Name: gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Författarna vill tacka T. Pond, forskningsstödsspecialist vid Institutionen för kemiteknik vid Pennsylvania State University (Penn State), Nanofabrication Lab-personalen vid Penn State och Dr. J. de Rutte från Partillion Bioscience för hjälp och diskussion om nanofabrikationsprocesser. A. Sheikhi erkänner stödet från Materials Research Institute (MRI) och College of Engineering Materials Matter på Human Level fröbidrag, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) och Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program och startfonden från Penn State. Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes delvis av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) vid National Institutes of Health (NIH) under tilldelningsnummer R56EB032672.

Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, instrument och reagenser som används i detta protokoll.
1. GelMA syntes
OBS: GelMA-syntes bör utföras i en kemisk dragskåp och korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) ska användas hela tiden.
<ol><li>Tillsätt 200 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS, 1x) till en Erlenmeyerkolv och värm lösningen tills den når 50 °C. Täck kolven med alumin...

<ol>
	<li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgel+assembly:+Fabrication,+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li><li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing.">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting.">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).</li><li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sticking+together:+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking.">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115 (2022).</li><li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks.">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li><li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication.">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).</li><li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering.">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li><li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability,+strong+adhesion,+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care.">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).</li><li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting.">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390 (2022).</li><li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine.">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li><li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair.">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+fabricating+modular+hydrogels+from+macromolecules+with+orthogonal+physico-chemical+responsivity.">Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity.</a> U.S. Patent Application. , (2021).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li><li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration.">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart.">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity:+Microfluidic+fabrication+and+characterization.">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li><li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels.">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li><li>Claa&#223;en, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl:+best+practice+and+current+pitfalls.">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li><li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+converting+colloidal+systems+to+resuspendable/redispersable+powders+that+preserve+the+original+properties+of+the+colloids.">Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids.</a> U.S. Patent Application. , (2022).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular,+colloidal,+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions.">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li><li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules.">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li><li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels.">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li></ol>

Gelatin och dess derivat är de vanligaste proteinbaserade biomaterialen för HMP-tillverkning. Utmaningen med genomströmning kontra monodispersitetsavvägning av partikelstorlek kan övervinnas med hjälp av stegemulgerande mikrofluidiska enheter. Dessa enheter kan bilda mer än 40 miljoner droppar per timme, med en variationskoefficient mindre än 5%27. I den här artikeln diskuterade vi mikrofabrikation av droppar som innehåller GelMA-lösningar, följt av att konvertera dem till GelMA HMP, p...

