Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke T. Pond, forskningsstøttespesialist ved Institutt for kjemisk ingeniørfag ved Pennsylvania State University (Penn State), Nanofabrication Lab-personalet ved Penn State og Dr. J. de Rutte fra Partillion Bioscience for hjelp og diskusjon om nanofabrikasjonsprosesser. A. Sheikhi anerkjenner støtten fra Materials Research Institute (MRI) og College of Engineering Materials Matter på menneskelig nivå frøtilskudd, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) og Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program, og oppstartsfondet fra Penn State. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble delvis støttet av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) fra National Institutes of Health (NIH) under tildelingsnummer R56EB032672.

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, instrumenter og reagenser som brukes i denne protokollen.
1. GelMA-syntese
MERK: GelMA-syntese skal utføres i en kjemisk avtrekkshette, og riktig personlig verneutstyr (PPE) bør brukes hele tiden.
<ol><li>Tilsett 200 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS, 1x) til en Erlenmeyer-kolbe og varm opp oppløsningen til den når 50 °C. Dekk kolben med alumini...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

Gelatin og dets derivater er de mest brukte proteinbaserte biomaterialene for HMP-fabrikasjon. Utfordringen med kompromiss mellom gjennomstrømning og monodispersjon av partikkelstørrelse kan overvinnes ved hjelp av mikrofluidiske enheter for trinnemulgering. Disse enhetene er i stand til å danne mer enn 40 millioner dråper per time, med en variasjonskoeffisient mindre enn 5%27. I denne artikkelen diskuterte vi mikrofabrikasjon av dråper som inneholder GelMA-løsninger, etterfulgt av å konver...

Montering av HMP-byggeklosser for å danne vevstekniske stillaser har fått enorm oppmerksomhet de siste årene1. GHS, produsert via HMP-montering, har unike egenskaper sammenlignet med sine bulk-kolleger, inkludert mikroporøsitet i celleskala som stammer fra tomrommene blant de diskrete byggeklossene. Ytterligere egenskaper, som injiserbarhet, modularitet og frakoblet stivhet fra porøsitet, gjør GHS til en lovende plattform for å forbedre vevsreparasjon og regenerering2. Ulike biomaterialer har blitt brukt til GHS-fabrikasjon, inkludert syntetiske PEG-baserte polymerer3,4 og polysakkarider, som alginat5 og hyaluronsyre 6,7. Blant naturlig avledede polymerer er den vanligste proteinbaserte biopolymeren for GHS-fabrikasjon GelMA 8,9,10,11, et tverrbindbart, biokompatibelt, bioadhesivt og biologisk nedbrytbart biomateriale 12,13.
HMP kan fremstilles via batchemulgering8, strømningsfokuserende 14,15 eller trinn-emulgering9,11 mikrofluidiske enheter, blanding 16 eller kompleks koacervasjon17,18. Vanligvis er det en avveining mellom fabrikasjonsgjennomstrømningen og HMP-monodispersiteten. For eksempel gir blandingsteknikken uregelmessig formede og svært polydispergerte HMPer. Batchemulgering eller kompleks koacervasjon muliggjør produksjon av store mengder polydispergerte sfæriske HMPer. Strømningsfokuserende mikrofluidiske enheter har blitt brukt til å fremstille svært monodisperserte dråper med en variasjonskoeffisient på <5%, men gjennomstrømningen er betydelig lav. I trinn-emulgering mikrofluidiske enheter, muliggjør de svært parallelle trinnene høy gjennomstrømningsfabrikasjon av monodisperserte HMPer19.
Metakryloylmodifisert gelatin (GelMA) HMP-byggeklosser er termoresponsive og (foto)kjemisk tverrbindbare, noe som muliggjør lett GHS-fabrikasjon20. Ved avkjøling under øvre kritiske løsningstemperatur (UCST)21 (f.eks. ved 4 °C) omdannes dråper som inneholder en GelMA-oppløsning til fysisk kryssbundne HMP-er. Disse HMP-byggesteinene pakkes deretter ved hjelp av eksterne krefter (f.eks. via sentrifugering) for å gi fastkjørte mikrogelsuspensjoner. Interpartikkelkoblinger etableres mellom tilstøtende HMP-er via (foto)kjemisk tverrbinding for å danne mekanisk robust GHS14. En av de viktigste egenskapene til GHS er mikroporøsitet, noe som muliggjør lettcellepenetrasjon in vitro11 og økt vevsinnvekst in vivo22. Tredimensjonal (3D) bioprinting av HMP utføres konvensjonelt ved bruk av tettpakkede mikrogelsuspensjoner, noe som kompromitterer mikroporøsiteten23.
Vi har nylig utviklet en ny klasse av granulære bioblekk basert på grensesnittet nanoengineering av GelMA mikrogeler via adsorpsjon av heterogent ladede nanopartikler, etterfulgt av nanopartikkel reversibel selvmontering. Denne strategien gjør løst pakkede mikrogeler skjærende og ekstrudering 3D bioprintable, noe som bevarer mikroskalaporøsiteten til additivt produsert GHS11. Denne artikkelen presenterer metodene for høy gjennomstrømning GelMA-dråpefabrikasjon, konvertering av disse dråpene til fysisk tverrbundne HMPer, fremstilling av GelMA HMPs ved bruk av resuspenderbart pulver, GelMA GHS-dannelse, GelMA nanoengineered granular bioink (NGB) forberedelse og 3D-bioprinting.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

