Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Los autores desean agradecer a T. Pond, especialista en apoyo a la investigación en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad Estatal de Pensilvania (Penn State), al personal del Laboratorio de Nanofabricación de Penn State y al Dr. J. de Rutte de Partillion Bioscience por la ayuda y la discusión sobre los procesos de nanofabricación. A. Sheikhi reconoce el apoyo de las subvenciones iniciales del Instituto de Investigación de Materiales (MRI) y la Facultad de Ingeniería de Materiales Materiales Materia a Nivel Humano, el Centro de Convergencia para Sistemas de Materiales Multifuncionales Vivos (LiMC2) y el Programa de Subvenciones de Investigación Colaborativa de Materiales Vivos, Adaptativos y Energéticamente Autónomos del Clúster de Excelencia (livMatS) y el fondo de inicio de Penn State. La investigación reportada en esta publicación fue parcialmente apoyada por el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio R56EB032672.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Síntesis de GelMA
NOTA: La síntesis de GelMA debe realizarse en una campana extractora de humos químicos, y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado todo el tiempo.
<ol><li>Añadir 200 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 1x) ...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

La gelatina y sus derivados son los biomateriales a base de proteínas más utilizados para la fabricación de HMP. El desafío del equilibrio entre el rendimiento y la monodispersidad del tamaño de partícula se puede superar utilizando dispositivos microfluídicos de emulsificación escalonada. Estos dispositivos son capaces de formar más de 40 millones de gotas por hora, con un coeficiente de variación inferior al 5%27. En este artículo, discutimos la microfabricación de gotas que contiene...

El ensamblaje de bloques de construcción HMP para formar andamios de ingeniería de tejidos ha ganado una gran atención en los últimos años1. GHS, fabricado a través del ensamblaje HMP, tiene propiedades únicas en comparación con sus contrapartes a granel, incluida la microporosidad a escala celular que se origina en los espacios vacíos entre los bloques de construcción discretos. Las propiedades adicionales, como la inyectabilidad, la modularidad y la rigidez desacoplada de la porosidad, hacen de GHS una plataforma prometedora para mejorar la reparación y regeneración de tejidos2. Se han utilizado diferentes biomateriales para la fabricación de GHS, incluidos polímeros sintéticos basados en PEG3,4 y polisacáridos, como el alginato5 y el ácido hialurónico 6,7. Entre los polímeros de origen natural, el biopolímero a base de proteínas más común para la fabricación de GHS es GelMA 8,9,10,11, un biomaterial reticulado, biocompatible, bioadhesivo y biodegradable 12,13.
Los HMP pueden fabricarse mediante emulsificación por lotes8, dispositivos microfluídicos de concentración de flujo 14,15 o emulsificación escalonada9,11, mezcla 16 o coacervación compleja17,18. Por lo general, existe una compensación entre el rendimiento de fabricación y la monodispersión de HMP. Por ejemplo, la técnica de mezcla produce HMP de forma irregular y altamente polidispersos. La emulsificación por lotes o la coacervación compleja permiten la producción de grandes volúmenes de HMP esféricas polidispersas. Los dispositivos microfluídicos de enfoque de flujo se han utilizado para fabricar gotas altamente monodispersas con un coeficiente de variación del <5%, sin embargo, el rendimiento es significativamente bajo. En los dispositivos microfluídicos de emulsificación escalonada, los pasos altamente paralelizados permiten la fabricación de alto rendimiento de HMP monodispersos19.
Los bloques de construcción HMP de gelatina modificada con metacriloilo (GelMA) son termosensibles y (foto) reticulables químicamente, lo que permite una fácil fabricación GHS20. Al enfriarse por debajo de la temperatura superior de la solución crítica (UCST)21 (por ejemplo, a 4 °C), las gotas que contienen una solución de GelMA se convierten en HMP reticuladas físicamente. Estos bloques de construcción de HMP se empaquetan utilizando fuerzas externas (por ejemplo, mediante centrifugación) para producir suspensiones de microgel atascadas. Los enlaces entre partículas se establecen entre HMP adyacentes a través de reticulación (foto)química para formar GHS14 mecánicamente robusto. Una de las propiedades más importantes del GHS es la microporosidad, lo que permite una fácil penetración celular in vitro11 y un mayor crecimiento tisular in vivo22. La bioimpresión tridimensional (3D) de HMP se realiza convencionalmente utilizando suspensiones de microgel apretadas, comprometiendo la microporosidad23.
Recientemente hemos desarrollado una nueva clase de biotintas granulares basadas en la nanoingeniería interfacial de microgeles GelMA a través de la adsorción de nanopartículas cargadas heterogéneamente, seguidas de autoensamblaje reversible de nanopartículas. Esta estrategia hace que los microgeles sueltos producidos por cizallamiento y extrusión sean bioimprimibles en 3D, lo que preserva la porosidad a microescala del GHS11 fabricado aditivamente. Este artículo presenta los métodos para la fabricación de gotas GelMA de alto rendimiento, la conversión de estas gotas en HMP reticuladas físicamente, la fabricación de HMP GelMA utilizando polvo resuspendible, la formación de GelMA GHS, la preparación de biotinta granular (NGB) de nanoingeniería GelMA y la bioimpresión 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

