Name: intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Forfatterne takker Huck Institute's Flow Cytometry Core Facility og Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Pennsylvania State University, for at yde rettidig teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA-projekt 4771, tiltrædelsesnummer 00000005 til KSP og RFP.

Alle eksperimenter blev forhåndsgodkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Pennsylvania State University.
1. Fremstilling af buffere og reagenser
<ol><li>Forbered ampicillin suppleret (AP) LB agar plader (sterile 10 cm plader). For at gøre dette opløses 10 g LB bouillon med agar i 400 ml destilleret vand, omrøres og bringes volumenet op til 500 ml. Steriliser opløsningen ved autoklavering, lad derefter opløsningen køle af, tilsæt 0,5 ml ampicillin (l...

<ol>
	<li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia.">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li><li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia.">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li><li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene.">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li><li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia:+learning+from+mouse+models.">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).</li><li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection.">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li><li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice:+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes.">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2001).</li><li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice.">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li><li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models.">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li><li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse.">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous,+subcutaneous+or+intraperitoneal+route.">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li><li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice.">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li><li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+transduction:+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse.">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li><li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+therapies+supplement:+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation.">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, 106-117 (2011).</li><li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis.">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).</li><li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms.">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li><li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis.">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).</li><li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs.">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7, 27 (2016).</li><li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model.">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (9), 2361 (2016).</li><li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells.">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li><li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells:+resting+stem+cells+or+mystery+population.">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li><li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model.">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).</li><li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+mice.">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neural+development+to+cognition:+unexpected+roles+for+chromatin.">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia.">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9:+gene+dosage+and+critical+target+cells.">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li><li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia.">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li></ol>

Disse ovenfor beskrevne undersøgelser giver understøttende bevis for, at transplantationen af Lin-celler er sammenlignelig med LSK-celler i dannelsen af 1° murine AML. Derudover viser de aktuelle data også, at ip-injektion er en effektiv og bekvem metode til at etablere murin AML sammenlignet med intravenøs (eller r.o.) injektion.
Ud over LSK-celler er andre populationer såsom granulocyt-monocytstamfader (GMP), almindelig lymfoid stamfader (CLP) og almindelig myeloid stamfader...

Akut myeloid leukæmi (AML) er en type hæmatologisk malignitet af forskellig ætiologi med dårlig prognose1. Genereringen af AML-dyremodeller lægger grundlaget for forståelsen af dens komplekse variationer og patobiologi i et forsøg på at opdage nye terapier2. Leukemogenese hos mus involverer transplantation af donorceller, der udtrykker fusionsoncoproteiner, herunder fusioner, der involverer genet for blandet afstamning leukæmi (MLL) for kraftigt at inducere AML for at efterligne sygdommen hos mennesker3. Forskellige cellulære oprindelser af donorceller er blevet rapporteret i transplantationen af MLL-genassocieret AML4, hvor meget lidt er kendt om de celler, der er ansvarlige for sygdommens oprindelse.
Der er udviklet flere ruter til transplantation i mus; I stedet for en intra-femoral injektion, som direkte introducerer mutante donorceller i knoglemarv5, er en intravenøs injektion, der udnytter venøs sinusplexus, halevene og jugularvene, blevet brugt i vid udstrækning til at generere murin AML-modeller 6,7,8,9. I tilfælde af retroorbital injektion (r.o.) har forskellige iboende ulemper, såsom volumenbegrænsning, høj teknisk efterspørgsel, få chancer for gentagne forsøg eller fejl og potentielle øjenskader, været store anstødssten med begrænsede eller ingen levedygtige alternativer7. Haleveneinjektion kan have lignende problemer udover lokale skader; For at lette proceduren skal mus ofte opvarmes for at udvide deres haleårer10. Det er også svært at lokalisere halevenen uden en ekstra lyskilde, især i C57BL/6-stammen hos mus. Til jugular veneinjektion kræver forskningspersonale tilstrækkelig uddannelse til at lokalisere venen og begrænse mulige komplikationer. Derudover skal både venøse sinus- og jugularveneinjektioner udføres under anæstesi, hvilket tilføjer et andet niveau af kompleksitet. Det er derfor fristende at udforske nye veje til transplantation for at lette etableringen af AML-murinmodeller.
Intra-peritoneal (i.p.) injektion er almindeligt anvendt til at administrere lægemidler, farvestoffer og anæstetika 11,12,13,14,15; Det er også blevet brugt til at introducere hæmatopoietiske celler til ektopisk hæmatopoiesis16 og til at transplantere knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller i forskellige musemodeller17,18,19,20,21. Det er dog sjældent blevet brugt til at etablere hæmatopoietiske maligniteter hos mus, især til at studere AML-sygdomsprogression.
Denne undersøgelse beskriver gennemførligheden af ip-injektion i genereringen af AML-musemodeller ud over at sammenligne transplantationseffektiviteten af afstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donorceller. Disse resultater giver en enkel og effektiv måde at generere eksperimentelle modeller af AML og relaterede myeloide leukæmier. En sådan metode har potentiale til at fremme vores forståelse af sygdomsmekanismerne samt give en relativt nem model til at teste eksperimentelle terapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>a-Select competent cells&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A-9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A0797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Low-Endotoxin Grade</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>Cat# C-861-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>Cat# 324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cat# S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin, bovine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# I-9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100&#215;) solution</td>
			<td>HyClone, Gelifesciences</td>
			<td>Cat# SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>NEOGEN</td>
			<td>Cat #: 7290A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# L-3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat# 130-124-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-324P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Interleukin-6 (IL-6)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>Cat# 300-348P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix-Eco (pECO) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular</td>
			<td>JT. Baker</td>
			<td>Cat# 2940-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>Cat # 105812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 558162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Pepro Tech, INC.</td>
			<td>Cat# 250-31L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>Cat# T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-293 Reagent</td>
			<td>MirusBio</td>
			<td>Cat# MIR 2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat # 15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Assays&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>Cat# 19856A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Cat# 4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>Cat# 95051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat#:12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14TdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 007914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments and Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe illustrator&#160;</td>
			<td>Version 25.2.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software program&#160;</td>
			<td>Version 1.5.7.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet 950FS&#160;</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7300 Real time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging</td>
			<td>G:Box Chemi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-peritoneal transplantation for generating acute myeloid leukemia in mice

