Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a T. Pond, especialista em apoio à pesquisa do Departamento de Engenharia Química da Universidade Estadual da Pensilvânia (Penn State), à equipe do Laboratório de Nanofabricação da Penn State e ao Dr. J. de Rutte da Partillion Bioscience pela ajuda e discussão sobre os processos de nanofabricação. A. Sheikhi agradece o apoio do Materials Research Institute (MRI) e da College of Engineering Materials Matter at the Human Level seed grants, do Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) e do Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program, e do fundo de startups da Penn State. A pesquisa relatada nesta publicação foi parcialmente apoiada pelo Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia (NIBIB) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o número de prêmio R56EB032672.

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.
1. Síntese de GelMA
NOTA: A síntese de GelMA deve ser realizada em uma capela de fumaça química, e equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados devem ser usados o tempo todo.
<ol><li>Adicionar 200 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, 1x) a um balão de...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

A gelatina e seus derivados são os biomateriais proteicos mais comumente utilizados para a fabricação de HMP. O desafio do trade-off de monodispersidade de produção versus tamanho de partícula pode ser superado usando dispositivos microfluídicos de emulsificação por etapas. Esses dispositivos são capazes de formar mais de 40 milhões de gotículas por hora, com coeficiente de variação inferior a 5%27. Neste artigo, discutimos a microfabricação de gotículas contendo soluções de Gel...

A montagem de blocos de construção HMP para formar arcabouços de engenharia de tecidos ganhou enorme atenção nos últimos anos1. GHS, fabricado via montagem HMP, tem propriedades únicas em comparação com suas contrapartes a granel, incluindo microporosidade em escala celular originada dos espaços vazios entre os blocos de construção discretos. Propriedades adicionais, como injetabilidade, modularidade e rigidez dissociada da porosidade, tornam o GHS uma plataforma promissora para melhorar o reparo e a regeneração tecidual2. Diferentes biomateriais têm sido utilizados para a fabricação de GHS, incluindo polímeros sintéticos à base de PEG3,4 e polissacarídeos, como alginato5 e ácido hialurônico 6,7. Dentre os polímeros naturalmente derivados, o biopolímero proteico mais comum para a fabricação de GHS é o GelMA 8,9,10,11, um biomaterial reticulável, biocompatível, bioadesivo e biodegradável 12,13.
As HMPs podem ser fabricadas através de dispositivos microfluídicos de emulsificação em batelada8, focalização de fluxo 14,15 ou emulsificação em passo9,11, mistura 16 ou coacervação complexa17,18. Normalmente, há um trade-off entre o rendimento de fabricação e a monodispersidade do HMP. Por exemplo, a técnica de mistura produz HMPs de forma irregular e altamente polidispersas. A emulsificação em batelada ou coacervação complexa permite a produção de grandes volumes de HMPs esféricas polidispersas<. Em dispositivos microfluídicos de emulsificação em etapas, as etapas altamente paralelizadas permitem a fabricação de HMPs monodispersas19.
Os blocos de construção HMP de gelatina modificada com metacriloíla (GelMA) são termorresponsivos e (foto)quimicamente reticuláveis, permitindo a fácil fabricação de GHS20. Após o resfriamento abaixo da temperatura crítica superior da solução (UCST)21 (por exemplo, a 4 °C), gotículas contendo uma solução de GelMA são convertidas em HMPs reticuladas fisicamente. Esses blocos de construção HMP são então embalados usando forças externas (por exemplo, via centrifugação) para produzir suspensões de microgel emperradas. Ligações interparticuladas são estabelecidas entre HMPs adjacentes via reticulação (foto)química para formar GHS14 mecanicamente robusto. Uma das propriedades mais importantes do GHS é a microporosidade, permitindo fácil penetração celular in vitro11 e maior crescimento tecidual in vivo22. A bioimpressão tridimensional (3D) de HMPs é convencionalmente realizada utilizando suspensões de microgel bem embaladas, comprometendo a microporosidade23.
Recentemente, desenvolvemos uma nova classe de biotintas granulares baseada na nanoengenharia interfacial de microgéis GelMA via adsorção de nanopartículas heterogêneamente carregadas, seguida de automontagem reversível de nanopartículas. Essa estratégia torna os microgéis vagamente embalados produzindo cisalhamento e extrusão 3D bioimprimíveis, o que preserva a porosidade em microescala do GHS11 fabricado aditivamente. Este artigo apresenta os métodos para fabricação de gotículas de GelMA de alto rendimento, convertendo essas gotículas em HMPs fisicamente reticuladas, fabricando HMPs de GelMA usando pó ressuspendível, formação de GelMA GHS, preparação de biotinta granular nanoprojetada (NGB) de GelMA e bioimpressão 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