La aparición de andamios de hidrogel granular (GHS), fabricados mediante el ensamblaje de micropartículas de hidrogel (HMP), ha permitido la formación de andamios microporosos in situ. A diferencia de los hidrogeles a granel convencionales, los poros interconectados a microescala en GHS facilitan la infiltración celular independiente de la degradación, así como la transferencia de oxígeno, nutrientes y subproductos celulares. La gelatina modificada con metacriloilo (GelMA), un biopolímero a base de proteínas (foto)químicamente reticulado que contiene adhesivo celular y restos biodegradables, se ha utilizado ampliamente como biomaterial instructivo / sensible a las células. La conversión de GelMA a granel a GHS puede abrir una gran cantidad de oportunidades para la ingeniería y regeneración de tejidos. En este artículo, demostramos los procedimientos de fabricación de microgel GelMA de alto rendimiento, conversión a microgeles secos resuspendibles (micro-aerogeles), formación de GHS a través del ensamblaje químico de microgeles y fabricación de biotinta granular para bioimpresión por extrusión. Mostramos cómo un tratamiento fisicoquímico secuencial a través de enfriamiento y fotoreticulación permite la formación de GHS mecánicamente robusto. Cuando la luz es inaccesible (por ejemplo, durante la inyección de tejido profundo), los HMP de GelMA reticulados individualmente pueden ensamblarse bioortogonalmente a través de la reticulación enzimática utilizando transglutaminasas. Finalmente, la bioimpresión tridimensional (3D) de GHS microporoso a baja densidad de empaquetamiento HMP se demuestra a través del autoensamblaje interfacial de nanopartículas cargadas heterogéneamente.

GelMA se sintetizó a través de la reacción de gelatina con MA, como se presenta en la Figura 1A. Al adaptar las condiciones de reacción, como la concentración de MA, se obtuvieron diferentes grados de sustitución de MA. Para cuantificar el grado de sustitución de MA, se evaluó GelMA mediante espectroscopia de RMN 1H (Figura 1B). Los grupos funcionales de vinilo con picos representativos en los cambios químicos de ~ 5-6 ppm confirmar...

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Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Este artículo describe los protocolos para la fabricación de microgel de metacriloilo de gelatina de alto rendimiento utilizando dispositivos microfluídicos, la conversión de microgeles en polvo resuspendible (micro-aerogeles), el ensamblaje químico de microgeles para formar andamios de hidrogel granular y el desarrollo de biotintas de hidrogel granular con microporosidad preservada para bioimpresión 3D.

Andamios de hidrogel granular de metacriloilo de gelatina: fabricación de microgel de alto rendimiento, liofilización, ensamblaje químico y bioimpresión 3D

