additive. Cet article présente les méthodes de fabrication de gouttelettes GelMA à haut débit, la conversion de ces gouttelettes en HMP physiquement réticulées, la fabrication de HMP GelMA à l’aide de poudre resuspension, la formation de GelMA GHS, la préparation de bioencre granulaire (NGB) nano-ingénierie GelMA et la bioimpression 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
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gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

L’émergence d’échafaudages d’hydrogel granulaires (SGH), fabriqués par assemblage de microparticules d’hydrogel (HMP), a permis la formation d’échafaudages microporeux in situ. Contrairement aux hydrogels en vrac conventionnels, les pores interconnectés à l’échelle microscopique du SGH facilitent l’infiltration cellulaire indépendante de la dégradation ainsi que le transfert d’oxygène, de nutriments et de sous-produits cellulaires. La gélatine modifiée par le méthacryloyl (GelMA), un biopolymère à base de protéines (photo)chimiquement réticulable contenant de l’adhésif cellulaire et des fractions biodégradables, a été largement utilisé comme biomatériau réactif aux cellules/instructif. La conversion de GelMA en vrac en GHS peut ouvrir une pléthore de possibilités pour l’ingénierie tissulaire et la régénération. Dans cet article, nous démontrons les procédures de fabrication de microgel GelMA à haut débit, de conversion en microgels secs resuspendables (micro-aérogels), de formation de SGH via l’assemblage chimique de microgels et de fabrication de bio-encre granulaire pour la bio-impression par extrusion. Nous montrons comment un traitement physico-chimique séquentiel par refroidissement et photoréticulation permet la formation d’un SGH mécaniquement robuste. Lorsque la lumière est inaccessible (par exemple, lors d’une injection de tissus profonds), les HMP GelMA réticulés individuellement peuvent être assemblés bioorthogonalement par réticulation enzymatique à l’aide de transglutaminases. Enfin, la bioimpression tridimensionnelle (3D) du SGH microporeux à faible densité de tassement HMP est démontrée par l’auto-assemblage interfacial de nanoparticules chargées hétérogènes.

GelMA a été synthétisé par la réaction de la gélatine avec l’AM, comme présenté à la figure 1A. En adaptant les conditions de réaction, telles que la concentration d’AM, différents degrés de substitution de MA ont été obtenus. Pour quantifier le degré de substitution de l’AM, GelMA a été évalué par spectroscopie RMN 1H (Figure 1B). Les groupes fonctionnels vinyliques avec des pics représentatifs aux changements chim...

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Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Cet article décrit les protocoles de fabrication de microgel méthacryloyl à haut débit à l’aide de dispositifs microfluidiques, la conversion de microgels en poudre resuspension (micro-aérogels), l’assemblage chimique de microgels pour former des échafaudages d’hydrogel granulaires et le développement de bio-encres d’hydrogel granulaires avec microporosité préservée pour la bio-impression 3D.

Échafaudages d’hydrogel granulaire méthacryloyl de gélatine : fabrication de microgel à haut débit, lyophilisation, assemblage chimique et bio-impression 3D

