Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Т. Понда, специалиста по поддержке исследований на кафедре химической инженерии Университета штата Пенсильвания (штат Пенсильвания), сотрудников лаборатории нанотехнологий в штате Пенсильвания и доктора Дж. А. Шейхи выражает признательность за поддержку Научно-исследовательского института материалов (MRI) и Колледжа инженерных материалов на начальных грантах человеческого уровня, Центра конвергенции живых многофункциональных материальных систем (LiMC2) и Кластера передового опыта живых, адаптивных и энергоавтономных систем материалов (livMatS) Программы грантов для совместных исследований живых многофункциональных материалов, а также фонда стартапов штата Пенсильвания. Исследования, представленные в этой публикации, были частично поддержаны Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии (NIBIB) Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером R56EB032672.

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе.
1. Синтез GelMA
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез GelMA должен проводиться в химическом вытяжном шкафу, и...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

Желатин и его производные являются наиболее часто используемыми биоматериалами на основе белка для изготовления HMP. Проблема компромисса между пропускной способностью и монодисперсностью размера частиц может быть решена с помощью микрофлюидных устройств со ступенчатой эмульгацией....

Сборка строительных блоков HMP для формирования каркасов тканевой инженерии привлекла огромное внимание в последние несколько лет1. GHS, изготовленные с помощью сборки HMP, обладают уникальными свойствами по сравнению со своими объемными аналогами, включая микропористость в масштабе ячейки, происходящую из пустых пространств среди дискретных строительных блоков. Дополнительные свойства, такие как инъекционность, модульность и отделенная жесткость от пористости, делают GHS многообещающей платформой для улучшения восстановления и регенерации тканей2. Для изготовления СГС использовались различные биоматериалы, в том числе синтетические полимеры на основе ПЭГ3,4 и полисахариды, такие как альгинат5 и гиалуроновая кислота 6,7. Среди полимеров природного происхождения наиболее распространенным биополимером на основе белка для изготовления СГС является GelMA 8,9,10,11, сшиваемый, биосовместимый, биоадгезивный и биоразлагаемый биоматериал 12,13.
ГМП могут быть изготовлены с помощью периодического эмульгирования 8, фокусировкипотока 14,15 или ступенчатого эмульгирования9,11 микрофлюидных устройств, смешивания 16 или комплексной коацервации17,18. Обычно существует компромисс между производительностью производства и монодисперсностью HMP. Например, метод смешивания позволяет получить ГМП неправильной формы и с высокой полидисперсностью. Периодическое эмульгирование или сложное коацервация позволяет производить большие объемы полидисперсных сферических ГМП. Микрофлюидные устройства, фокусирующие поток, использовались для изготовления высокомонодисперсных капель с коэффициентом вариации <5%, однако пропускная способность значительно ниже. В микрофлюидных устройствах ступенчатого эмульгирования ступени с высокой степенью распараллеливания обеспечивают высокую пропускную способность изготовления монодисперсных HMP19.
Модифицированные метакрилоилом желатиновые (GelMA) строительные блоки HMP являются термочувствительными и (фото)химически сшиваемыми, что позволяет легко изготавливать СГС20. При охлаждении ниже верхней критической температуры раствора (UCST)21 (например, при 4 °C) капли, содержащие раствор GelMA, превращаются в физически сшитые HMP. Затем эти строительные блоки HMP упаковываются с использованием внешних сил (например, с помощью центрифугирования) с образованием застрявших микрогелевых суспензий. Межчастичные связи устанавливаются между соседними HMP посредством (фото)химического сшивания с образованием механически прочного GHS14. Одним из наиболее важных свойств СГС является микропористость, обеспечивающая легкое проникновение клеток in vitro11 и усиленное врастание тканей in vivo22. Трехмерная (3D) биопечать ГМП обычно выполняется с использованием плотно упакованных микрогелевых суспензий, что снижает микропористость23.
Недавно мы разработали новый класс гранулированных биочернил, основанный на межфазной наноинженерии микрогелей GelMA путем адсорбции гетерогенных заряженных наночастиц с последующей обратимой самосборкой наночастиц. Эта стратегия делает неплотно упакованные микрогели пригодными для сдвига и экструзии 3D-биопечати, что сохраняет микромасштабную пористость GHS11, изготовленного аддитивно. В этой статье представлены методы высокопроизводительного изготовления капель GelMA, преобразования этих капель в физически сшитые HMP, изготовления HMP GelMA с использованием ресуспендируемого порошка, формирования GelMA GHS, получения наноинженерных гранулированных биочернил GelMA (NGB) и 3D-биопечати.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

