Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

يشكر المؤلفون المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي التابع لمعهد هاك والمرفق الأساسي لعلم الأنسجة المرضي لمختبر تشخيص الحيوانات ، قسم العلوم البيطرية والطبية الحيوية ، جامعة ولاية بنسلفانيا ، على تقديم الدعم الفني في الوقت المناسب. تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الأمريكي لأبحاث السرطان (KSP) ، وكلية ولاية بنسلفانيا للعلوم الزراعية ، ومعهد ولاية بنسلفانيا للسرطان ، ومشروع USDA-NIFA 4771 ، ورقم الانضمام 00000005 إلى K.S.P. و R.F.P.

تمت الموافقة المسبقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في جامعة ولاية بنسلفانيا.
1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
<ol><li>تحضير الأمبيسلين المكمل (AP) LB لوحات أجار (لوحات معقمة 10 سم). للقيام بذلك ، قم بإذابة 10 غرام من مرق LB مع أجار في 400 مل من ا?...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

تقدم هذه الدراسات الموصوفة أعلاه أدلة داعمة على أن زرع الخلايا اللينية يمكن مقارنته بخلايا LSK في توليد 1 درجة من AML الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر البيانات الحالية أيضا أن حقن i.p. هو وسيلة فعالة ومريحة لإنشاء AML الفئران مقارنة بالحقن في الوريد (أو r.o).
بالإضافة إلى خلايا LSK ...

ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) هو نوع من الأورام الخبيثة الدموية من مسببات متنوعة مع سوء التشخيص1. يضع جيل النماذج الحيوانية AML الأساس لفهم الاختلافات المعقدة والبيولوجيا المرضية في محاولة لاكتشاف علاجات جديدة2. يتضمن تكوين اللوكيم في الفئران زرع خلايا مانحة تعبر عن البروتينات السرطانية الانصهارية ، بما في ذلك عمليات الاندماج التي تنطوي على جين سرطان الدم المختلط (MLL) للحث بقوة على AML ، لتقليد المرض في البشر3. تم الإبلاغ عن أصول خلوية مختلفة للخلايا المانحة في زرعAML 4 المرتبط بجين MLL ، مع معرفة القليل جدا عن الخلايا المسؤولة عن أصل المرض.
تم تطوير طرق متعددة للزرع في الفئران. بدلا من الحقن داخل الفخذ ، الذي يدخل مباشرة خلايا مانحة متحولة في نخاع العظم5 ، تم استخدام الحقن الوريدي الذي يستخدم الضفيرة الجيبية الوريدية والوريد الذيل والوريد الوداجي على نطاق واسع لتوليد نماذج AML الفئران6،7،8،9. في حالة الحقن خلف المداري (r.o) ، كانت العديد من العيوب المتأصلة ، مثل الحد من الحجم ، والطلب التقني المرتفع ، وفرص قليلة للمحاولات المتكررة أو الخطأ ، وإصابات العين المحتملة ، عقبات رئيسية مع بدائل محدودة أو معدومة7. يمكن أن يكون لحقن الوريد الذيل مشاكل مماثلة إلى جانب الإصابات المحلية. لتسهيل الإجراء ، غالبا ما تحتاج الفئران إلى التسخين لتوسيع عروق الذيل10. من الصعب أيضا تحديد موقع الوريد الذيل بدون مصدر ضوء إضافي ، خاصة في سلالة الفئران C57BL / 6. بالنسبة لحقن الوريد الوداجي ، يحتاج موظفو البحث إلى تدريب كاف لتحديد موقع الوريد والحد من المضاعفات المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء كل من حقن الجيوب الأنفية الوريدية والوريد الوداجي تحت التخدير ، مما يضيف مستوى آخر من التعقيد. وبالتالي ، من المغري استكشاف طرق جديدة للزرع لتسهيل إنشاء نماذج الفئران AML.
يستخدم الحقن داخل الصفاق (i.p.) بشكل شائع لإدارة الأدوية والأصباغ والتخدير11،12،13،14،15 ؛ كما تم استخدامه لإدخال الخلايا المكونة للدم لتكوين الدم خارج الرحم16 وزرع الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم في نماذج الفئرانالمختلفة 17،18،19،20،21. ومع ذلك ، فقد تم استخدامه بشكل غير متكرر لإنشاء الأورام الخبيثة المكونة للدم في الفئران ، وخاصة لدراسة تطور مرض AML.
تصف الدراسة الحالية جدوى حقن i.p. في توليد نماذج الفئران AML ، بالإضافة إلى مقارنة كفاءة زرع السكان سلبي النسب (Lin-) و Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) كخلايا مانحة. توفر هذه النتائج طريقة بسيطة وفعالة لإنشاء نماذج تجريبية من ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) وسرطان الدم النخاعي ذي الصلة. مثل هذه الطريقة لديها القدرة على زيادة فهمنا لآليات المرض وكذلك توفير نموذج سهل نسبيا لاختبار العلاجات التجريبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