Montering av HMP-byggstenar för att bilda vävnadstekniska byggnadsställningar har fått enorm uppmärksamhet under de senaste åren1. GHS, tillverkad via HMP-montering, har unika egenskaper jämfört med sina bulkmotsvarigheter, inklusive mikroporositet i cellskala som härrör från tomrummen bland de diskreta byggstenarna. Ytterligare egenskaper, såsom injicerbarhet, modularitet och frikopplad styvhet från porositet, gör GHS till en lovande plattform för att förbättra vävnadsreparation och regenerering2. Olika biomaterial har använts för GHS-tillverkning, inklusive syntetiska PEG-baserade polymerer3,4 och polysackarider, såsom alginat5 och hyaluronsyra 6,7. Bland naturligt framställda polymerer är den vanligaste proteinbaserade biopolymeren för GHS-tillverkning GelMA 8,9,10,11, ett tvärbindningsbart, biokompatibelt, bioadhesivt och biologiskt nedbrytbart biomaterial 12,13.
HMP kan tillverkas via batchemulgering8, flödesfokusering 14,15 eller stegemulgering9,11 mikrofluidiska anordningar, blandning 16, eller komplex koacervation17,18. Vanligtvis finns det en avvägning mellan tillverkningsgenomströmningen och HMP-monodispersiteten. Till exempel ger blandningstekniken oregelbundet formade och mycket polydispergerade HMP. Batchemulgering eller komplex koacervation möjliggör produktion av stora volymer polydispergerade sfäriska HMP. Flödesfokuserande mikrofluidiska enheter har använts för att tillverka mycket monodispersa droppar med en variationskoefficient på <5%, men genomströmningen är signifikant låg. I mikrofluidiska enheter med stegemulgering möjliggör de mycket parallelliserade stegen tillverkning med hög genomströmning av monodispergerade HMP19.
Metakrylmodifierat gelatin (GelMA) HMP-byggstenar är termoresponsiva och (foto)kemiskt tvärbindningsbara, vilket möjliggör enkel GHS-tillverkning20. Vid kylning under den övre kritiska lösningstemperaturen (UCST)21 (t.ex. vid 4 °C) omvandlas droppar som innehåller en GelMA-lösning till fysiskt tvärbundna HMP. Dessa HMP-byggstenar packas sedan med hjälp av externa krafter (t.ex. via centrifugering) för att ge fastnat mikrogelsuspensioner. Interpartikelbindningar upprättas mellan intilliggande HMP via (foto)kemisk tvärbindning för att bilda mekaniskt robust GHS14. En av de viktigaste egenskaperna hos GHS är mikroporositet, vilket möjliggör enkel cellpenetration in vitro11 och förbättrad vävnadsinväxt in vivo22. Tredimensionell (3D) bioprinting av HMP utförs konventionellt med tätt packade mikrogelsuspensioner, vilket äventyrar mikroporositeten23.
Vi har nyligen utvecklat en ny klass av granulära biobläck baserade på gränssnittsnanoengineering av GelMA-mikrogeler via adsorption av heterogent laddade nanopartiklar, följt av nanopartikelreversibel självmontering. Denna strategi gör löst packade mikrogeler skjuvavkastande och extrudering 3D bioprintbar, vilket bevarar mikroskala porositeten hos additivt tillverkade GHS11. Denna artikel presenterar metoderna för tillverkning av GelMA-droppar med hög genomströmning, omvandling av dessa droppar till fysiskt tvärbundna HMP, tillverkning av GelMA HMP med resuspenderbart pulver, GelMA GHS-bildning, GelMA nanoengineered granulärt biobläckpreparat (NGB) och 3D-bioprinting.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td>
			<td>Alfa Aesar, MA, USA</td>
			<td>B20156-18</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex, NY, USA</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>SANANTS</td>
			<td>30-002-25</td>
			<td>25 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td>
			<td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>NMR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5415 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Celltreat, MA ,USA</td>
			<td>229423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee filters</td>
			<td>BUNN, IL, USA</td>
			<td>20104.0006</td>
			<td>BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (12-14 kDa)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td>
			<td>08-667E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>56064C-10L</td>
			<td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>4980</td>
			<td>Corning PYREX&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>Koptec 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External thread cryogenic vials (cryovials)</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, MO, USA</td>
			<td>71042000</td>
			<td>Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>G1890-5100G</td>
			<td>Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>82027-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>FOUR E&#39;S SCIENTIFIC</td>
			<td>MI0102003</td>
			<td>5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 &#176;C/536 &#176;F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMPR 1000 negative photoresist series</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td>121619</td>
			<td>KMPR1025 and KMP1035 are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAPONITE XLG</td>
			<td>BYK USA Inc., CT, USA</td>
			<td>2344265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>900889-1G</td>
			<td>&#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok connector</td>
			<td>BD, NJ, USA</td>
			<td>BD 302995&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTeck, German</td>
			<td></td>
			<td>Nanofabrication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacylate anhydride</td>
			<td>Sigma, MA, USA</td>
			<td>276685-100ML</td>
			<td>contains 2,000&#160;ppm topanol A as inhibitor, 94%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td>Millipore Corporation, MA, USA</td>
			<td>ZRQSVR5WW</td>
			<td>electrical resistivity &#8776; 18 M&#937; at 25 &#176;C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500 engineering fluid</td>
			<td>3M, MN, USA</td>
			<td></td>
			<td>3M ID&#160;7100003723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>VWR-1410</td>
			<td>1410 Vacuum Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fischer scientific, MA, USA</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico-Surf</td>
			<td>Sphere Fluidics, UK</td>
			<td>C022</td>
			<td>(5% (w/w) in Novec 7500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>89079-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>87006-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner chamber</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>PDC-001-HP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning, MI, USA</td>
			<td>&#160;2065623</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td>
			<td>M100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>UniversityWafer, MA, USA</td>
			<td>452/1196</td>
			<td>4-inch mechanical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>231-0104</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8&#160;</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA, USA</td>
			<td>70-2001</td>
			<td>PHD 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Millipore Sigma, MA, USA</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubings</td>
			<td>Saint-globain, PA, USA</td>
			<td>AAD04103&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light&#160;</td>
			<td>QUANS</td>
			<td></td>
			<td>Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit</td>
			<td>VWR, PA, USA</td>
			<td>10040-460</td>
			<td>0.20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fischer scientific, USA</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>Mini Vortex Mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds: high-throughput microgel fabrication, lyophilization, chemical assembly, and 3d bioprinting