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

La matrice extracellulaire ou les microparticules d’hydrogel numérique ECM peuvent être utilisées comme éléments constitutifs pour la fabrication d’échafaudages. Ce protocole démontre la fabrication, la purification, la lyophilisation, l’assemblage de photos et la bioimpression 3D de microparticules de méthacryloyl de gélatine ou d’hydrogel GelMA. GelMA est un biopolymère photochimiquement, réticulable, à base de protéines contenant de l’adhésif cellulaire et des fractions biodégradables qui a été largement utilisé comme biomatériau instructif et sensible aux cellules.Par rapport à l’hydrogel en vrac conventionnel, les échafaudages d’hydrogel granulaire GelMA sont microporeux, permettant une infiltration cellulaire rapide qui peut être adaptée en fonction de la taille du bloc de construction. Les échafaudages d’hydrogel granulaire GelMA peuvent ouvrir de nouvelles opportunités pour la bio-impression 3D de tissus épais, d’organes et de maladies sur des plates-formes bon marché et l’ingénierie régénérative. Pour commencer, ajoutez 10 milligrammes de LAP à 10 millilitres de DPBS pour préparer une solution photoinitiatrice à 0,1%.Protégez la solution de la lumière en l’enveloppant de papier d’aluminium et étiquetez-la. Ensuite, dissoudre la quantité désirée de GelMA dans la solution photoinitiatrice. Placez la solution enveloppée de papier d’aluminium dans le four à 37 degrés Celsius pendant une heure pour obtenir une solution claire.Pour préparer la phase huileuse, fabriquer une solution tensioactive biocompatible à 2% dans le fluide technique. Insérez le tube Tygon dans les entrées et la sortie du dispositif PDMS, puis insérez une aiguille émoussée de calibre 25 à l’autre extrémité du tube Tygon pour les entrées. Placez l’appareil sous le microscope et gardez l’environnement chaud à environ 40 degrés Celsius à l’aide d’un sèche-cheveux ou d’un radiateur.Chargez les solutions aqueuse et huileuse dans des seringues séparées connectées à l’appareil. Démarrez la pompe à seringue pour la phase huileuse avec un débit de 160 microlitres par minute. Une fois que l’huile a rempli le canal, démarrez la phase aqueuse à 80 microlitres par minute.Vérifiez la formation de gouttelettes au microscope. Recueillir les gouttelettes dans un récipient et les évaluer dans la chambre d’imagerie par imagerie par microscopie optique. Gardez les gouttelettes à quatre degrés Celsius pendant la nuit tout en les protégeant de la lumière pour initier la réticulation physique du microgel GelMA et convertir les gouttelettes en microgels stables.Pour mettre en œuvre la méthode MEtoP (micro-ingénierie émulsion-poudre), collectez les microgels physiquement réticulés dans le fluide d’ingénierie à l’aide de tubes microcentrifuges ou de cryoflacons thermiquement durables. Scellez le tube ouvert avec une lingette de laboratoire et du ruban adhésif. Congeler les microgels physiquement réticulés dans de l’azote liquide pendant 10 minutes pour procéder à la lyophilisation.Après lyophilisation, une poudre solide sera obtenue. Ajouter un millilitre de solution photoinitiatrice refroidie à 0,1% à quatre degrés Celsius à la poudre lyophilisée pour obtenir des suspensions de microgel. Centrifuger le mélange vortex à 3 000 g pendant 15 secondes.Après avoir jeté le surnageant, transférer la suspension de microgel emballée dans un moule à l’aide d’une pipette à déplacement positif et l’exposer à la lumière à une longueur d’onde de 400 nanomètres avec une intensité de 15 milliwatts par centimètre carré pendant 60 secondes pour former des échafaudages d’hydrogel granulaires ou GHS. Pour 400 microlitres de suspension de microgel, ajoutez une quantité égale de solution de PFO glacée, 20% dans un fluide technique aux microgels GelMA physiquement réticulés. Ensuite, centrifuger le mélange vortex à 300g pendant 15 secondes, et retirer la phase huileuse des microgels GelMA par pipetage.Ajoutez ensuite 400 microlitres de solution photoinitiatrice glacée à 0,1% à la suspension de microgel. Après avoir centrifugé la solution vortée à 300g pendant 15 secondes, jeter l’huile. Répétez les étapes d’addition de solution photoinitiatrice et de centrifugation, mais centrifugez à 3 000 g cette fois et jetez le surnageant des microgels GelMA emballés.Transférer les microgels GelMA emballés dans un moule, puis une exposition à la lumière pour former le SGH. Ajouter 100 milligrammes de poudre de nanoplaquettes à trois millilitres d’eau glacée et ultra-pure pour former une dispersion de nanoparticules de 3,33%. Vortex la dispersion vigoureusement à l’intérieur d’un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour exfolier les nanoparticules agrégées.Des nanoparticules correctement exfoliées donnent une dispersion claire. Dissoudre 50 milligrammes de LAP dans cinq millilitres d’eau glacée ultra-pure pour préparer une solution mère photoinitiatrice à 1%. Ajoutez ensuite 333 microlitres de solution photoinitiatrice à 1% à la dispersion de nanoparticules exfoliées et enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière ambiante.Vortex le mélange pendant une minute pour mélanger la dispersion de nanoparticules et le photoinitiateur. Ajoutez du PFO glacé, 20% dans un fluide technique aux microgels GelMA physiquement réticulés à un rapport de volume de un pour un. Après avoir centrifugé le mélange vortex à 300g pendant 15 secondes, jeter la phase huileuse contenant le tensioactif.Ajoutez la dispersion de nanoparticules glacée supplémentée en LAP aux microgels GelMA lavés. Après centrifugation à 3 000 g pendant 15 secondes, jeter l’huile restante au fond et la dispersion surnageante. Conservez la suspension à quatre degrés Celsius tout en la protégeant de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium pendant une journée pour obtenir le produit GelMA nanoengineered granular bioink ou NGB.Le lendemain, chargez le NGB dans une seringue de trois millilitres. Scellez la seringue chargée avec un capuchon et un parafilm, et faites une centrifugation pulsée à 200 g pour éliminer l’air emprisonné. Transférez la bio-encre dans une cartouche de trois millilitres à l’aide d’un connecteur de verrouillage Luer femelle-femelle.Centrifuger brièvement la cartouche à 200 g pour éliminer l’air emprisonné et maintenir le NGB à quatre degrés Celsius avant utilisation. Ensuite, chargez la suspension de cellules de fibroblastes murins préparée dans une seringue de trois millilitres. Associez le NGB et les seringues chargées de cellules à l’aide d’un connecteur de verrouillage Luer femelle-femelle, et mélangez doucement le contenu en poussant d’avant en arrière 40 fois.Imprimez le NGB ou le NGB chargé de cellules à l’aide d’une bio-imprimante appropriée avec une buse conique standard en chargeant la buse dans la tête d’impression de trois millilitres. Maintenez la température du lit d’impression en dessous de 10 degrés Celsius et optimisez des paramètres tels que la vitesse et la contre-pression. Sélectionnez le fichier gcode ou STL souhaité.Sélectionnez ensuite le substrat et le type de buse pour une seringue pneumatique de trois millilitres équipée d’une buse conique standard. Calibrez la bioimprimante en utilisant les directives de l’appareil et commencez à imprimer pour obtenir les structures 3D. La technologie MEtoP a permis d’obtenir de la poudre de microgel séchée resuspension par lyophilisation à basse pression tout en protégeant les microgels de l’agrégation et des déformations sévères.Les images MEB ont montré que les microparticules GelMA séchées utilisant cette technologie conservent leur forme sphérique après lyophilisation par rapport à l’agrégation observée avec la lyophilisation conventionnelle. La caractérisation des micropores de GelMA, GHS et NGB avec un colorant de fluorescence de poids moléculaire élevé a montré les espaces vides à micro-échelle interconnectés. De plus, l’image de fluorescence évaluée à l’aide d’un script MATLAB personnalisé a détecté les pores.Les mesures de la fraction vide et du diamètre médian de l’équivalent des pores n’ont montré aucune différence significative attestant de la disponibilité et de l’interconnectivité des pores à l’échelle microscopique dans les échafaudages imprimés en 3D à l’aide du NGB. La supériorité des échafaudages NGB par rapport aux microgels GelMA emballés de manière serrée et lâche par la mesure de la longueur du filament suspendu a révélé que le NGB avait une longueur supérieure à celle des microgels emballés. Les microgels emballés en vrac n’ont pas produit de filaments.Un cylindre creux a été imprimé en 3D et l’ensemble de la construction a été exposé à la lumière pour la photoréticulation. La structure imprimée a été physiquement maintenue pour montrer la forme, la fidélité et l’intégrité structurelle. Si l’échafaudage est utilisé pour l’évaluation biologique, par exemple dans la bio-impression chargée de cellules, n’oubliez pas d’effectuer toutes les étapes sous certaines conditions, sous l’enceinte de sécurité biologique.Nous espérons décommercialiser l’utilisation d’échafaudages d’hydrogel granulaire en tant que plate-forme de biomatériaux nouvellement émergé en biomédecine.

Research

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Bioengineering

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