O surgimento de arcabouços granulares de hidrogel (GHS), fabricados via montagem de micropartículas de hidrogel (HMPs), possibilitou a formação de arcabouços microporosos in situ. Ao contrário dos hidrogéis convencionais a granel, os poros de microescala interconectados no GHS facilitam a infiltração celular independente da degradação, bem como a transferência de oxigênio, nutrientes e subprodutos celulares. A gelatina modificada com metacriloíla (GelMA), um biopolímero (foto)quimicamente reticulável, à base de proteínas, contendo adesivo celular e metades biodegradáveis, tem sido amplamente utilizada como biomaterial responsivo/instrutivo a células. A conversão de GelMA em GHS em massa pode abrir uma infinidade de oportunidades para engenharia e regeneração de tecidos. Neste artigo, demonstramos os procedimentos de fabricação de microgel GelMA de alto rendimento, conversão em microgéis secos ressussuspendíveis (micro-aerogéis), formação de GHS através da montagem química de microgéis e fabricação de biotinta granular para bioimpressão por extrusão. Mostramos como um tratamento físico-químico sequencial via resfriamento e fotoreticulação permite a formação de GHS mecanicamente robusto. Quando a luz é inacessível (por exemplo, durante a injeção de tecidos profundos), HMPs de GelMA reticulados individualmente podem ser montados bioortogonalmente via reticulação enzimática usando transglutaminases. Finalmente, a bioimpressão tridimensional (3D) de GHS microporoso em baixa densidade de empacotamento de HMP é demonstrada através da automontagem interfacial de nanopartículas heterogêneamente carregadas.

O GelMA foi sintetizado através da reação da gelatina com MA, conforme apresentado na Figura 1A. Adaptando-se as condições de reação, tais como a concentração de MA, diferentes graus de substituição de MA foram obtidos. Para quantificar o grau de substituição da MA, o GelMA foi avaliado por espectroscopia de RMN de 1H (Figura 1B). Grupos funcionais de vinil com picos representativos nos deslocamentos químicos de ~5-6 ppm confir...

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Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Este artigo descreve protocolos para a fabricação de microgel de metacriloíla de gelatina de alto rendimento usando dispositivos microfluídicos, conversão de microgéis em pó ressuspendível (micro-aerogéis), montagem química de microgéis para formar arcabouços de hidrogel granular e desenvolvimento de biotintas de hidrogel granulares com microporosidade preservada para bioimpressão 3D.

Suportes de hidrogel granular de metacriloíla de gelatina: fabricação de microgel de alto rendimento, liofilização, montagem química e bioimpressão 3D