Framväxten av granulära hydrogelställningar (GHS), tillverkade via montering av hydrogelmikropartiklar (HMP), har möjliggjort mikroporös ställningsbildning in situ. Till skillnad från konventionella bulkhydrogeler underlättar sammankopplade porer i mikroskala i GHS nedbrytningsoberoende cellinfiltration samt överföring av syre, näringsämnen och cellulära biprodukter. Metaakryloylmodifierat gelatin (GelMA), en (foto) kemiskt tvärbindningsbar, proteinbaserad biopolymer innehållande celllim och biologiskt nedbrytbara delar, har i stor utsträckning använts som ett cellresponsivt / instruktivt biomaterial. Konvertering av bulk GelMA till GHS kan öppna en uppsjö av möjligheter för vävnadsteknik och regenerering. I den här artikeln demonstrerar vi procedurerna för GelMA-mikrogeltillverkning med hög kapacitet, omvandling till resuspenderbara torra mikrogeler (mikroaerogeler), GHS-bildning via kemisk montering av mikrogeler och granulär biobläcktillverkning för extruderingsbioprinting. Vi visar hur en sekventiell fysikalisk-kemisk behandling via kylning och fototvärbindning möjliggör bildandet av mekaniskt robust GHS. När ljus är otillgängligt (t.ex. under djup vävnadsinjektion) kan individuellt tvärbundna GelMA HMP monteras bioortogonalt via enzymatisk tvärbindning med användning av transglutaminaser. Slutligen demonstreras tredimensionell (3D) bioprinting av mikroporös GHS vid låg HMP-packningstäthet via gränssnittssjälvmontering av heterogent laddade nanopartiklar.

GelMA syntetiserades genom reaktion av gelatin med MA, som presenteras i figur 1A. Genom att skräddarsy reaktionsbetingelserna, såsom MA-koncentration, erhölls olika grader av MA-substitution. För att kvantifiera graden av MA-substitution bedömdes GelMA via 1H NMR-spektroskopi (figur 1B). Vinylfunktionella grupper med representativa toppar vid de kemiska skiften på ~ 5-6 ppm bekräftade den framgångsrika GelMA-syntesen från gelatin. R...

Watch this Scientific Journal Video about Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting at JoVE.com

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

Denna artikel beskriver protokoll för gelatinmetakrylylmikrogeltillverkning med hög genomströmning med hjälp av mikrofluidiska anordningar, omvandling av mikrogeler till resuspenderbart pulver (mikroaerogeler), kemisk sammansättning av mikrogeler för att bilda granulära hydrogelställningar och utveckling av granulära hydrogelbiobläck med bevarad mikroporositet för 3D-bioprinting.

Gelatinmetakryloylgranulära hydrogelställningar: Mikrogeltillverkning med hög genomströmning, frystorkning, kemisk montering och 3D-bioprinting