Появление гранулированных гидрогелевых каркасов (GHS), изготовленных путем сборки гидрогелевых микрочастиц (HMP), позволило образовать микропористые каркасы in situ. В отличие от обычных объемных гидрогелей, взаимосвязанные микромасштабные поры в СГС облегчают независимую от деградации клеточную инфильтрацию, а также перенос кислорода, питательных веществ и клеточных побочных продуктов. Модифицированный метакрилоилом желатин (GelMA), (фото)химически сшиваемый биополимер на основе белка, содержащий клеточный клей и биоразлагаемые фрагменты, широко используется в качестве клеточно-чувствительного / инструктивного биоматериала. Преобразование объемного GelMA в GHS может открыть множество возможностей для тканевой инженерии и регенерации. В этой статье мы демонстрируем процедуры высокопроизводительного изготовления микрогелей GelMA, превращения в ресуспендируемые сухие микрогели (микроаэрогели), формирования GHS путем химической сборки микрогелей и изготовления гранулированных биочернил для экструзионной биопечати. Мы показываем, как последовательная физико-химическая обработка с помощью охлаждения и фотосшивания позволяет формировать механически прочную СГС. Когда свет недоступен (например, во время глубокой инъекции в ткани), индивидуально сшитые HMP GelMA могут быть биоортогонально собраны с помощью ферментативного сшивания с использованием трансглутаминаз. Наконец, трехмерная (3D) биопечать микропористых GHS при низкой плотности упаковки HMP демонстрируется с помощью межфазной самосборки гетерогенных заряженных наночастиц.

GelMA был синтезирован в результате реакции желатина с MA, как показано на рисунке 1А. Путем адаптации условий реакции, таких как концентрация МА, были получены различные степени замещения МА. Для количественной оценки степени замещения MA GelMA оценивали с помощью 1-час...

Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

В данной статье описываются протоколы изготовления высокопроизводительных желатиновых метакрилоиловых микрогелей с использованием микрофлюидных устройств, превращения микрогелей в ресуспендируемый порошок (микроаэрогели), химической сборки микрогелей с образованием гранулированных гидрогелевых каркасов и разработки гранулированных гидрогелевых биочернил с сохраненной микропористостью для 3D-биопечати.

Желатиновые метакрилоилгранулированные гидрогелевые каркасы: высокопроизводительное изготовление микрогелей, лиофилизация, химическая сборка и 3D-биопечать

