Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

著者らは、ペンシルベニア州立大学(ペンシルベニア州立大学)の化学工学科の研究支援スペシャリストであるT.ポンド、ペンシルベニア州立大学のナノファブリケーションラボのスタッフ、およびナノファブリケーションプロセスに関する支援と議論を提供してくれたPartillion BioscienceのJ.デルッテ博士に感謝します。A. Sheikhiは、材料研究所(MRI)と工学部の人間レベルの材料問題シード助成金、生活多機能材料システムのためのコンバージェンスセンター(LiMC2)とクラスターオブエクセレンスリビング、適応およびエネルギー自律材料システム(livMatS)リビング多機能材料共同研究シード助成プログラム、およびペンシルベニア州立大学からのスタートアップ基金の支援を認めています。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立生物医学画像生物工学研究所(NIBIB)によって、賞番号R56EB032672で部分的にサポートされました。

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. ゲルマ合成
注意: GelMA合成は化学ヒュームフードで行い、適切な個人用保護具(PPE)を常に使用する必要があります。
<ol><li>200 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、1x)を三角フラスコに加え?...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

ゼラチンとその誘導体は、HMP製造に最も一般的に使用されるタンパク質ベースの生体材料です。スループットと粒子サイズの単分散性のトレードオフの課題は、ステップ乳化マイクロ流体デバイスを使用して克服できます。これらのデバイスは、変動係数が5%未満で、毎時4,000万個以上の液滴を形成することができます27。本稿では、GelMA溶液を含む液滴を微細加工し、その?...

HMPビルディングブロックを組み立てて組織工学の足場を形成することは、過去数年間で大きな注目を集めています1。HMPアセンブリを介して製造されたGHSは、個別のビルディングブロック間のボイドスペースに由来するセルスケールのマイクロ多孔性など、バルク対応物と比較して独自の特性を持っています。注入性、モジュール性、多孔性から分離された剛性などの追加の特性により、GHSは組織の修復と再生を強化するための有望なプラットフォームとなっています2。合成PEGベースのポリマー3,4およびアルギン酸5およびヒアルロン酸6,7などの多糖類を含む、異なる生体材料がGHS製造に使用されている。天然由来のポリマーの中で、GHS製造のための最も一般的なタンパク質ベースのバイオポリマーは、架橋性、生体適合性、生体接着性、および生分解性の生体材料であるGelMA 8,9,10,11です12,13。
HMPsは、バッチ乳化8、フローフォーカシング14、15またはステップ乳化9、11マイクロ流体デバイス、ブレンド16、または複雑なコアセルベーション17、18を介して作製することができる。通常、製造スループットとHMP単分散度の間にはトレードオフがあります。例えば、ブレンド技術により、不規則な形状で高度に分散したHMPが得られます。 バッチ乳化または複雑なコアセルベーションにより、大量の多分散球状HMPの製造が可能になります。 フローフォーカシングマイクロ流体デバイスは、変動係数が<5%の高度に単分散した液滴を製造するために使用されてきましたが、スループットは大幅に低くなっています。ステップ乳化マイクロ流体デバイスにおいて、高度に並列化されたステップにより、単分散HMP19のハイスループット製造が可能になる。
メタクリロイル修飾ゼラチン(GelMA)HMPビルディングブロックは、温度応答性および(光)化学的に架橋可能であり、容易なGHS製造を可能にする20。上限臨界溶解温度(UCST)21未満(例えば、4°C)に冷却すると、GelMA溶液を含む液滴は物理的に架橋されたHMPに変換されます。次に、これらのHMPビルディングブロックを外力(遠心分離など)を使用して充填し、詰まったミクロゲル懸濁液を生成します。隣接するHMP間に(光)化学的架橋を介して粒子間結合が確立され、機械的に堅牢なGHS14が形成されます。GHSの最も重要な特性の1つは、マイクロ多孔性であり、in vitroでの容易な細胞浸透11およびin vivoでの組織内殖の増強を可能にする22。HMPの三次元(3D)バイオプリンティングは、従来、密に充填されたミクロゲル懸濁液を用いて行われ、微多孔性を損なう23。
我々は最近、不均一に荷電したナノ粒子の吸着とそれに続くナノ粒子の可逆的自己組織化 を介した GelMAミクロゲルの界面ナノエンジニアリングに基づく新しいクラスの粒状バイオインクを開発しました。この戦略により、緩く充填されたミクロゲルのせん断収量と押出3Dバイオプリントが可能になり、積層造形されたGHS11のマイクロスケールの多孔性が維持されます。本稿では、ハイスループットのGelMA液滴作製、これらの液滴を物理的に架橋されたHMPに変換する方法、再懸濁可能な粉末を用いたGelMA HMPの作製、GelMA GHS形成、GelMAナノエンジニアリング粒状バイオインク(NGB)調製、および3Dバイオプリンティングの方法を紹介します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

