Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare T. Pond, specialista di supporto alla ricerca presso il Dipartimento di Ingegneria Chimica della Pennsylvania State University (Penn State), lo staff del Nanofabrication Lab della Penn State e il Dr. J. de Rutte di Partillion Bioscience per l'aiuto e la discussione sui processi di nanofabbricazione. A. Sheikhi riconosce il sostegno del Materials Research Institute (MRI) e del College of Engineering Materials Matter presso le sovvenzioni per le sementi a livello umano, il Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) e il Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program e il fondo di avvio della Penn State. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata parzialmente supportata dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) del National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio R56EB032672.

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, strumenti e reagenti utilizzati in questo protocollo.
1. Sintesi di GelMA
NOTA: la sintesi di GelMA deve essere condotta in una cappa aspirante chimica e devono essere utilizzati sempre adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).
<ol><li>Aggiungere 200 mL di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS, 1x) in un matraccio Erlenmey...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

La gelatina e i suoi derivati sono i biomateriali a base proteica più comunemente usati per la fabbricazione di HMP. La sfida del compromesso tra produttività e monodispersità delle dimensioni delle particelle può essere superata utilizzando dispositivi microfluidici a emulsificazione graduale. Questi dispositivi sono in grado di formare più di 40 milioni di goccioline all'ora, con un coefficiente di variazione inferiore al 5%27. In questo articolo, abbiamo discusso la microfabbricazione di g...

L'assemblaggio di blocchi di costruzione HMP per formare scaffold di ingegneria tissutale ha guadagnato un'enorme attenzione negli ultimi anni1. GHS, fabbricato tramite assemblaggio HMP, ha proprietà uniche rispetto alle loro controparti sfuse, compresa la microporosità su scala cellulare proveniente dagli spazi vuoti tra i blocchi di costruzione discreti. Ulteriori proprietà, come l'iniettabilità, la modularità e la rigidità disaccoppiata dalla porosità, rendono GHS una piattaforma promettente per migliorare la riparazione e la rigenerazione dei tessuti2. Per la fabbricazione del GHS sono stati utilizzati diversi biomateriali, tra cui polimeri sintetici a base di PEG3,4 e polisaccaridi, come l'alginato5 e l'acido ialuronico 6,7. Tra i polimeri di derivazione naturale, il biopolimero a base proteica più comune per la fabbricazione di GHS è GelMA 8,9,10,11, un biomateriale reticolabile, biocompatibile, bioadesivo e biodegradabile12,13.
Gli HMP possono essere fabbricati tramite emulsificazione batch8, dispositivi microfluidici14,15 o emulsificazione a gradini9,11, miscelazione 16 o coacervazione complessa17,18. Di solito, c'è un compromesso tra il throughput di fabbricazione e la monodispersità HMP. Ad esempio, la tecnica di miscelazione produce HMP di forma irregolare e altamente polidispersi. L'emulsificazione in batch o la coacervazione complessa consente la produzione di grandi volumi di HMP sferici polidispersi. Sono stati utilizzati dispositivi microfluidici focalizzati sul flusso per fabbricare goccioline altamente monodisperse con un coefficiente di variazione del <5%, tuttavia la produttività è significativamente bassa. Nei dispositivi microfluidici a emulsificazione a gradini, i passaggi altamente parallelizzati consentono la fabbricazione ad alta produttività di HMP monodispersi19.
Gli elementi costitutivi HMP della gelatina modificata con metacrililico (GelMA) sono termoreattivi e (foto)chimicamente reticolabili, consentendo una facile fabbricazione di GHS20. Dopo il raffreddamento al di sotto della temperatura massima della soluzione critica (UCST)21 (ad esempio, a 4 °C), le goccioline contenenti una soluzione di GelMA vengono convertite in HMP fisicamente reticolati. Questi elementi costitutivi HMP vengono quindi imballati utilizzando forze esterne (ad esempio, tramite centrifugazione) per produrre sospensioni di microgel inceppate. I collegamenti interparticellari sono stabiliti tra HMP adiacenti tramite reticolazione (foto)chimica per formare GHS14 meccanicamente robusto. Una delle proprietà più importanti del GHS è la microporosità, che consente una facile penetrazione cellulare in vitro11 e una maggiore crescita tissutale in vivo22. La bioprinting tridimensionale (3D) degli HMP viene eseguita convenzionalmente utilizzando sospensioni di microgel strettamente imballate, compromettendo la microporosità23.
Abbiamo recentemente sviluppato una nuova classe di bioink granulari basati sulla nanoingegneria interfacciale dei microgel GelMA attraverso l'adsorbimento di nanoparticelle caricate eterogeneamente, seguito dall'autoassemblaggio reversibile di nanoparticelle. Questa strategia rende biostampabili in 3D i microgel a cedimento di taglio e di estrusione debolmente imballati, che preservano la porosità su microscala del GHS11 prodotto in modo additivo. Questo articolo presenta i metodi per la fabbricazione di goccioline GelMA ad alta produttività, convertendo queste goccioline in HMP fisicamente reticolati, fabbricando HMP GelMA utilizzando polvere risospendibile, formazione di GelMA GHS, preparazione di bioink granulare nanoingegnerizzato (NGB) GelMA e bioprinting 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
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gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