Fremveksten av granulære hydrogelstillas (GHS), fremstilt ved montering av hydrogelmikropartikler (HMP), har muliggjort mikroporøs stillasdannelse in situ. I motsetning til konvensjonelle bulkhydrogeler, letter sammenkoblede mikroskalaporer i GHS nedbrytningsuavhengig celleinfiltrasjon, samt oksygen, næringsstoffer og cellulær biproduktoverføring. Metakryloylmodifisert gelatin (GelMA), en (foto) kjemisk tverrbindbar, proteinbasert biopolymer som inneholder celleklebende og biologisk nedbrytbare deler, har mye blitt brukt som et celleresponsivt / instruktivt biomateriale. Konvertering av bulk GelMA til GHS kan åpne en mengde muligheter for vevsteknikk og regenerering. I denne artikkelen demonstrerer vi prosedyrene for GelMA-mikrogelfabrikasjon med høy gjennomstrømning, konvertering til resuspenderbare tørre mikrogeler (mikroaerogeler), GHS-dannelse via kjemisk montering av mikrogeler og granulær bioblekkfabrikasjon for ekstruderingsbioprinting. Vi viser hvordan en sekvensiell fysisk-kjemisk behandling via kjøling og fotokryssbinding muliggjør dannelse av mekanisk robuste GHS. Når lyset er utilgjengelig (f.eks. under dyp vevsinjeksjon), kan individuelt tverrbundne GelMA HMPs settes sammen bioortogonalt via enzymatisk kryssbinding ved bruk av transglutaminaser. Til slutt demonstreres tredimensjonal (3D) bioprinting av mikroporøs GHS ved lav HMP-pakketetthet via grensesnittets selvmontering av heterogent ladede nanopartikler.

GelMA ble syntetisert gjennom reaksjonen av gelatin med MA, som presentert i figur 1A. Ved å skreddersy reaksjonsbetingelsene, slik som MA-konsentrasjon, ble forskjellige grader av MA-substitusjon oppnådd. For å kvantifisere graden av MA-substitusjon ble GelMA vurdert med 1H NMR-spektroskopi (figur 1B). Vinylfunksjonelle grupper med representative topper ved kjemiske skift på ~ 5-6 ppm bekreftet den vellykkede GelMA-syntesen fra gelatin. ...

Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Denne artikkelen beskriver protokoller for høy gjennomstrømning gelatinmetakryloylmikrogelfabrikasjon ved bruk av mikrofluidiske enheter, konvertering av mikrogeler til resuspenderbart pulver (mikroaerogeler), kjemisk montering av mikrogeler for å danne granulære hydrogelstillas og utvikling av granulære hydrogelbioblekk med bevart mikroporøsitet for 3D-bioprinting.

Gelatinmetakryloyl granulære hydrogelstillas: Mikrogelfabrikasjon med høy gjennomstrømning, lyofilisering, kjemisk montering og 3D-bioprinting