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Las micropartículas de hidrogel numérico de matriz extracelular o ECM se pueden usar como bloques de construcción para la fabricación de andamios. Este protocolo demuestra la fabricación, purificación, liofilización, ensamblaje fotográfico y bioimpresión 3D de micropartículas de gelatina de metacriloilo o hidrogel GelMA. GelMA es un biopolímero fotoquímico, reticulado, a base de proteínas que contiene adhesivo celular y restos biodegradables que ha sido ampliamente utilizado como un biomaterial instructivo y sensible a las células.En comparación con el hidrogel a granel convencional, los andamios de hidrogel granular GelMA son microporosos, lo que permite una rápida infiltración celular que se puede adaptar según el tamaño del bloque de construcción. Los andamios de hidrogel granular GelMA pueden abrir nuevas oportunidades para la bioimpresión 3D de tejidos gruesos, órganos y enfermedades en plataformas baratas e ingeniería regenerativa. Para comenzar, agregue 10 miligramos de LAP a 10 mililitros de DPBS para preparar una solución de fotoiniciador al 0.1%.Proteja la solución de la luz envolviéndola con papel de aluminio y etiquétela. A continuación, disuelva la cantidad deseada de GelMA en la solución del fotoiniciador. Coloque la solución envuelta en papel de aluminio en el horno de 37 grados centígrados durante una hora para obtener una solución transparente.Para preparar la fase oleosa, haga una solución de surfactante biocompatible al 2% en el fluido de ingeniería. Inserte el tubo Tygon en las entradas y salidas del dispositivo PDMS, luego inserte una aguja roma de calibre 25 en el otro extremo del tubo Tygon para las entradas. Coloque el dispositivo bajo el microscopio y mantenga el ambiente caliente a aproximadamente 40 grados centígrados con un secador de pelo o un calentador de espacio.Cargue las soluciones acuosa y de aceite en jeringas separadas conectadas al dispositivo. Arranque la bomba de jeringa para la fase oleosa con un caudal de 160 microlitros por minuto. Después de que el aceite llene el canal, comience la fase acuosa a 80 microlitros por minuto.Verifique la formación de gotitas bajo el microscopio. Recoja las gotitas en un recipiente y evalúelas en la cámara de imágenes mediante microscopía óptica. Mantenga las gotitas a cuatro grados centígrados durante la noche mientras las protege de la luz para iniciar la reticulación física del microgel GelMA y convertir las gotitas en microgeles estables.Para implementar el método de emulsión a polvo de microingeniería, MEtoP, recolecte los microgeles reticulados físicamente en el fluido de ingeniería utilizando tubos de microcentrífuga o crioviales térmicamente duraderos. Selle el tubo abierto con una toallita de laboratorio y cinta adhesiva. Congele los microgeles físicamente reticulados en nitrógeno líquido durante 10 minutos para proceder con la liofilización.Después de la liofilización, se obtendrá un polvo sólido. Agregue un mililitro de solución fotoiniciadora enfriada al 0,1% a cuatro grados centígrados al polvo liofilizado para hacer suspensiones de microgel. Centrifugar la mezcla de vórtice a 3, 000 g durante 15 segundos.Después de desechar el sobrenadante, transfiera la suspensión de microgel empaquetada a un molde usando una pipeta de desplazamiento positivo y expóngala a la luz a una longitud de onda de 400 nanómetros con una intensidad de 15 milivatios por centímetro cuadrado durante 60 segundos para formar andamios de hidrogel granular o GHS. Para 400 microlitros de suspensión de microgel, agregue una cantidad igual de solución de PFO helada, 20% en fluido de ingeniería a los microgeles GelMA físicamente reticulados. A continuación, centrifugar la mezcla de vórtice a 300 g durante 15 segundos y eliminar la fase oleosa de los microgeles GelMA mediante pipeteo.Luego agregue 400 microlitros de solución fotoiniciadora helada al 0.1% a la suspensión de microgel. Después de centrifugar la solución de vórtice a 300 g durante 15 segundos, deseche el aceite. Repita los pasos de adición de solución fotoiniciadora y centrifugación, pero centrifugar a 3.000 g esta vez y desechar el sobrenadante de los microgeles GelMA envasados.Transfiera los microgeles GelMA envasados a un molde, seguido de una exposición a la luz para formar el GHS. Agregue 100 miligramos de polvo de nanoplaquetas a tres mililitros de agua ultrapura helada para formar una dispersión de nanopartículas al 3,33%. Vortex la dispersión vigorosamente dentro de un refrigerador de cuatro grados centígrados durante 15 minutos para exfoliar las nanopartículas agregadas.Las nanopartículas correctamente exfoliadas producen una clara dispersión. Disuelva 50 miligramos de LAP en cinco