هناك حاجة غير ملباة لعلاجات جديدة لعلاج ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) والانتكاس المرتبط به الذي يتضمن الخلايا الجذعية لسرطان الدم المستمر (LSCs). إن نموذج القوارض التجريبي ل AML لاختبار العلاجات القائمة على زرع هذه الخلايا بنجاح عن طريق الحقن المداري الخلفي في الفئران المتلقية محفوف بالتحديات. كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير طريقة سهلة وموثوقة ومتسقة لإنشاء نموذج فأر قوي من AML باستخدام طريق داخل الصفاق. في البروتوكول الحالي ، تم تحويل خلايا نخاع العظم مع فيروس قهقري يعبر عن البروتين الورمي الانصهاري البشري MLL-AF9. تم اختبار كفاءة مجموعات النسب السلبية (Lin-) و Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) كمانحين LSCs في تطوير AML الأولي ، وتم اعتماد الحقن داخل الصفاق كطريقة جديدة لتوليد AML. أجريت مقارنة بين الحقن داخل الصفاق والحقن خلف الحجاج في عمليات زرع متسلسلة لمقارنة وتباين الطريقتين. تم تحويل كل من خلايا Lin- و LSK مع فيروس MLL-AF9 البشري بشكل جيد في نخاع العظام والطحال من المتلقين ، مما أدى إلى ابيضاض الدم النقوي الحاد الكامل. أدى الحقن داخل الصفاق للخلايا المانحة إلى إنشاء AML في المتلقين عند الزرع التسلسلي ، وتم الكشف عن تسلل خلايا AML في الدم ونخاع العظام والطحال والكبد للمتلقين عن طريق قياس التدفق الخلوي و qPCR والتحليلات النسيجية. وبالتالي ، فإن الحقن داخل الصفاق هو وسيلة فعالة لتحريض AML باستخدام الزرع التسلسلي لخلايا اللوكيميا المانحة.

مقارنة كفاءة زرع خلايا AML الفئران باستخدام طرق زرع r.o. و i.p. في السابق ، تم الإبلاغ عن إنشاء 1 ° AML في الفئران المتلقية المزروعة بأثر رجعي مع خلايا LSK المنقولة MLL-AF9 ، وتم إثبات قابلية زرع خلايا AML 1 ° من خلال الزرع التسلسلي30. الدراسة الحالية هي الأولى التي تقيم إمكانية ا...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

هنا ، يتم استخدام الحقن داخل الصفاق لخلايا سرطان الدم لإنشاء ونشر سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) في الفئران. هذه الطريقة الجديدة فعالة في الزرع التسلسلي لخلايا AML ويمكن أن تكون بمثابة بديل لأولئك الذين قد يواجهون صعوبات وتناقضات مع الحقن في الوريد في الفئران.