ヒドロゲル微粒子(HMP)を組み立て ることによって 製造された粒状ヒドロゲル足場(GHS)の出現により、 その場での微多孔性足場の形成が可能になりました。従来のバルクヒドロゲルとは異なり、GHSの相互接続されたマイクロスケールの細孔は、分解に依存しない細胞浸潤、ならびに酸素、栄養素、および細胞の副産物の移動を促進します。メタクリロイル修飾ゼラチン(GelMA)は、細胞接着性および生分解性部分を含む(光)化学的に架橋可能なタンパク質ベースの生体ポリマーであり、細胞応答性/有益な生体材料として広く使用されています。バルクGelMAをGHSに変換すると、組織工学と再生のための多くの機会が開かれる可能性があります。本稿では、ハイスループットGelMAミクロゲル作製、再懸濁乾燥ミクロゲル(マイクロエアロゲル)への変換、ミクロゲルの化学集合 体による GHS形成、および押出バイオプリンティングのための顆粒バイオインク作製の手順を示す。冷却と光架橋 による 逐次物理化学的処理により、機械的に堅牢なGHSの形成がどのように可能になるかを示します。光にアクセスできない場合(例えば、深部組織注入中)、個別に架橋されたGelMA HMPは、トランスグルタミナーゼを用いた酵素架橋 を介して 生物学的に直交的に組み立てることができます。最後に、低HMP充填密度での微多孔性GHSの3次元(3D)バイオプリンティングは、不均一に荷電したナノ粒子の界面自己組織化 を介して 実証される。

GelMAは、図1Aに示すように、ゼラチンとMAの反応によって合成されました。MA濃度などの反応条件を調整することにより、異なる程度のMA置換が得られた。MA置換の程度を定量化するために、GelMAを1H NMR分光法を介して評価した(図1B)。~5-6 ppmの化学シフトに代表的なピークを持つビニル官能基は、ゼラチンからのGelMA合成の成功を確認し?...

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Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

この記事では、マイクロ流体デバイスを使用したハイスループットゼラチンメタクリロイルミクロゲル製造、ミクロゲルの再懸濁可能な粉末(マイクロエアロゲル)への変換、粒状ヒドロゲル足場を形成するためのミクロゲルの化学集合、および3Dバイオプリンティング用のマイクロ多孔性が保存された粒状ヒドロゲルバイオインクの開発のプロトコルについて説明します。

ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3Dバイオプリンティング

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

細胞外マトリックスまたはECM数値ヒドロゲル微粒子は、足場製造のためのビルディングブロックとして使用され得る。このプロトコルは、ゼラチンメタクリロイルまたはGelMAヒドロゲル微粒子の製造、精製、凍結乾燥、写真アセンブリ、および3Dバイオプリンティングを実証します。GelMAは、細胞接着性および生分解性部分を含む光化学的、架橋性、タンパク質ベースの生体ポリマーであり、細胞応答性および有益な生体材料として広く使用されている。従来のバルクヒドロゲルと比較して、GelMA粒状ヒドロゲル足場は微孔性であり、ビルディングブロックサイズによって調整できる迅速な細胞浸潤を可能にします。GelMA粒状ヒドロゲル足場は、安価なプラットフォームと再生工学で厚い組織、臓器、および疾患の3Dバイオプリンティングの新しい機会を開く可能性があります。まず、10ミリグラムのLAPを10ミリリットルのDPBSに加えて、0.1%光開始剤溶液を調製します。溶液をアルミホイルで包んで光から保護し、ラベルを付けます。次に、光開始剤溶液に所望量のGelMAを溶解する。アルミホイルで包んだ溶液を摂氏37度のオーブンに1時間入れて、透明な溶液を作ります。油相を調製するには、エンジニアリング液に2%生体適合性界面活性剤溶液を作ります。PDMSデバイスの入口と出口にタイゴンチューブを挿入し、インレット用のタイゴンチューブのもう一方の端に25ゲージの鈍い針を挿入します。デバイスを顕微鏡下に置き、ヘアドライヤーまたはスペースヒーターを使用して摂氏約40度で環境を暖かく保ちます。水溶液と油溶液を、デバイスに接続された別々のシリンジに入れます。毎分160マイクロリットルの流量で油相用のシリンジポンプを始動します。オイルがチャネルを満たした後、毎分80マイクロリットルで水相を開始します。顕微鏡で液滴形成を確認します。液滴を容器に回収し、光学顕微鏡イメージングによりイメージングチャンバー内で評価します。液滴を光から保護しながら一晩摂氏4度に保ち、GelMAミクロゲルの物理的架橋を開始し、液滴を安定したミクロゲルに変換します。マイクロエンジニアリングされたエマルジョンから粉末へのMEtoP法を実施するには、熱的に耐久性のあるマイクロ遠心チューブまたはクライオバイアルを使用して、エンジニアリング流体中の物理的に架橋されたミクロゲルを収集します。開いたチューブを実験室用ワイプとテープで密封します。物理的に架橋されたミクロゲルを液体窒素中で10分間急速凍結し、凍結乾燥を進行させます。凍結乾燥後、固体粉末が得られるであろう。凍結乾燥粉末に摂氏4度で冷却した0.1%光開始剤溶液1ミリリットルを加えて、ミクロゲル懸濁液を作ります。ボルテックス混合物を3, 000gで15秒間遠心分離します。上清を廃棄した後、充填したミクロゲル懸濁液を容積式ピペットを用いて型に移し、波長400ナノメートルの光に15ミリワット/平方センチメートルの強度で60秒間さらして、粒状のヒドロゲル足場またはGHSを形成する。400マイクロリットルのミクロゲル懸濁液に対して、物理的に架橋されたGelMAミクロゲルに等量の氷冷PFO溶液、20%インエンジニアリング液を加えます。次いで、ボルテックス混合物を300gで15秒間遠心分離し、ピペッティングによってGelMAミクロゲルから油相を除去する。次に、400マイクロリットルの氷冷、0.1%光開始剤溶液をミクロゲル懸濁液に加えます。ボルテックス溶液を300gで15秒間遠心分離した後、オイルを廃棄します。光開始剤溶液添加と遠心分離の工程を繰り返すが、今回は3, 000gで遠心分離し、充填したGelMAミクロゲルの上清を廃棄する。充填したGelMAミクロゲルを型に移し、続いて光露光してGHSを形成する。100ミリグラムのナノプレートレット粉末を3ミリリットルの氷冷超純水に加えて、3.33%ナノ粒子分散液を形成します。4°Cの冷蔵庫内で分散液を15分間激しくボルテックスして、凝集したナノ粒子を剥離します。適切に剥離されたナノ粒子は、透明な分散液を生成する。50ミリグラムのLAPを5ミリリットルの氷冷超純水に溶解し、1%光開始原液を調製します。次に、剥離したナノ粒子分散液に333マイクロリットルの1%光開始剤溶液を加え、周囲光から保護するためにアルミホイルで包みます。この混合物を1分間ボルテックスし、ナノ粒子分散液と光開始剤とを混合する。