L'emergere di scaffold granulari di idrogel (GHS), fabbricati tramite l'assemblaggio di microparticelle di idrogel (HMP), ha permesso la formazione di scaffold microporosi in situ. A differenza degli idrogel sfusi convenzionali, i pori interconnessi su microscala nel GHS facilitano l'infiltrazione cellulare indipendente dalla degradazione e il trasferimento di ossigeno, nutrienti e sottoprodotti cellulari. La gelatina modificata con metacrilile (GelMA), un biopolimero (foto)chimicamente reticolabile a base di proteine contenente adesivi cellulari e porzioni biodegradabili, è stato ampiamente utilizzato come biomateriale sensibile alle cellule / istruttivo. La conversione di GelMA sfuso in GHS può aprire una pletora di opportunità per l'ingegneria e la rigenerazione dei tessuti. In questo articolo, dimostriamo le procedure di fabbricazione di microgel GelMA ad alta produttività, conversione in microgel secchi risospendibili (micro-aerogel), formazione di GHS tramite l'assemblaggio chimico di microgel e fabbricazione di bioink granulari per la bioprinting per estrusione. Mostriamo come un trattamento fisico-chimico sequenziale tramite raffreddamento e fotoreticolazione consenta la formazione di GHS meccanicamente robusto. Quando la luce è inaccessibile (ad esempio, durante l'iniezione di tessuti profondi), gli HMP GelMA reticolati singolarmente possono essere assemblati bioortogonalmente tramite reticolazione enzimatica utilizzando transglutaminasi. Infine, la bioprinting tridimensionale (3D) di GHS microporoso a bassa densità di impacchettamento HMP è dimostrata attraverso l'autoassemblaggio interfacciale di nanoparticelle caricate eterogeneamente.

GelMA è stato sintetizzato attraverso la reazione della gelatina con MA, come presentato nella Figura 1A. Adattando le condizioni di reazione, come la concentrazione di MA, sono stati ottenuti diversi gradi di sostituzione di MA. Per quantificare il grado di sostituzione MA, GelMA è stato valutato tramite spettroscopia NMR 1H (Figura 1B). I gruppi funzionali vinilici con picchi rappresentativi ai cambiamenti chimici di ~ 5-6 ppm hanno confe...

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Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Questo articolo descrive i protocolli per la fabbricazione di microgel di gelatina metacriloile ad alta produttività utilizzando dispositivi microfluidici, la conversione di microgel in polvere risostenibile (micro-aerogel), l'assemblaggio chimico di microgel per formare scaffold di idrogel granulare e lo sviluppo di bioink granulari di idrogel con microporosità conservata per il bioprinting 3D.

Scaffold di idrogel granulare di gelatina metacrilico: fabbricazione di microgel ad alta produttività, liofilizzazione, assemblaggio chimico e bioprinting 3D