زرع داخل الصفاق لتوليد سرطان الدم النخاعي الحاد في الفئران

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

هذا البروتوكول مهم لأن الخلايا سالبة الخط وخلايا SK المعزولة من نفس الفئران المانحة لم يكن لها فرق واضح في توليد AML الناجم عن MLL-AF9. أيضا ، يمكن لحقن IP لخلايا اللوكيميا تطوير نموذج ماوس من AML بنجاح. بالمقارنة مع طرق الزرع التقليدية ، فإن هذه التقنية أكثر ملاءمة وأقل تكلفة.للبدء ، قم بتعقيم أنثى الماوس C57BL / 6J CD45.1 البالغة من العمر 8 إلى 10 أسابيع باستخدام 70٪ من الإيثانول. ضع الماوس على وسادة جراحية معقمة على لوح الستايروفوم وقم بتثبيت الأرجل من خلال وسادات مخلب الماوس. قطع الجلد فوق تجويف البطن عند خط الوسط وتوسيع المساحة تحت الجلد نحو الساقين الخلفيتين بمقص معقم حاد.قم بتمديد الشق من خط الوسط البطني وصولا إلى الكاحلين وقم بتوسيع المساحة تحت الجلد أسفل الساقين الخلفيتين باستخدام شفرات المقص الحاد. قطع وتر العرقوب بمقص حاد. امسك الوتر باستخدام ملقط مع الأسنان واقطع الطرف الآخر المتصل بعظم الفخذ لإزالة عضلة الساق.قطع وتر عضلات الفخذ تعلق على الركبة مع مقص نهاية حادة. امسك الوتر واقطع رأس العضلة المتصل بعظم الفخذ لإزالة عضلة الساق. قطع العضلات الأخرى المحيطة بعظم الفخذ في النهاية متصلة بالساق.بعد ذلك ، قم بقص الكاحل بمقص حاد ، مع التأكد من بقاء الساق سليمة. امسك الطرف البعيد من عظم الفخذ واقطع مفصل الورك بمقص حاد ، مع التأكد من بقاء رأس الفخذ سليما. نقل القصبة وعظم الفخذ إلى مخزن مؤقت للتدفق في أنبوب سعة 15 ملليلتر.افصل بين الساق وعظم الفخذ عن طريق كسر الركبة باليد. قم بإزالة الرضفة والغضاريف واللقمات الفخذية لكشف هضبة الظنبوب وعظم الفخذ البعيد. قم بإزالة العضلات باستخدام شاش معقم ونقع العظام في مخزن مؤقت للتدفق.قطع عنق الفخذ وغسل خلايا نخاع العظم مع عازلة التدفق من طرفي عظم الفخذ باستخدام حقنة 10 ملليلتر مع إبرة قياس 23. بعد ذلك ، قم بقطع malleolus الظنبوبي وطرد خلايا نخاع العظم بمحلول تدفق من طرفي الظنبوب. قم بتفريق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر بإبرة قياس 18.أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية واحدة عند أربع درجات مئوية و 400 غرام لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء ، أو RBC ، محلول التحلل لتحلل كرات الدم الحمراء لمدة ثلاث دقائق. أضف خمسة ملليلتر من محلول التدفق لإيقاف التحلل.ثم أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق. ضع مصفاة خلية 70 ميكرون على أنبوب سعة 50 ملليلتر ومرر المعلق عبر المصفاة لجمع الخلايا. اضبط تركيز الخلية مع المخزن المؤقت للتدفق إلى واحد في 10 إلى ثمانية لكل مليلتر في أنابيب البولي بروبلين ذات القاع المستدير.حدد الخلايا سالبة النسب باستخدام مجموعة عزل الخلايا المكونة للدم في الماوس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالخلايا الجذعية المكونة للدم المصنفة والخلايا السلبية غير المصنفة وإعادة تعليقها في ثلاثة ملليلتر من 2X من السيتوكينات ، ووسائط IMDM ، وثلاثة ملليلتر من المادة الطافية الفيروسية في طبق مطلي بالاختزال الرجعي. احتضان الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطب بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 6 أو 24 ساعة.بعد التنبيغ ، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إذا لزم الأمر ، استخدم التربسين لجمع الخلايا المرتبطة بقاع الطبق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا.حقن الخلايا في الماوس المتلقي الأساسي بأثر رجعي أو داخل الصفاق باستخدام إبرة نصف قياس 27. مراقبة الماوس يوميا. بعد شهر واحد ، اجمع الدم أسبوعيا عن طريق النزيف خلف الحجاج لمراقبة زيادة عدد الكريات البيضاء عن طريق تقييم تعداد الدم الكامل على HEMAVET.دعامة العين بالإبهام والسبابة ، ثم اخترق الضفيرة الجيبية الوريدية بأنبوب شعري هيماتوكريت معقم من خلال الكانثوس الداخلي. اجمع 20 إلى 25 ميكرولترا من الدم في أنبوب جمع الدم EDTA وأغلق الجفون لوقف النزيف. ضع قطرة واحدة من محلول العيون كبريتات الجنتاميسين على العين.عندما تصل خلايا الدم البيضاء إلى أربعة في 10 إلى الخلايا الأربع لكل ميكرولتر ، قم بعزل خلايا نخاع العظم عن طريق غسل عظم الفخذ والساق بمحلول التدفق ، متبوعا بتحلل كرات الدم الحمراء كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، لحصاد الخلايا الطحالية ، ضع الماوس على وسادة جراحية معقمة على لوح الستايروفوم وقم بتثبيت الساقين من خلال منصات مخلب الفأر. تعقيم الماوس مع 70 ٪ من الإيثانول.