Der er et udækket behov for nye behandlinger til behandling af akut myeloid leukæmi (AML) og det tilhørende tilbagefald, der involverer stamceller fra vedvarende leukæmi (LSC'er). En eksperimentel AML-gnavermodel til test af terapier baseret på vellykket transplantation af disse celler via retro-orbitale injektioner i modtagermus er fyldt med udfordringer. Formålet med dette studie var at udvikle en nem, pålidelig og konsistent metode til at generere en robust murinmodel af AML ved hjælp af en intra-peritoneal vej. I denne protokol blev knoglemarvsceller transduceret med et retrovirus, der udtrykte humant MLL-AF9-fusionsoncoprotein. Effektiviteten af afstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donor-LSC'er i udviklingen af primær AML blev testet, og intraperitoneal injektion blev vedtaget som en ny metode til at generere AML. Sammenligning mellem intra-peritoneale og retro-orbitale injektioner blev udført i serielle transplantationer for at sammenligne og kontrastere de to metoder. Både Lin- og LSK-celler transduceret med human MLL-AF9-virus indpodede godt i knoglemarven og milten hos modtagere, hvilket førte til en fuldblæst AML. Den intraperitoneale injektion af donorceller etablerede AML hos modtagere ved serietransplantation, og infiltrationen af AML-celler blev påvist i blod, knoglemarv, milt og lever hos modtagere ved flowcytometri, qPCR og histologiske analyser. Således er intra-peritoneal injektion en effektiv metode til AML-induktion ved hjælp af seriel transplantation af donorleukæmiske celler.

Sammenligning af transplantationseffektiviteten af murin AML-celler ved hjælp af r.o. og i.p. transplantationsveje Tidligere blev etablering af 1° AML rapporteret i recipientmus retro-orbitalt transplanteret med MLL-AF9-transducerede LSK-celler, og transplantationsevnen af 1° AML-celler blev påvist ved serietransplantation30. Denne undersøgelse er den første, der vurderer muligheden for at anvende knoglemarvsceller til transplantation. Tilstedeværelsen af afvi...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice at JoVE.com

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Her anvendes intraperitoneal injektion af leukæmiceller til at etablere og udbrede akut myeloid leukæmi (AML) hos mus. Denne nye metode er effektiv til serietransplantation af AML-celler og kan tjene som et alternativ for dem, der kan opleve vanskeligheder og uoverensstemmelser med intravenøs injektion hos mus.