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

La matrice extracellulare o le microparticelle numeriche di idrogel ECM possono essere utilizzate come elementi costitutivi per la fabbricazione di impalcature. Questo protocollo dimostra la fabbricazione, la purificazione, la liofilizzazione, l'assemblaggio fotografico e la biostampa 3D di microparticelle di gelatina metacrilico o idrogel GelMA. GelMA è un biopolimero fotochimicamente, reticolabile, a base di proteine contenente adesivo cellulare e porzioni biodegradabili che è stato ampiamente utilizzato come biomateriale sensibile alle cellule e istruttivo.Rispetto all'idrogel sfuso convenzionale, gli scaffold di idrogel granulare GelMA sono microporosi, consentendo una rapida infiltrazione cellulare che può essere adattata alle dimensioni del blocco di costruzione. Gli scaffold di idrogel granulare GelMA possono aprire nuove opportunità per la bioprinting 3D di tessuti, organi e malattie spessi su piattaforme economiche e ingegneria rigenerativa. Per iniziare, aggiungere 10 milligrammi di LAP a 10 millilitri di DPBS per preparare una soluzione fotoiniziatore allo 0,1%.Proteggere la soluzione dalla luce avvolgendola con un foglio di alluminio ed etichettarla. Quindi, sciogliere la quantità desiderata di GelMA nella soluzione di fotoiniziatore. Posizionare la soluzione avvolta in fogli di alluminio nel forno a 37 gradi Celsius per un'ora per ottenere una soluzione limpida.Per preparare la fase oleosa, creare una soluzione di tensioattivo biocompatibile al 2% nel fluido tecnico. Inserire il tubo Tygon negli ingressi e nelle uscite del dispositivo PDMS, quindi inserire un ago smussato calibro 25 nell'altra estremità del tubo Tygon per gli ingressi. Posizionare il dispositivo sotto il microscopio e mantenere l'ambiente caldo a circa 40 gradi Celsius utilizzando un asciugacapelli o una stufa.Caricare le soluzioni acquose e oleose in siringhe separate collegate al dispositivo. Avviare la pompa a siringa per la fase oleosa con una portata di 160 microlitri al minuto. Dopo che l'olio ha riempito il canale, avviare la fase acquosa a 80 microlitri al minuto.Controllare la formazione di goccioline al microscopio. Raccogliere le goccioline in un contenitore e valutarle nella camera di imaging mediante microscopia ottica. Mantenere le goccioline a quattro gradi Celsius durante la notte proteggendole dalla luce per avviare la reticolazione fisica del microgel GelMA e convertire le goccioline in microgel stabili.Per implementare il metodo MEtoP (emulsione-polvere) microingegnerizzata, raccogliere i microgel fisicamente reticolati nel fluido ingegneristico utilizzando tubi di microcentrifuga termicamente resistenti o crioviali. Sigillare il tubo aperto con una salvietta e un nastro adesivo da laboratorio. Congelare i microgel fisicamente reticolati in azoto liquido per 10 minuti per procedere con la liofilizzazione.Dopo la liofilizzazione, si otterrà una polvere solida. Aggiungere un millilitro di soluzione fotoiniziatore raffreddata allo 0,1% a quattro gradi Celsius alla polvere liofilizzata per produrre sospensioni di microgel. Centrifugare la miscela vortexed a 3.000 g per 15 secondi.Dopo aver scartato il surnatante, trasferire la sospensione di microgel imballata in uno stampo utilizzando una pipetta a spostamento positivo ed esporla alla luce a una lunghezza d'onda di 400 nanometri con un'intensità di 15 milliwatt per centimetro quadrato per 60 secondi per formare scaffold granulari di idrogel o GHS. Per 400 microlitri di sospensione di microgel, aggiungere una quantità uguale di soluzione di PFO ghiacciata, il 20% in fluido ingegneristico ai microgel GelMA fisicamente reticolati. Quindi centrifugare la miscela vortexed a 300 g per 15 secondi e rimuovere la fase oleosa dai microgel GelMA mediante pipettaggio.Quindi aggiungere 400 microlitri di soluzione di fotoiniziatore ghiacciato allo 0,1% alla sospensione di microgel. Dopo aver centrifugato la soluzione a vortice a 300g per 15 secondi, scartare l'olio. Ripetere i passaggi di aggiunta della soluzione fotoiniziatrice e centrifugazione, ma centrifugare a 3.000 g questa volta e scartare il surnatante dei microgel GelMA confezionati.Trasferire i microgel GelMA confezionati in uno stampo, seguiti dall'esposizione alla luce per formare il GHS. Aggiungi 100 milligrammi di polvere di nanopiastrine a tre millilitri di acqua ultrapura ghiacciata e ghiacciata per formare una dispersione di nanoparticelle del 3,33%. Vortice la dispersione