قطع الجلد والعضلات في خط الوسط لفضح تجويف البطن بمقص معقم حاد. عزل الطحال ووضعه في مخزن مؤقت للتدفق في أنبوب 15 ملليلتر. قم بربط الطحال من خلال مصفاة 70 ميكرون في طبق ستة سنتيمترات مع ثلاثة ملليلتر من محلول التدفق.انقل الخلايا من الطبق إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر ، ثم قم بالطرد المركزي للتعليق أحادي الخلية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من محلول تحلل كرات الدم الحمراء لمدة ثلاث دقائق. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق لإيقاف التحلل والطرد المركزي لتعليق الخلية. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق ، واخلطها ومررها عبر مصفاة خلية 70 ميكرون لجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 ملليلتر.تحديد خلايا ابيضاض الدم النخاعي الحاد الأولي ، أو AML ، عن طريق تلطيخ خلايا الطحال وخلايا نخاع العظم باستخدام الجسم المضاد المترافق CD45.1 المضاد للفأر FITC والكشف عن مقياس التدفق الخلوي. يتم أولا بوابات الخلايا على FSC-A FSC-H و FSC-A SSC-A للحصول على مفردات. يتم إغلاق السكان الإيجابيين CD45.1 على مخطط FL1 من خلال مقارنته بالخلايا غير الملوثة.للزرع الثانوي ، أعد تعليق خلايا الطحال CD45.1 AML من المتلقين الأساسيين خلف الحجاج في PBS وحقنها بأثر رجعي في ذكر الفأر CD45.2. إن وجود زيادة عدد الكريات البيضاء الشاذة وزيادة تسلل خلايا اللوكيميا في نخاع العظم والطحال يدعم جدوى استخدام الخلايا السلبية لسلالة نخاع العظم لتوليد ابيضاض الدم النقوي الحاد الأولي. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في المتلقين الأساسيين المترجمين باستخدام LSK أو الخلايا السلبية النسب.تنتشر خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) في تجويف البطن للمتلقين الأساسيين عن طريق ابيضاض الدم المختلط أو الخلايا السلبية للنسب المنقولة MLL-AF9. أكدت هذه النتائج أيضا إنشاء AML الأولي عن طريق الحقن داخل الصفاق للخلايا السلبية لسلالة نخاع العظم المحول MLL-AF9 في شكل زيادة عدد الكريات البيضاء ووجود خلايا AML في نخاع العظام والطحال من الفئران المتلقية. ومع ذلك ، استغرقت عملية الزرع الأولية عن طريق الحقن داخل الصفاق وقتا أطول لتطوير ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) مقارنة بالحقن خلف الحجاج على الرغم من العدد المتساوي للخلايا المانحة.أظهر المتلقون الثانويون زيادة عدد الكريات البيضاء وتضخم الكبد والطحال الكبير في أقل من شهر واحد بعد الزرع. تم الكشف عن خلايا AML أيضا في الدم المحيطي ونخاع العظام والطحال ، وكذلك في التجويف البريتوني. حقق الحقن داخل الصفاق لثمانية في 10 إلى خلايا AML الخمس تطعيما مشابها للحقن المداري الخلفي من ثمانية في 10 إلى خمسة AML.أظهرت الفئران المتلقية من الدرجة الثالثة علامات ابيضاض الدم النقوي الحاد بما في ذلك زيادة عدد الكريات البيضاء وتضخم الكبد والطحال ، ووجود خلايا اللوكيميا في الدم ونخاع العظام والطحال ، وأظهرت الملاحظة النسيجية لعظم الفخذ والطحال تسلل خلايا اللوكيميا. بالمقارنة مع عمليات الزرع الثانوية والثالثية ، تقدمت عملية الزرع الثلاثية بشكل أسرع بكثير من عملية الزرع الثانوية. بالنسبة للنموذج الحالي ، فإن فرز خلايا LSK غير ضروري.يمكن تحويل الخلايا سالبة اللين بفيروس AML لمدة 6 ساعات أو 24 ساعة. لن يؤثر ذلك على كفاءة المؤسسة النموذجية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

بروتوكول مفصل للتميز الخط خلية الفئران C1498 ونموذج أسوشيتد اللوكيميا ماوس ل

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

إعداد الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية بالطرد المركزي الوترياتيون

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

غلوبيولين مناعي تحليل تسلسل الجين في اللوكيميا اللمفاوية المزمنة: من المواد المريض إلى تفسير التسلسل

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لتحديد الجينات المستهدفة NFAT2 الرواية في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

نهجين تدفق القياسات الخلوية من NKG2D ليغاند الكشف عن السطح لتمييز الخلايا الجذعية من الخلايا الفرعية السائبة في سرطان الدم النخاعي الحاد

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

زرع الورم لتقييم ديناميكيات الخلايا التائية CD8+ المتسللة للورم في الفئران

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد للسرطان الغدي المريئي العضوي: إيجابيات وسلبيات لهضم الخلية الواحدة

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...