Intra-peritoneal transplantation til generering af akut myeloid leukæmi hos mus

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Denne protokol er signifikant, fordi linnegative celler og SK-celler isoleret fra de samme donormus ikke havde nogen åbenbar forskel i dannelsen af MLL-AF9-induceret AML. IP-injektion af leukæmiske celler kan også med succes udvikle en musemodel af AML. Sammenlignet med konventionelle transplantationsmetoder er denne teknik mere praktisk og billigere.Til at begynde med steriliseres den 8 til 10 uger gamle CD45.1 kvindelige C57BL/6J-mus med 70% ethanol. Placer musen på en steril kirurgisk pude på et styrofoambræt og fastgør benene gennem musepotepuderne. Skær huden over bughulen ved midterlinjen og udvid det subkutane rum mod bagbenene med en steril saks i skarpe ender.Forlæng snittet fra den abdominale midterlinje ned til anklerne og udvid det subkutane rum under bagbenene med knivene på skarp saks. Klip akillessenen med en saks i den skarpe ende. Hold senen ved hjælp af tang med tænder og skær den anden ende, der er fastgjort til lårbenet for at fjerne gastrocnemius muskelen.Klip quadriceps senen fastgjort til knæet med skarp saks. Hold senen og skær muskelhovedet fastgjort til lårbenet for at fjerne gastrocnemius muskel. Skær de andre muskler omkring lårbenet i enden, der er fastgjort til skinnebenet.Skær derefter anklen med en skarp saks, og sørg for, at skinnebenet forbliver intakt. Hold den distale ende af lårbenet og klip hofteleddet med en saks med skarp ende, hvilket sikrer, at lårbenshovedet forbliver intakt. Overfør skinneben og lårben til en strømningsbuffer i et 15 ml rør.Adskil skinnebenet og lårbenet ved at bryde knæet med hånden. Fjern patella, brusk og lårbenskondyler for at udsætte tibialplateauet og det distale lårben. Fjern musklerne ved hjælp af sterilt gasbind og blød knoglerne i en strømningsbuffer.Skær lårbenshalsen og skyl knoglemarvscellerne med flowbuffer fra begge ender af lårbenet ved hjælp af en 10 ml sprøjte med en 23 gauge nål. Skær derefter tibial malleolus og skyl knoglemarvscellerne med flowbuffer fra begge ender af skinnebenet. Spred cellerne ved pipettering op og ned ved hjælp af en 10 ml sprøjte med en 18 gauge nål.Enkeltcellesuspensionen centrifugeres ved fire grader Celsius og 400 G i tre minutter. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i fem ml røde blodlegemer eller RBC, lysisbuffer for at lyse RBC'erne i tre minutter. Tilsæt fem ml flowbuffer for at stoppe lysis.Derefter centrifugeres cellesuspensionen og resuspenderes pelleten i fem ml flowbuffer. Placer en 70 mikron cellesil på et 50 ml rør og før suspensionen gennem silen for at opsamle cellerne. Juster cellekoncentrationen med flowbuffer til en gange 10 til otte pr. milliliter i rundbundede polypropylenrør.Vælg afstamningsnegative celler ved hjælp af et hæmatopoietisk celleisoleringssæt til mus i henhold til producentens anvisninger. Når det er gjort, centrifugeres de sorterede hæmatopoietiske stamceller og usorterede afstamningsnegative celler og resuspenderes i tre ml 2X cytokiner, IMDM-medier og tre milliliter viral supernatant i en retro-reduktantbelagt skål. Inkuber skålen i en befugtet 5% kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius i 6 eller 24 timer.Efter transduktion høstes cellerne ved centrifugering. Brug om nødvendigt trypsin til at samle cellerne, der er fastgjort til skålens bund. Supernatanten kasseres, og pelletpen opslæmmes igen i forvarmet PBS.Injicer celler i den primære modtagermus retro-orbitalt eller intraperitonealt med en 27 gauge halv nål. Overvåg musen dagligt. Efter en måned indsamles blod ugentligt ved retroorbital blødning for at overvåge leukocytose ved at evaluere det komplette blodtal på en HEMAVET.Proptose øjet med tommelfingeren og pegefingeren, og træng derefter ind i venøs sinusplexus med et sterilt hæmatokrit kapillarrør gennem det indre canthus. Saml 20 til 25 mikroliter blod i et EDTA-blodopsamlingsrør og luk øjenlågene for at stoppe blødningen. Påfør en dråbe gentamycinsulfat oftalmisk opløsning på øjet.Når de hvide blodlegemer når fire gange 10 til de fire celler pr. mikroliter, isoleres knoglemarvscellerne ved at skylle lårbenene og skinnebenet med flowbuffer efterfulgt af RBC-lyse som beskrevet tidligere. For at høste splenocytterne skal du placere musen på en steril kirurgisk pude på et styrofoambræt og fastgøre benene gennem