氷冷PFO、20%インエンジニアリング液を物理的に架橋されたGelMAミクロゲルに1対1の体積比で加えます。ボルテックス混合液を300gで15秒間遠心分離した後、界面活性剤を含む油相を廃棄する。氷冷したLAP添加ナノ粒子分散液を洗浄したGelMAミクロゲルに加えます。3, 000gで15秒間遠心分離した後、底部に残った油分と上澄み液分散液を捨てる。懸濁液を摂氏4度で保管し、アルミホイルを使用して光から1日間保護し、製品GelMAナノエンジニアリング粒状バイオインクまたはNGBを生成します。翌日、NGBを3ミリリットルのシリンジに入れます。装填したシリンジをキャップとパラフィルムで密封し、200gでパルス遠心分離を行って閉じ込められた空気を取り除きます。雌 - 雌ルアーロックコネクタを使用して、バイオインクを3ミリリットルのカートリッジに移します。カートリッジを再び200gで短時間遠心分離して閉じ込められた空気を取り除き、NGBを摂氏4度に保ってから使用してください。次に、調製したマウス線維芽細胞懸濁液を3ミリリットルのシリンジに入れる。雌-雌ルアーロックコネクタを使用してNGBとセルロードシリンジを結合し、内容物を40回前後に押して穏やかに混合します。3ミリリットルのプリントヘッドにノズルをロードすることにより、標準の円錐形ノズルを備えた適切なバイオプリンターを使用してNGBまたは細胞を含んだNGBを印刷します。印刷ベッドの温度を摂氏10度未満に保ち、速度や背圧などのパラメータを最適化します。目的のgcodeまたはSTLファイルを選択します。次に、標準の円錐形ノズルを備えた空気圧式3ミリリットルシリンジの基板とノズルタイプを選択します。デバイスのガイドラインを使用してバイオプリンターを校正し、印刷を開始して3D構造を取得します。MEtoP技術は、ミクロゲルを凝集や激しい変形から保護しながら、低圧凍結乾燥によって再懸濁可能な乾燥ミクロゲル粉末を生成しました。SEM画像は、この技術を使用して乾燥したGelMA微粒子が、従来の凍結乾燥で観察された凝集と比較して、凍結乾燥後も球形を保持することを示しました。高分子量蛍光色素を用いたGelMA、GHS、およびNGBのマイクロポア特性評価は、相互接続されたマイクロスケールのボイドスペースを示しました。また、カスタム記述されたMATLABスクリプトを使用して評価された蛍光画像は、細孔を検出しました。ボイド率と中央細孔等価直径の測定値は、NGBを使用して3Dプリントされた足場のマイクロスケール細孔の可用性と相互接続性を証明する有意差を示さなかった。ハンギングフィラメント長測定により、NGB足場が密集および緩充填されたGelMAミクロゲルに対して優れていることが明らかになり、NGBは充填されたミクロゲルよりも長い長さを有することが明らかになりました。緩く充填されたミクロゲルはフィラメントを生じなかった。中空のシリンダーを3Dプリントし、構造全体を光架橋のために光にさらしました。印刷された構造は、形状、忠実度、および構造の完全性を示すために物理的に保持されました。足場が生物学的評価に使用される場合、例えば、細胞を含んだバイオプリンティングにおいて、生物学的安全キャビネットの下で、特定の条件下ですべてのステップを実行することを忘れないでください。私たちは、生物医学における新たに出現した生体材料プラットフォームとしての粒状ヒドロゲル足場の使用を非市場化したいと考えています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3 D プリントされた多孔性セルロース ナノコンポジット型ヒドロゲル足場

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

末梢神経工学のためのグラフェンベースの3Dバイオハイブリッドヒドロゲルバイオインクの調製と特性評価

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

ミクロゲルロッドからの連結マクロポーラス3D足場

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

強接着性ハイドロゲルゼラチンO-ニトロソベンズアルデヒドの合成

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

懸濁3Dバイオプリンティングのためのゲル化中のせん断処理によって形成されたアガロース流体ゲル

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...