vigorosamente all'interno di un frigorifero a quattro gradi Celsius per 15 minuti per esfoliare le nanoparticelle aggregate.Le nanoparticelle correttamente esfoliate producono una chiara dispersione. Sciogliere 50 milligrammi di LAP in cinque millilitri di acqua ghiacciata e ultrapura per preparare una soluzione madre di fotoiniziatore all'1%. Quindi aggiungere 333 microlitri di soluzione fotoiniziatrice all'1% alla dispersione di nanoparticelle esfoliate e avvolgerla in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce ambientale.Vortice la miscela per un minuto per mescolare la dispersione di nanoparticelle e il fotoiniziatore. Aggiungi PFO ghiacciato, 20% in fluido tecnico ai microgel GelMA fisicamente reticolati con un rapporto di volume uno-a-uno. Dopo aver centrifugato la miscela vortexed a 300g per 15 secondi, scartare la fase oleosa contenente il tensioattivo.Aggiungere la dispersione di nanoparticelle ghiacciata e integrata con LAP ai microgel GelMA lavati. Dopo aver centrifugato a 3.000 g per 15 secondi, scartare l'olio rimanente sul fondo e la dispersione del surnatante Conservare la sospensione a quattro gradi Celsius proteggendola dalla luce utilizzando un foglio di alluminio per un giorno per ottenere il prodotto GelMA nanoengineered granular bioink o NGB.Il giorno seguente, caricare l'NGB in una siringa da tre millilitri. Sigillare la siringa caricata con un cappuccio e un parafilm ed eseguire una centrifugazione a impulsi a 200 g per rimuovere l'aria intrappolata. Trasferire il bioink su una cartuccia da tre millilitri utilizzando un connettore Luer femmina-femmina.Centrifugare brevemente la cartuccia a 200 g per rimuovere l'aria intrappolata e mantenere l'NGB a quattro gradi Celsius prima dell'uso. Quindi, caricare la sospensione di cellule di fibroblasti murini preparata in una siringa da tre millilitri. Accoppiare l'NGB e le siringhe caricate a cellule utilizzando un connettore Luer femmina-femmina e mescolare delicatamente il contenuto spingendo avanti e indietro 40 volte.Stampare l'NGB o l'NGB carico di celle utilizzando un bioprinter appropriato con un ugello conico standard caricando l'ugello nella testina di stampa da tre millilitri. Mantieni la temperatura del piano di stampa al di sotto dei 10 gradi Celsius e ottimizza parametri come velocità e contropressione. Selezionare il file gcode o STL desiderato.Quindi selezionare il substrato e il tipo di ugello per una siringa pneumatica da tre millilitri dotata di un ugello conico standard. Calibrare la bioprinter utilizzando le linee guida del dispositivo e avviare la stampa per ottenere le strutture 3D. La tecnologia MEtoP ha prodotto polvere di microgel essiccata risospendibile mediante liofilizzazione a bassa pressione, proteggendo al contempo i microgel dall'aggregazione e dalla deformazione grave.Le immagini SEM hanno mostrato che le microparticelle di GelMA essiccate che utilizzano questa tecnologia mantengono la loro forma sferica dopo la liofilizzazione rispetto all'aggregazione osservata con la liofilizzazione convenzionale. La caratterizzazione microporosa di GelMA, GHS e NGB con un colorante a fluorescenza ad alto peso molecolare ha mostrato gli spazi vuoti interconnessi su microscala. Inoltre, l'immagine a fluorescenza valutata utilizzando uno script MATLAB personalizzato ha rilevato i pori.Le misurazioni della frazione di vuoto e del diametro equivalente dei pori mediani non hanno mostrato differenze significative che attestano la disponibilità e l'interconnettività dei pori su microscala negli scaffold stampati in 3D utilizzando l'NGB. La superiorità degli scaffold NGB rispetto ai microgel GelMA strettamente e liberamente imballati dalla misurazione della lunghezza del filamento appeso ha rivelato che NGB aveva una lunghezza maggiore rispetto ai microgel imballati. I microgel debolmente imballati non hanno prodotto filamenti.Un cilindro cavo è stato stampato in 3D e l'intero costrutto è stato esposto alla luce per la fotoreticolazione. La struttura stampata è stata tenuta fisicamente per mostrare la forma, la fedeltà e l'integrità strutturale. Se l'impalcatura viene utilizzata per la valutazione biologica, ad esempio nella bioprinting carica di cellule, ricordarsi di eseguire tutti i passaggi in determinate condizioni, sotto l'armadio di sicurezza biologica.Speriamo di de-commercializzare l'uso di scaffold granulari di idrogel come piattaforma biomateriale appena emersa in biomedicina.

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