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Micropartículas de hidrogel de matriz extracelular ou MEC numéricas podem ser usadas como blocos de construção para a fabricação de andaimes. Este protocolo demonstra a fabricação, purificação, liofilização, montagem de fotos e bioimpressão 3D de micropartículas de metacriloíla de gelatina ou hidrogel GelMA. GelMA é um biopolímero fotoquímico, reticulável, à base de proteínas, contendo adesivo celular e metades biodegradáveis que tem sido amplamente utilizado como um biomaterial instrutivo e responsivo a células.Em comparação com o hidrogel convencional a granel, os suportes de hidrogel granular GelMA são microporosos, permitindo uma rápida infiltração celular que pode ser adaptada pelo tamanho do bloco de construção. Os scaffolds de hidrogel granular GelMA podem abrir novas oportunidades para a bioimpressão 3D de tecidos, órgãos e doenças espessos em plataformas baratas e engenharia regenerativa. Para começar, adicione 10 miligramas de LAP a 10 mililitros de DPBS para preparar uma solução de fotoiniciador a 0,1%.Proteja a solução da luz, envolvendo-a com papel alumínio e rotule-a. Em seguida, dissolver a quantidade desejada de GelMA na solução do fotoiniciador. Coloque a solução embrulhada em folha de alumínio no forno de 37 graus Celsius por uma hora para obter uma solução clara.Para preparar a fase oleosa, faça uma solução de surfactante biocompatível a 2% no fluido de engenharia. Insira o tubo Tygon nas entradas e saídas do dispositivo PDMS e, em seguida, insira uma agulha romba de calibre 25 na outra extremidade do tubo Tygon para entradas. Coloque o dispositivo sob o microscópio e mantenha o ambiente aquecido a aproximadamente 40 graus Celsius usando um secador de cabelo ou um aquecedor de ambiente.Coloque as soluções aquosas e oleosas em seringas separadas conectadas ao dispositivo. Ligue a bomba de seringa para a fase oleosa com uma vazão de 160 microlitros por minuto. Depois que o óleo encher o canal, inicie a fase aquosa a 80 microlitros por minuto.Verifique a formação de gotículas ao microscópio. Coletar as gotículas em um recipiente e avaliá-las na câmara de imagem por microscopia óptica. Mantenha as gotículas a quatro graus Celsius durante a noite, protegendo-as da luz para iniciar a reticulação física do microgel GelMA e converter as gotículas em microgéis estáveis.Para implementar o método de emulsão em pó microprojetado, MEtoP, colete os microgéis reticulados fisicamente no fluido de engenharia usando tubos de microcentrífuga termicamente duráveis ou criofras. Sele o tubo aberto com um lenço e fita adesiva de laboratório. Congelar os microgéis fisicamente reticulados em nitrogênio líquido por 10 minutos para prosseguir com a liofilização.Após liofilização, um pó sólido será obtido. Adicione um mililitro de solução resfriada a 0,1% do fotoiniciador a quatro graus Celsius ao pó liofilizado para fazer suspensões de microgel. Centrifugar a mistura de vórtice a 3.000g por 15 segundos.Depois de descartar o sobrenadante, transfira a suspensão de microgel embalada para um molde usando uma pipeta de deslocamento positivo e exponha à luz no comprimento de onda de 400 nanômetros com uma intensidade de 15 miliwatts por centímetro quadrado por 60 segundos para formar arcabouços de hidrogel granular ou GHS. Para 400 microlitros de suspensão de microgel, adicione uma quantidade igual de solução de PFO gelada, 20% em fluido de engenharia aos microgéis GelMA reticulados fisicamente. Em seguida, centrifugar a mistura de vórtice a 300g por 15 segundos e remover a fase oleosa dos microgéis GelMA por pipetagem.Em seguida, adicione 400 microlitros de solução gelada de fotoiniciador a 0,1% à suspensão de microgel. Depois de centrifugar a solução de vórtice a 300g por 15 segundos, descarte o óleo. Repita as etapas de adição e centrifugação da solução do fotoiniciador, mas centrifugar a 3.000g desta vez e descartar o sobrenadante dos microgéis GelMA embalados.Transfira os microgéis GelMA embalados para um molde, seguido de exposição à luz para formar o GHS. Adicione 100 miligramas de pó de nanoplaquetas a três mililitros de água gelada e ultrapura para formar uma dispersão de nanopartículas de 3,33%. Vórtice a dispersão vigorosamente dentro de um refrigerador de quatro graus Celsius por 15 minutos para