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Внеклеточный матрикс или микрочастицы цифрового гидрогеля ECM могут быть использованы в качестве строительных блоков для изготовления каркасов. Этот протокол демонстрирует изготовление, очистку, лиофилизацию, фотосборку и 3D-биопечать желатиновых метакрилоиловых или гидрогелевых микрочастиц GelMA. GelMA представляет собой фотохимически сшиваемый биополимер на основе белка, содержащий клеточный клей и биоразлагаемые фрагменты, который широко используется в качестве клеточно-чувствительного и поучительного биоматериала.По сравнению с обычным сыпучим гидрогелем, гранулированные гидрогелевые каркасы GelMA являются микропористыми, что обеспечивает быструю инфильтрацию клеток, которая может быть адаптирована к размеру строительного блока. Гранулированные гидрогелевые каркасы GelMA могут открыть новые возможности для 3D-биопечати толстых тканей, органов и заболеваний на дешевых платформах и регенеративной инженерии. Для начала добавьте 10 миллиграммов LAP к 10 миллилитрам DPBS, чтобы приготовить 0,1%-ный раствор фотоинициатора.Защитите раствор от света, обернув его алюминиевой фольгой, и промаркируйте. Далее растворяют нужное количество GelMA в растворе фотоинициатора. Поместите раствор, обернутый алюминиевой фольгой, в духовку при температуре 37 градусов Цельсия на один час, чтобы получить прозрачный раствор.Чтобы приготовить масляную фазу, сделайте 2%-ный биосовместимый раствор поверхностно-активного вещества в инженерной жидкости. Вставьте трубку Tygon во входные и выходные отверстия устройства PDMS, затем вставьте тупую иглу 25-го калибра в другой конец трубки Tygon для входных отверстий. Поместите устройство под микроскоп и поддерживайте тепло окружающей среды примерно при температуре 40 градусов по Цельсию с помощью фена или обогревателя.Загрузите водные и масляные растворы в отдельные шприцы, подключенные к устройству. Запустите шприцевой насос для масляной фазы с расходом 160 микролитров в минуту. После того, как масло заполнит канал, начните водную фазу со скоростью 80 микролитров в минуту.Проверьте образование капель под микроскопом. Соберите капли в контейнер и оцените их в камере визуализации с помощью оптической микроскопии. Держите капли при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи, защищая их от света, чтобы инициировать физическое сшивание микрогеля GelMA и преобразовать капли в стабильные микрогели.Для реализации микроинженерного метода превращения эмульсии в порошок (MEtoP) собирайте физически сшитые микрогели в конструкционную жидкость с помощью термически прочных микроцентрифужных пробирок или криовиалов. Закройте открытую пробирку лабораторной салфеткой и скотчем. Замораживайте физически сшитые микрогели в жидком азоте в течение 10 минут, чтобы продолжить лиофилизацию.После лиофилизации получится твердый порошок. Добавьте один миллилитр охлажденного 0,1% раствора фотоинициатора при четырех градусах Цельсия в лиофилизированный порошок, чтобы получить микрогелевые суспензии. Центрифугируйте вихревую смесь при 3 000 г в течение 15 секунд.После отбрасывания надосадочной жидкости перенесите упакованную микрогелевую суспензию в форму с помощью пипетки с положительным смещением и подвергните ее воздействию света на длине волны 400 нанометров с интенсивностью 15 милливатт на квадратный сантиметр в течение 60 секунд, чтобы сформировать гранулированные гидрогелевые каркасы или GHS. Для получения 400 микрогелей суспензии добавьте равное количество ледяного раствора PFO, 20% в инженерной жидкости к физически сшитым микрогелям GelMA. Затем центрифугируйте вихревую смесь при 300 г в течение 15 секунд и удалите масляную фазу из микрогелей GelMA с помощью пипетки.Затем добавьте 400 микролитров ледяного 0,1%-ного раствора фотоинициатора в микрогелевую суспензию. После центрифугирования вихревого раствора при 300 г в течение 15 секунд выбросьте масло. Повторите этапы добавления раствора фотоинициатора и центрифугирования, но на этот раз центрифугу на 3 000 г и выбросьте надосадочную жидкость упакованных микрогелей GelMA.Перенесите упакованные микрогели GelMA в форму с последующим воздействием света для образования GHS. Добавьте 100 миллиграммов порошка нанотромбоцитов к трем миллилитрам ледяной сверхчистой воды, чтобы получить дисперсию наночастиц 3,33%. Энергично встряхните дисперсию в холодильнике с температурой четыре градуса Цельсия в течение 15 минут, чтобы отшелушить агрегированные наночастицы.Правильно отслоенные наночастицы дают четкую дисперсию. Растворите 50 миллиграммов LAP в пяти миллилитрах ледяной сверхчистой воды, чтобы приготовить 1%-ный раствор фотоинициатора. Затем добавьте 333 микролитра 1%-ного раствора фотоинициатора в расслоенную дисперсию наночастиц и заверните ее в алюминиевую фольгу для защиты от окружающего света.