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

Extracellulära matris- eller ECM-numeriska hydrogelmikropartiklar kan användas som byggstenar för ställningstillverkning. Detta protokoll demonstrerar tillverkning, rening, lyofilisering, fotomontering och 3D-bioprinting av gelatinmetakryloyl eller GelMA-hydrogelmikropartiklar. GelMA är en fotokemiskt, tvärbindningsbar, proteinbaserad biopolymer innehållande celllim och biologiskt nedbrytbara delar som har använts i stor utsträckning som ett cellresponsivt och lärorikt biomaterial.I jämförelse med konventionell bulkhydrogel är GelMA granulära hydrogelställningar mikroporösa, vilket möjliggör snabb cellinfiltration som kan skräddarsys av byggstenens storlek. GelMA granulära hydrogelställningar kan öppna nya möjligheter för 3D-bioprinting av tjocka vävnader, organ och sjukdomar på billiga plattformar och regenerativ teknik. För att börja, tillsätt 10 milligram LAP till 10 ml DPBS för att förbereda en 0,1% fotoinitiatorlösning.Skydda lösningen från ljus genom att förpacka den med aluminiumfolie och märk den. Lös sedan upp den önskade mängden GelMA i fotoinitiatorlösningen. Placera den aluminiumfolieförpackade lösningen i ugnen på 37 grader Celsius i en timme för att få en klar lösning.För att förbereda oljefasen, gör en 2% biokompatibel ytaktiv lösning i konstruktionsvätskan. Sätt in Tygon-slangen i inloppen och utloppet på PDMS-enheten och sätt sedan in en 25-gauge trubbig nål i den andra änden av Tygon-slangen för inlopp. Placera enheten under mikroskopet och håll miljön varm vid cirka 40 grader Celsius med en hårtork eller en rymdvärmare.Fyll vatten- och oljelösningarna i separata sprutor anslutna till enheten. Starta sprutpumpen för oljefasen med en flödeshastighet på 160 mikroliter per minut. När oljan har fyllt kanalen, starta vattenfasen med 80 mikroliter per minut.Kontrollera droppbildningen under mikroskopet. Samla dropparna i en behållare och utvärdera dem i bildkammaren genom optisk mikroskopiavbildning. Håll dropparna vid fyra grader Celsius över natten medan du skyddar dem från ljus för att initiera GelMA mikrogels fysiska tvärbindning och omvandla dropparna till stabila mikrogeler.För att implementera den mikrokonstruerade emulsion-till-pulver-metoden, MEtoP, samla de fysiskt tvärbundna mikrogelerna i konstruktionsvätskan med hjälp av termiskt hållbara mikrocentrifugrör eller kryovialer. Försegla det öppna röret med en laboratorieduk och tejp. Frys de fysiskt tvärbundna mikrogelerna i flytande kväve i 10 minuter för att fortsätta med lyofilisering.Efter lyofilisering kommer ett fast pulver att erhållas. Tillsätt en milliliter kyld, 0,1% fotoinitiatorlösning vid fyra grader Celsius till det frystorkade pulvret för att göra mikrogelsuspensioner. Centrifugera den virvelformade blandningen vid 3 000 g i 15 sekunder.Efter kassering av supernatanten, överför den packade mikrogelsuspensionen till en form med en positiv förskjutningspipett och utsätt den för ljus vid 400 nanometer våglängd med en intensitet på 15 milliwatt per kvadratcentimeter i 60 sekunder för att bilda granulära hydrogelställningar eller GHS. För 400 mikroliter mikrogelsuspension, tillsätt en lika stor mängd iskall PFO-lösning, 20% i ingenjörsvätska till de fysiskt tvärbundna GelMA-mikrogelerna. Centrifugera sedan den virvlade blandningen vid 300 g i 15 sekunder och ta bort oljefasen från GelMA-mikrogelerna genom pipettering.Tillsätt sedan 400 mikroliter iskall, 0,1% fotoinitiatorlösning till mikrogelsuspensionen. Efter centrifugering av den virvlade lösningen vid 300 g i 15 sekunder, kassera oljan. Upprepa stegen för tillsats och centrifugering av fotoinitiatorlösning, men centrifugera vid 3 000 g den här gången och kassera supernatanten av packade GelMA-mikrogeler.Överför de packade GelMA-mikrogelerna till en form, följt av ljusexponering för att bilda GHS. Tillsätt 100 milligram nanotrombocytpulver till tre milliliter iskallt, ultrarent vatten för att bilda en 3,33% nanopartikeldispersion. Virvla dispersionen kraftigt inuti ett kylskåp med fyra grader Celsius i 15 minuter för att exfoliera de aggregerade nanopartiklarna.Korrekt exfolierade nanopartiklar ger en tydlig dispersion. Lös upp 50 mg LAP i fem milliliter iskallt, ultrarent vatten för att förbereda en 1% fotoinitiatorstamlösning. Tillsätt sedan 333 mikroliter 1% fotoinitiatorlösning till den exfolierade nanopartikeldispersionen och linda den i aluminiumfolie för att skydda mot omgivande ljus.Virvla blandningen i en minut för att blanda nanopartikeldispersionen och fotoinitiatorn. Tillsätt iskall PFO, 