mililitros de agua ultrapura helada para preparar una solución madre de fotoiniciador al 1%. Luego agregue 333 microlitros de solución fotoiniciadora al 1% a la dispersión de nanopartículas exfoliadas y envuélvala en papel de aluminio para protegerla contra la luz ambiental.Vortex la mezcla durante un minuto para mezclar la dispersión de nanopartículas y el fotoiniciador. Agregue PFO helado, 20% en fluido de ingeniería a los microgeles GelMA físicamente reticulados en una proporción de volumen de uno a uno. Después de centrifugar la mezcla de vórtice a 300 g durante 15 segundos, deseche la fase oleosa que contiene el surfactante.Agregue la dispersión de nanopartículas suplementada con LAP helada a los microgeles GelMA lavados. Después de centrifugar a 3, 000 g durante 15 segundos, deseche el aceite restante en el fondo y la dispersión sobrenadante. Almacene la suspensión a cuatro grados centígrados mientras la protege de la luz con papel de aluminio durante un día para producir el producto GelMA biotinta granular de nanoingeniería o NGB.Al día siguiente, cargue el NGB en una jeringa de tres mililitros. Selle la jeringa cargada con una tapa y una parapelícula, y realice una centrifugación por pulso a 200 g para eliminar el aire atrapado. Transfiera la biotinta a un cartucho de tres mililitros utilizando un conector Luer hembra-hembra.Centrifugar el cartucho brevemente a 200 g de nuevo para eliminar el aire atrapado, y mantener el NGB a cuatro grados centígrados antes de su uso. A continuación, cargue la suspensión de células de fibroblastos murinos preparada en una jeringa de tres mililitros. Acople el NGB y las jeringas cargadas con células usando un conector Luer hembra-hembra, y mezcle el contenido suavemente empujando hacia adelante y hacia atrás 40 veces.Imprima el NGB o NGB cargado de células utilizando una bioimpresora adecuada con una boquilla cónica estándar cargando la boquilla en el cabezal de impresión de tres mililitros. Mantenga la temperatura de la cama de impresión por debajo de 10 grados centígrados y optimice parámetros como la velocidad y la contrapresión. Seleccione el archivo gcode o STL deseado.A continuación, seleccione el sustrato y el tipo de boquilla para una jeringa neumática de tres mililitros equipada con una boquilla cónica estándar. Calibre la bioimpresora utilizando las pautas del dispositivo y comience a imprimir para obtener las estructuras 3D. La tecnología MEtoP produjo polvo de microgel seco resuspendible mediante liofilización a baja presión al tiempo que protegía los microgeles de la agregación y la deformación severa.Las imágenes SEM mostraron que las micropartículas secas de GelMA que utilizan esta tecnología conservan su forma esférica después de la liofilización en comparación con la agregación observada con la liofilización convencional. La caracterización de microporos de GelMA, GHS y NGB con un colorante de fluorescencia de alto peso molecular mostró los espacios vacíos de microescala interconectados. Además, la imagen de fluorescencia evaluada mediante un script de MATLAB escrito a medida detectó los poros.Las mediciones de la fracción vacía y el diámetro equivalente de poro mediano no mostraron diferencias significativas que atestigüen la disponibilidad e interconectividad de los poros a microescala en los andamios impresos en 3D utilizando el NGB. La superioridad de los andamios NGB a los microgeles GelMA apretados y sueltos por la medición de la longitud del filamento colgante reveló que NGB tenía una longitud mayor que los microgeles empaquetados. Los microgeles sueltos no produjeron filamentos.Se imprimió en 3D un cilindro hueco y toda la construcción se expuso a la luz para la reticulación. La estructura impresa se sostuvo físicamente para mostrar la forma, la fidelidad y la integridad estructural. Si el andamio se utiliza para la evaluación biológica, por ejemplo, en la bioimpresión cargada de células, recuerde realizar todos los pasos bajo ciertas condiciones, bajo el gabinete de seguridad biológica.Esperamos descomercializar el uso de andamios de hidrogel granular como una plataforma de biomateriales recientemente surgida en biomedicina.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Investigación

Bioingeniería

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D impreso celulosa poroso nanocompuesto hidrogel andamios

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

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Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

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Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...

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The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...