Встряхните смесь в течение одной минуты, чтобы смешать дисперсию наночастиц и фотоинициатор. Добавьте ледяной PFO, 20% в инженерной жидкости в физически сшитые микрогели GelMA в объемном соотношении один к одному. После центрифугирования вихревой смеси при 300 г в течение 15 секунд выбросьте масляную фазу, содержащую поверхностно-активное вещество.Добавьте ледяную дисперсию наночастиц с добавлением LAP в промытые микрогели GelMA. После центрифугирования при 3 000 г в течение 15 секунд выбросьте оставшееся масло на дно и надосадочную дисперсию. Храните суспензию при температуре четыре градуса Цельсия, защищая ее от света алюминиевой фольгой в течение одного дня, чтобы получить продукт GelMA, наноинженерные гранулированные биочернила или NGB.На следующий день загрузите NGB в трехмиллилитровый шприц. Запечатайте загруженный шприц колпачком и парапленкой и проведите импульсное центрифугирование при 200 г, чтобы удалить захваченный воздух. Перенесите биочернила в трехмиллилитровый картридж с помощью разъема замка Luer «мама-мама».Снова ненадолго центрифугируйте картридж на 200 г, чтобы удалить захваченный воздух, и перед использованием поддерживайте NGB при четырех градусах Цельсия. Затем загрузите подготовленную суспензию клеток фибробластов мыши в трехмиллилитровый шприц. Соедините шприцы NGB и шприцы, загруженные клетками, с помощью разъема замка Луера «мама-мама», и аккуратно перемешайте содержимое, нажимая вперед и назад 40 раз.Распечатайте NGB или NGB с ячейками с помощью соответствующего биопринтера со стандартным коническим соплом, загрузив сопло в печатающую головку объемом три миллилитра. Поддерживайте температуру печатного стола ниже 10 градусов по Цельсию и оптимизируйте такие параметры, как скорость и противодавление. Выберите нужный файл gcode или STL.Затем выбирают подложку и тип насадки для пневматического трехмиллилитрового шприца, оснащенного стандартной конической насадкой. Откалибруйте биопринтер, следуя инструкциям по устройству, и начните печать, чтобы получить 3D-структуры. Технология MEtoP позволяет получить ресуспендируемый высушенный порошок микрогеля путем сублимационной сушки под низким давлением, защищая микрогели от агрегации и сильной деформации.Изображения SEM показали, что высушенные микрочастицы GelMA с использованием этой технологии сохраняют свою сферическую форму после лиофилизации по сравнению с агрегацией, наблюдаемой при обычной лиофилизации. Характеристика микропор GelMA, GHS и NGB с высокомолекулярным флуоресцентным красителем показала взаимосвязанные микромасштабные пустотные пространства. Кроме того, флуоресцентное изображение, оцененное с использованием специально написанного сценария MATLAB, обнаружило поры.Измерения доли пустот и эквивалентного диаметра медианных пор не показали существенной разницы, свидетельствующей о наличии и взаимосвязи микромасштабных пор в 3D-печатных каркасах с использованием NGB. Превосходство скаффолдов NGB над плотно и свободно упакованными микрогелями GelMA путем измерения длины висячей нити показало, что NGB имеет большую длину, чем упакованные микрогели. Неплотно упакованные микрогели не давали нитей.Полый цилиндр был напечатан на 3D-принтере, и вся конструкция была подвергнута воздействию света для фотосшивания. Печатная структура была физически удерживаема, чтобы показать форму, точность и структурную целостность. Если каркас используется для биологической оценки, например, при биопечати с нагрузкой на клетки, не забудьте выполнить все шаги при определенных условиях в шкафу биологической безопасности.Мы надеемся вывести на рынок использование гранулированных гидрогелевых каркасов в качестве недавно появившейся платформы биоматериала в биомедицине.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Гидрогель Строительные леса для суставной хондроцит культуры и хряща поколения

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Создаёт Использование Тканеспецифическая гидрогелевых Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Альгинатные/желатин гидрогеля 3D в Vitro модель системы вызывать клетки сфероида образование

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D печать пористых целлюлозы нанокомпозитных гидрогеля подмости

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Протоколы 3D биопечати желатина Methacryloyl Гидрогель на основе биоинков

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Взаимосвязанные макропористые 3D-каркасы из микрогелевых стержней

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Синтез сильного адгезивного гидрогеля, желатина О-нитрозобензальдегида

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

Агарозные жидкие гели, образованные сдвиговой обработкой во время гелеобразования для суспензионной 3D-биопечати

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...