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Ekstracellulær matriks eller ECM numeriske hydrogelmikropartikler kan brukes som byggesteiner for stillasfabrikasjon. Denne protokollen demonstrerer fabrikasjon, rensing, lyofilisering, fotomontering og 3D-bioprinting av gelatinmetakryloyl- eller GelMA-hydrogelmikropartikler. GelMA er en fotokjemisk, tverrbindbar, proteinbasert biopolymer som inneholder celleklebende og biologisk nedbrytbare deler som har blitt mye brukt som et celleresponsivt og lærerikt biomateriale.Sammenlignet med konvensjonell bulkhydrogel er GelMAs granulære hydrogelstillaser mikroporøse, noe som muliggjør rask celleinfiltrasjon som kan skreddersys etter byggeklossstørrelsen. GelMA granulære hydrogelstillas kan åpne nye muligheter for 3D-bioprinting av tykke vev, organer og sykdommer på billige plattformer og regenerativ engineering. For å begynne, legg til 10 milligram LAP til 10 ml DPBS for å forberede en 0,1% fotoinitiatorløsning.Beskytt løsningen mot lys ved å pakke den inn med aluminiumsfolie, og merk den. Deretter oppløses ønsket mengde GelMA i fotoinitiatorløsningen. Plasser den aluminiumsfolieinnpakkede løsningen i ovnen på 37 grader Celsius i en time for å få en klar løsning.For å forberede oljefasen, lag en 2% biokompatibel overflateaktiv løsning i ingeniørvæsken. Sett inn Tygon-slangen i innløpene og utløpet til PDMS-enheten, og sett deretter inn en 25-gauge stump nål i den andre enden av Tygon-slangen for innløp. Plasser enheten under mikroskopet, og hold miljøet varmt ved omtrent 40 grader Celsius ved hjelp av en hårføner eller en romvarmer.Legg de vandige og oljeoppløsningene i separate sprøyter som er koblet til enheten. Start sprøytepumpen for oljefasen med en strømningshastighet på 160 mikroliter per minutt. Etter at oljen fyller kanalen, start den vandige fasen ved 80 mikroliter per minutt.Kontroller dråpedannelsen under mikroskopet. Samle dråpene i en beholder, og evaluer dem i bildekammeret ved optisk mikroskopiavbildning. Hold dråpene ved fire grader Celsius over natten mens du beskytter dem mot lys for å starte GelMA-mikrogelens fysiske tverrbinding og konvertere dråpene til stabile mikrogeler.For å implementere den mikrokonstruerte emulsjon-til-pulver, MEtoP, metode, samle de fysisk tverrbundne mikrogelene i ingeniørvæsken ved hjelp av termisk holdbare mikrosentrifugerør eller kryovialer. Forsegl det åpne røret med en laboratorieserviett og tape. Dypfrys de fysisk tverrbundne mikrogelene i flytende nitrogen i 10 minutter for å fortsette med lyofilisering.Etter lyofilisering vil et fast pulver oppnås. Tilsett en milliliter avkjølt, 0,1% fotoinitiatorløsning ved fire grader Celsius til lyofilisert pulver for å lage mikrogelsuspensjoner. Sentrifuge den virvelbaserte blandingen ved 3.000g i 15 sekunder.Etter å ha kastet supernatanten, overfør den pakkede mikrogelopphenget til en form ved hjelp av en positiv fortrengningspipette, og utsett den for lys ved 400 nanometer bølgelengde med en intensitet på 15 milliwatt per kvadratcentimeter i 60 sekunder for å danne granulære hydrogelstillas eller GHS. For 400 mikroliter mikrogelsuspensjon, tilsett like mye iskald PFO-løsning, 20% i ingeniørvæske til de fysisk tverrbundne GelMA-mikrogelene. Sentrifuger deretter den virvelbaserte blandingen ved 300 g i 15 sekunder, og fjern oljefasen fra GelMA-mikrogelene ved pipettering.Deretter tilsettes 400 mikroliter iskald, 0,1% fotoinitiatorløsning til mikrogelsuspensjonen. Etter å ha sentrifugert den virvelbaserte løsningen ved 300 g i 15 sekunder, kast oljen. Gjenta trinnene med fotoinitiatorløsningstillegg og sentrifugering, men sentrifuge ved 3.000g denne gangen og kast supernatanten av pakkede GelMA-mikrogeler.Overfør de pakkede GelMA-mikrogelene til en form, etterfulgt av lyseksponering for å danne GHS. Tilsett 100 milligram nanoplateletpulver til tre milliliter iskaldt, ultrarent vann for å danne en 3, 33% nanopartikkeldispersjon. Vortex dispersjonen kraftig inne i et fire grader Celsius kjøleskap i 15 minutter for å eksfoliere de aggregerte nanopartiklene.Riktig eksfolierte nanopartikler gir en klar spredning. Løs opp 50 milligram LAP i fem milliliter iskaldt, ultrarent vann for å forberede en 1% fotoinitiatorløsning. Deretter tilsettes 333 mikroliter 1% fotoinitiatorløsning til den eksfolierte nanopartikkeldispersjonen, og pakk den inn i aluminiumsfolie for å beskytte mot omgivelseslyset.Vortex blandingen i ett minutt for å blande nanopartikkeldispersjonen og fotoinitiatoren. Tilsett