20% i ingenjörsvätska till de fysiskt tvärbundna GelMA-mikrogelerna vid ett volymförhållande mellan en och en. Efter centrifugering av den virvlade blandningen vid 300 g i 15 sekunder, kassera oljefasen som innehåller ytaktivt ämne.Tillsätt den iskalla, LAP-kompletterade nanopartikeldispersionen till de tvättade GelMA-mikrogelerna. Efter centrifugering vid 3 000 g i 15 sekunder, kassera den återstående oljan i botten och supernatantdispersionen. Förvara suspensionen vid fyra grader Celsius samtidigt som den skyddas från ljus med aluminiumfolie i en dag för att ge produkten GelMA nanoengineered granulat biobläck eller NGB.Följande dag, ladda NGB i en tre-milliliter spruta. Försegla den laddade sprutan med lock och parafilm och gör en pulscentrifugering vid 200 g för att ta bort den fångade luften. Överför biobläcket till en tre-milliliter patron med en hona-hona Luer lock-kontakt.Centrifugera patronen kort vid 200 g igen för att avlägsna den instängda luften och håll NGB vid fyra grader Celsius före användning. Därefter ladda den beredda murina fibroblastcellsuspensionen i en tre-milliliter spruta. Koppla ihop NGB och de cellladdade sprutorna med en kvinnlig-kvinnlig Luer-låskontakt och blanda innehållet försiktigt genom att trycka fram och tillbaka 40 gånger.Skriv ut NGB eller cellbelastad NGB med en korrekt bioprinter med ett vanligt koniskt munstycke genom att ladda munstycket i tre-milliliters skrivhuvudet. Håll tryckbäddstemperaturen under 10 grader Celsius och optimera parametrar som hastighet och mottryck. Välj önskad gcode- eller STL-fil.Välj sedan substratet och munstyckstypen för en pneumatisk tre-milliliter spruta utrustad med ett vanligt koniskt munstycke. Kalibrera bioprintern med hjälp av enhetens riktlinjer och börja skriva ut för att få 3D-strukturerna. MEtoP-tekniken gav resuspenderbart torkat mikrogelpulver genom frystorkning med lågt tryck samtidigt som mikrogeler skyddades från aggregering och allvarlig deformation.SEM-bilderna visade att de torkade GelMA-mikropartiklarna som använder denna teknik behåller sin sfäriska form efter lyofilisering jämfört med aggregeringen som observerats med konventionell lyofilisering. Mikroporkarakteriseringen av GelMA, GHS och NGB med ett fluorescensfärgämne med hög molekylvikt visade de sammankopplade tomrummen i mikroskala. Dessutom detekterade fluorescensbilden bedömd med hjälp av ett specialskrivet MATLAB-skript porerna.Mätningarna av hålrumsfraktion och medianporekvivalent diameter visade ingen signifikant skillnad, vilket intygade tillgängligheten och sammankopplingen av porer i mikroskala i de 3D-tryckta byggnadsställningarna med NGB. NGB-ställningarnas överlägsenhet gentemot tätt och löst packade GelMA-mikrogeler genom mätning av hängande filamentlängd avslöjade att NGB hade en större längd än de packade mikrogelerna. De löst packade mikrogelerna gav inte filament.En ihålig cylinder 3D-printades och hela konstruktionen utsattes för ljus för fototvärbindning. Den tryckta strukturen hölls fysiskt för att visa form, trohet och strukturell integritet. Om ställningen används för biologisk bedömning, till exempel vid cellbelastad bioprinting, kom ihåg att utföra alla steg under vissa förutsättningar, under det biologiska säkerhetsskåpet.Vi hoppas kunna avmarknadsföra användningen av granulära hydrogelställningar som en nyutvecklad biomaterialplattform inom biomedicin.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Byggnadsställningar för Articular kondrocyt kultur och brosk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstrukt användning av en vävnadsspecifik Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable alginat/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro modellsystem framkalla Cell sfäroid bildas

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D tryckta porösa cellulosa Nanocomposite Hydrogel ställningar

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoll för 3D Bioprinning av gelatin Methacryloyl hydrogel baserade Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Beredning och karakterisering av grafenbaserat 3D-biohybridhydrogelbiobläck för perifer neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Sammankopplade makroporösa 3D-ställningar från Microgel Stavar

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Syntes av stark adhesiv hydrogel, gelatin O-nitrosobensaldehyd

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

Agarosvätskegeler bildade genom skjuvbearbetning under gelering för suspenderad 3D-bioprinting

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...