esfoliar as nanopartículas agregadas.Nanopartículas adequadamente esfoliadas produzem uma dispersão clara. Dissolva 50 miligramas de LAP em cinco mililitros de água gelada e ultrapura para preparar uma solução estoque de fotoiniciador a 1%. Em seguida, adicione 333 microlitros de solução fotoiniciadora a 1% à dispersão de nanopartículas esfoliadas e envolva-a em papel alumínio para proteger contra a luz ambiente.Vórtice a mistura por um minuto para misturar a dispersão de nanopartículas e o fotoiniciador. Adicione PFO gelado, 20% em fluido de engenharia aos microgéis GelMA reticulados fisicamente em uma relação de volume de um para um. Após centrifugar a mistura de vórtice a 300g por 15 segundos, descarte a fase oleosa que contém o tensoativo.Adicione a dispersão de nanopartículas gelada e suplementada com ALP aos microgéis GelMA lavados. Após centrifugar a 3.000g por 15 segundos, descarte o óleo restante no fundo e a dispersão do sobrenadante. Armazene a suspensão a quatro graus Celsius enquanto a protege da luz usando papel alumínio por um dia para produzir o produto GelMA nanoengineered granular bioink ou NGB.No dia seguinte, carregue o NGB em uma seringa de três mililitros. Sele a seringa carregada com tampa e parafilme e faça uma centrifugação por pulso a 200g para remover o ar aprisionado. Transfira a biotinta para um cartucho de três mililitros usando um conector Luer fêmea-fêmea.Centrifugar o cartucho brevemente a 200g novamente para remover o ar preso e manter o NGB a quatro graus Celsius antes de usar. Em seguida, carregue a suspensão de células de fibroblastos murinos preparada em uma seringa de três mililitros. Junte o NGB e as seringas carregadas com células usando um conector Luer fêmea-fêmea e misture o conteúdo suavemente empurrando para frente e para trás 40 vezes.Imprima o NGB ou NGB carregado de células usando uma bioimpressora apropriada com um bocal cônico padrão carregando o bocal na cabeça de impressão de três mililitros. Mantenha a temperatura da cama de impressão abaixo de 10 graus Celsius e otimize parâmetros como velocidade e contrapressão. Selecione o arquivo gcode ou STL desejável.Em seguida, selecione o substrato e o tipo de bico para uma seringa pneumática de três mililitros equipada com um bico cônico padrão. Calibre a bioimpressora usando as diretrizes do dispositivo e comece a imprimir para obter as estruturas 3D. A tecnologia MEtoP produziu pó de microgel seco ressuspendível por liofilização a baixa pressão, protegendo os microgéis da agregação e deformação severa.As imagens de MEV mostraram que as micropartículas secas de GelMA usando esta tecnologia mantêm sua forma esférica após liofilização em comparação com a agregação observada com a liofilização convencional. A caracterização de microporos de GelMA, GHS e NGB com um corante de fluorescência de alto peso molecular mostrou os espaços vazios de microescala interconectados. Além disso, a imagem de fluorescência avaliada usando um script MATLAB personalizado detectou os poros.As medidas de fração de vazio e diâmetro equivalente de poro mediano não mostraram diferença significativa atestando a disponibilidade e interconectividade de poros em microescala nos scaffolds impressos em 3D usando o NGB. A superioridade dos scaffolds NGB em relação aos microgéis GelMA compactados e apertados pela medida do comprimento do filamento suspenso revelou que NGB tinha um comprimento maior do que os microgéis embalados. Os microgéis frouxamente embalados não produziram filamentos.Um cilindro oco foi impresso em 3D, e toda a construção foi exposta à luz para fotoreticulação. A estrutura impressa foi fisicamente mantida para mostrar a forma, fidelidade e integridade estrutural. Se o andaime for usado para avaliação biológica, por exemplo, na bioimpressão carregada de células, lembre-se de realizar todas as etapas sob determinadas condições, sob o gabinete de segurança biológica.Esperamos descomercializar o uso de arcabouços de hidrogel granular como uma plataforma de biomateriais recém-emergida em biomedicina.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D impresso celulose porosa nanocompósitos Hydrogel andaimes

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Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

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