iskald PFO, 20% i ingeniørvæske til de fysisk tverrbundne GelMA-mikrogelene i et en-til-en volumforhold. Etter sentrifugering av den virvelbaserte blandingen ved 300g i 15 sekunder, kast oljefasen som inneholder overflateaktivt middel.Legg til iskald, LAP-supplert nanopartikkeldispersjon til de vasket GelMA-mikrogelene. Etter sentrifugering ved 3.000 g i 15 sekunder, kast den gjenværende oljen i bunnen og supernatantdispersjonen. Oppbevar suspensjonen ved fire grader Celsius mens du beskytter den mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie i en dag for å gi produktet GelMA nanoengineered granulært bioblekk eller NGB.Dagen etter laster du NGB i en tre milliliter sprøyte. Forsegl den fylte sprøyten med en hette og parafilm, og gjør en pulssentrifugering på 200g for å fjerne den fangede luften. Overfør bioblekket til en tre-milliliters kassett ved hjelp av en hunn-hunn Luer-låsekontakt.Sentrifuger patronen kort på 200g igjen for å fjerne den fangede luften, og hold NGB på fire grader Celsius før bruk. Deretter legger du den forberedte murinfibroblastcellesuspensjonen i en tre milliliter sprøyte. Koble NGB og de cellebelastede sprøytene ved hjelp av en hunn-hunn-Luer-låsekontakt, og bland innholdet forsiktig ved å skyve frem og tilbake 40 ganger.Skriv ut NGB eller cellebelastet NGB ved hjelp av en skikkelig bioprinter med en standard konisk dyse ved å legge dysen inn i tre-milliliters skrivehodet. Hold sengetemperaturen under 10 grader Celsius, og optimaliser parametere som hastighet og mottrykk. Velg ønsket gcode eller STL-fil.Velg deretter underlaget og dysetypen for en pneumatisk tre milliliter sprøyte utstyrt med en standard konisk dyse. Kalibrer bioprinteren ved hjelp av enhetens retningslinjer, og start utskriften for å få 3D-strukturene. MEtoP-teknologien ga resuspenderbart tørket mikrogelpulver ved frysetørking med lavt trykk samtidig som mikrogeler beskyttes mot aggregering og alvorlig deformasjon.SEM-bildene viste at de tørkede GelMA-mikropartiklene ved hjelp av denne teknologien beholder sin sfæriske form etter lyofilisering sammenlignet med aggregeringen observert med konvensjonell lyofilisering. Mikroporekarakteriseringen av GelMA, GHS og NGB med fluorescensfargestoff med høy molekylvekt viste de sammenkoblede tomrommene i mikroskala. Også fluorescensbildet vurdert ved hjelp av et spesialskrevet MATLAB-skript oppdaget porene.Målingene av voidfraksjon og median porekvivalent diameter viste ingen signifikant forskjell som vitner om tilgjengeligheten og sammenkoblingen av mikroskalaporer i de 3D-printede stillasene ved bruk av NGB. Overlegenheten til NGB-stillas til tett og løst pakket GelMA-mikrogeler ved hengende filamentlengdemåling viste at NGB hadde større lengde enn de pakkede mikrogelene. De løst pakkede mikrogelene ga ikke filamenter.En hul sylinder ble 3D-printet, og hele konstruksjonen ble utsatt for lys for fotocrosslinking. Den trykte strukturen ble fysisk holdt for å vise form, troskap og strukturell integritet. Hvis stillaset brukes til biologisk vurdering, for eksempel i cellebelastet bioprinting, husk å utføre alle trinnene under visse forhold, under det biologiske sikkerhetsskapet.Vi håper å avmarkedsføre bruken av granulære hydrogelstillas som en nylig oppstått biomaterialplattform innen biomedisin.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stillas for Ledd chondrocyttransplantasjon Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstruerer Ved hjelp av en Tissue-spesifikke hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting brusk og huden vev Analogs utnytte en roman passiv miksing enhet teknikk for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro modellsystemer indusere celle-formet formasjon

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stillaser

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller av 3D Bioprinting av gelatin Methacryloyl hydrogel basert Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Fremstilling og karakterisering av grafenbasert 3D biohybrid hydrogelbioblekk for perifer nevroteknologi

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Sammenkoblede makroporøse 3D-stillaser fra mikrogelstenger

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Syntese av sterk klebende hydrogel, gelatin O-nitrosobenzaldehyd

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

Agarosevæskegeler dannet ved skjærbehandling under gelering for suspendert 3D-bioprinting

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...