musepotepuderne. Steriliser musen med 70% ethanol.Skær huden og musklerne ved midterlinjen for at udsætte bughulen med en steril saks i skarpe ender. Isoler milten og læg den i en strømningsbuffer i et 15 ml rør. Mesh milten gennem en 70 mikron sil i en seks centimeter skål med tre ml flowbuffer.Overfør cellerne fra skålen til et 15 ml rør, centrifuger derefter enkeltcellesuspensionen, kassér supernatanten, og resuspender pelleten i fem ml RBC-lysebuffer i tre minutter. Tilsæt fem ml flowbuffer for at stoppe lysen og centrifugere cellesuspensionen. Resuspender pellet i fem ml flowbuffer, bland og passér gennem en 70 mikron cellesil for at samle celler i et 50 ml rør.Identificer primære akutte myeloid leukæmi eller AML-celler ved at plette splenocytterne og knoglemarvscellerne med FITC-konjugeret CD45.1-antistof mod mus og detektere på et flowcytometer. Cellerne er først gated på FSC-A, FSC-H og FSC-A, SSC-A for at erhverve singlets. Den CD45.1-positive population er lukket på FL1-plottet ved at sammenligne den med ufarvede celler.Til sekundær transplantation resuspenderes CD45.1 AML-miltceller fra primære retroorbitale modtagere i PBS og injiceres retroorbitalt i CD45.2-hanmus. Tilstedeværelsen af afvigende leukocytose og øget infiltration af leukæmiske celler i knoglemarven og milten understøtter muligheden for at anvende knoglemarvsafstamningsnegative celler til at generere primær AML. Der blev ikke observeret signifikante forskelle i primære modtagere oversat med LSK eller afstamningsnegative celler.AML-cellerne spredes i bughulen hos primære modtagere af blandet afstamningsleukæmi eller MLL-AF9 transducerede afstamningsnegative celler. Disse resultater bekræftede også etableringen af primær AML via intraperitoneal injektion af MLL-AF9 transducerede knoglemarvsafstamningsnegative celler i form af leukocytose og tilstedeværelsen af AML-celler i knoglemarv og milt hos recipientmus. Primærtransplantation via intraperitoneal injektion tog imidlertid længere tid at udvikle AML end via retro-orbital injektion på trods af det samme antal donorceller.De sekundære modtagere viste leukocytose og signifikant hepatosplenomegali på mindre end en måned efter transplantation. AML-cellerne blev også påvist i perifert blod, knoglemarv og milt samt i bughulen. Den intraperitoneale injektion på otte gange 10 til de fem AML-celler opnåede sammenlignelig engraftment med retro-orbital injektion på otte gange 10 til de fem AML.De tertiære modtagermus udviste akut AML-tegn, herunder leukocytose og hepatosplenomegali, tilstedeværelsen af leukæmiske celler i blodet, knoglemarven og milten, histologisk observation af lårbenet og milten demonstrerede yderligere infiltrationen af leukæmiske celler. Sammenlignet med de sekundære og tertiære transplantationer skred den tertiære transplantation meget hurtigere frem end den sekundære transplantation. For den nuværende model er sortering af LSK-celler unødvendig.Linnegative celler kan transduceres med AML-virus i 6 timer eller 24 timer. Det påvirker ikke effektiviteten af modelvirksomheden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

En detaljeret protokol til karakterisering af murine C1498 Cell Line og dets associerede Leukæmi Mouse Model

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse af primære akut lymfoblastær leukæmiceller i forskellige cellecyklus faser af Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow flowcytometri for at vurdere leukæmi stamceller i primære akut Myeloid leukæmi og Patient-afledt-xenografts, på diagnose og følg op

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin-gen Sekvensanalyse i kronisk lymfatisk leukæmi: Fra Patient materiale til sekvens fortolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

En kromatin Immunoprecipitation analyse til at identificere nye NFAT2 Target gener i kronisk lymfatisk leukæmi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

To Flow cytometriske tilgange af NKG2D Ligand Surface Detection at skelne stamceller fra Bulk Subpopulations i akut myeloid leukæmi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumortransplantation til vurdering af dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler i mus

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subkultur og kryopræservering af esophageal adenocarcinom organoider: Fordele og ulemper ved enkeltcelle fordøjelse

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...